实训一 禽胚染色体标本制作与观察

一、实训目的

了解细胞有丝分裂各个时期染色体的形态特征，掌握显微镜的使用技术，为今后的学习奠定基础。

二、实训准备

1.材料。孵化4～5天的鸡胚或其他禽类的胚蛋

2.器械。照蛋器、注射器（1 mL）、尖镊子、橡皮胶布、手术剪、培养皿、离心机（800型）、离心管、水浴恒温器、载玻片（冰冷）、酒精灯、特种蜡笔等。

3.试剂。秋水仙素、0.85%NaCl、0.45%柠檬酸钠、吉姆萨染色液、卡诺氏固定液、0.25%胰酶、生理盐水等。

吉姆萨染色液含Giemsa lg、甘油（A、R）50 mL。取Giemsa粉末1g于研钵中，加入几滴甘油进行研磨至无颗粒，再将全部甘油倒入，放在50℃～60℃的保温箱中2小时，促使溶化，冷却后再加入甲醛，过滤即成母液。临用时取母液一份加入pH 7.4的PBS（磷酸缓冲液）中，摇匀即用。

PBS（磷酸缓冲液）由甲、乙液配制：

甲液：取KH2PO4 0.908 g，溶于重蒸馏水中至100 mL。

乙液：取Na2HPO4·12H2O3 8 g，溶于重蒸馏水中至100 mL。

取甲液18.2 mL、乙液81.8 mL，混合即成pH 7.4的PBS。

卡诺氏（Cornoy）固定液由甲醛3份与冰醋酸1份混合摇匀即成，临用前配制。

三、方法步骤

1.秋水仙素（碱）处理

通过照蛋器取出鸡胚部分，在尿囊部位避开大血管先用粗针头钻出一个小孔，然后注入秋水仙素，秋水仙素用量视其日龄而定，一般4~5日龄每只鸡胚可用20微克。

加秋水仙素后用橡皮胶布封口，继续培养2小时。

2.取材。注入秋水仙素后2小时，将胚蛋壳轻轻敲开，小心将胚胎取出，置于培养皿中。将胚胎去除眼球、四肢及尾部，用10 mL的生理盐水漂洗1次。漂洗后取出胚胎放在另一培养皿中，加1 ml生理盐水，加1～2滴胰酶，用剪刀尽量剪碎。

3. 低渗。将剪碎的材料用吸管移入离心管内，用已预热至39℃的0.45%柠檬酸钠液少量反复多次冲洗盛料器，并收集此液于同一离心管内至10 mL，然后吸打均匀，在39℃中温育低渗15～20分钟。

4. 固定。将已低渗完毕的材料在1000 r/min下离心10分钟，吸弃上清液，留下0.5 mL细胞液进行第一次固定。沿管壁缓慢加入卡诺氏液5 mL，静置5分钟后，用吸管小心将细胞团快翻动，静置10分钟，再用吸管轻轻吸打，使细胞分散，再静置15分钟。离心（1000 r/min，10分钟）后吸弃上清液，保留底液1 mL。然后进行第二次固定，即加入卡诺氏液5 mL，立即充分吸打成细胞悬液，静置固定30分钟以上，离心10分钟（1000r/min），吸弃上清液，留0.5 mL底液即制备成细胞悬浊液。

5. 铺片。在已预先冰冻的载玻片上滴1~2滴已制成的细胞悬液，吹散均匀，风干或烘干（微温）。

6.染色。倒卧法，用吉姆萨染色液染色30分钟，然后用自来水冲洗，风干或烘干。

7.镜检。先低倍观察，后高倍即油镜观察。

四、实训报告

1.在观察染色体标本时，应注意各对染色体的大小和外形特点。

2. 观察染色体的形态特征可用低倍镜，观察细胞分裂各个染色体的分裂象需在油境（90×或100×）下进行。