第六节 菌种保藏原理和方法
菌种保藏的目的在于延续菌种的优良性状，降低菌种老化速度，确保菌种纯、无变异。食用菌生产中，对于一些好的食用菌品种，人们常常会采取措施长期保藏一些品种，但往往由于缺乏一些基本的保藏经验，结果造成了菌种老化、培养基脱水、发生污染等现象，造成了生产中不必要的损失。
一、菌种保藏原理
菌种保藏的基本原理是给菌种生长营造一个使其生长代谢减缓又不会造成菌种死亡，使菌种在生长中能得到充足的营养却又不会造成营养缺失，使菌种在生长中能健康保存却又不会造成污染的环境。我们通常采用低温、冷冻、干燥或减少氧气供应等手段来降低保藏菌种的生理代谢强度，使菌种处于休眠状态。低温、冷冻可使菌种或孢子内部的生理代谢维持在一个很低的水平，极大减缓了机体内部的营养损耗和各种化学反应，从而达到长期保藏的目的；干燥可以降低环境周围湿度，使病原微生物缺乏繁殖的基础环境；减少氧气供应也可使菌种或孢子内部的生理代谢由于没有氧气的参与维持在一个很低的水平，极大减缓了机体内部的营养损耗和各种化学反应，从而可长期保藏菌种。
二、常用菌种保藏方法
（一）斜面低温菌种保藏法
该法是较为简便、实用的保藏方法之一。下面介绍这种方法的技术参数要点。
1.培养基选择
因为保藏的时间较生产种长，所以要用营养丰富的半合成培养基，如PDA培养基、麦芽糖琼脂培养基等，以防止菌种保藏过程中营养贫乏。
2.培养基成分特点
斜面低温保藏菌种中，为防止培养基内水分散失过快，琼脂用量应增至2.5%；并增加每管培养基的装量，不少于12mL。
斜面低温保藏菌种中，菌丝虽然代谢微弱，但仍在缓慢生长，这个过程中会产生有机酸而使菌丝处于酸性环境，不利生长又易引起污染，所以在培养基中再加入0.2%的K2HPO4和KH2PO4等缓冲剂。
3.具体操作要点
按以上培养基组成特点，常规制作母种培养基，之后无菌接种。用适宜温度培养到菌丝长满斜面。选择菌丝生长健壮的试管，先用高压聚丙烯塑料袋或硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好；也可以用无菌胶塞代替棉塞（图1-16），既能防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥。之后将试管放入4～5℃冰箱内保存，每隔3～4个月转管1次。
图1-16 斜面低温保藏的菌种
4.注意事项
保藏过程中一定要注意不要让冰箱内冷凝水打湿试管防护材料。对于草菇菌种不耐低温，保存温度应提高到10～15℃。发现培养基缺水、菌丝变色、老化等现象时，一定要及时转管。
（二）液体石蜡保藏法
该法利用了液体石蜡隔绝了菌种四周氧气，菌丝得不到充足氧气则其新陈代谢强度降低，细胞老化延缓；同时培养基水分蒸发变慢，由此达到延长菌种寿命的效果。下面介绍这种方法的技术参数要点。
1.培养基选择
因为保藏的时间较生产种长，所以要用营养丰富的培养基以防止菌种保藏过程中营养贫乏。
2.液体石蜡处理
使用前液体石蜡要用高压灭菌锅125℃灭菌0.5h，然后将其置40℃烘箱中，蒸发掉高压灭菌时渗入的水蒸气至完全透明为止。
3.具体操作要点
按保藏培养基要求，常规方法制作母种培养基，之后无菌接种。用适宜温度培养到菌丝长满斜面。之后在无菌环境下，用无菌吸管或注射器吸取经处理好的液体石蜡，垂直注入母种试管内，注入量以高出斜面顶端1cm为宜，塞上橡皮塞，再用石蜡密封（图1-17）。将试管竖放于试管架上，于干燥凉爽的低温处保藏，常可保藏1年以上。
图1-17 液体石蜡保藏的菌种
4.注意事项
保藏过程中一定要注意要注意避免发生火灾。在使用母种时，要注意将母种进行活化后使用。
（三）木屑块保藏法
该法利用了菌丝在木屑块中生长缓慢却又保藏效果较好的特点。该法适于保藏木腐菌的菌种。下面介绍这种方法的技术参数要点。
1.培养基选择
选取长2～2.5cm、粗0.5～1cm的小木段，置于1%有机肥水中浸泡6～8h。另取杂木屑78%、麸皮20%、糖及石膏粉各1%，加水拌匀，配成木屑培养基。
2.培养基制作要点
取20mm×200mm的试管，先装少量木屑培养基，放入一些木段，再用木屑培养基填满枝条与管壁的空隙，之后再放入一些木段，再用木屑培养基填满枝条与管壁的空隙。如此往复操作，最上一层为细木屑，并使木屑装量占试管长度的2/3。塞好棉塞，经125℃高压灭菌2.5h，冷凉后在无菌环境接入要保藏的菌种。
3.保藏操作要点
菌丝即将长满试管时，于无菌条件下取下棉塞，塞上灭过菌的橡皮塞，再用石蜡密封（图1-18）。4～5℃冰箱内常可保藏1年以上。
图1-18 木屑块保藏的菌种
还有很多关于菌种的保藏方法，如有条件的可以采取真空保藏法，或是干燥保藏法，或是低温、干燥、真空三者合一。
三、菌种防治退化措施
（一）菌种退化的原因
菌种退化的原因很复杂，有的是由于菌种传代次数过多造成，有的是由于环境条件的改变，有的是由于营养条件的变化，还有的是由于菌种内部遗传物质发生改变。
（二）防止菌种退化的措施
1.控制传代次数
母种的传代次数扩接应控制在3次以内，扩繁次数愈多，后代的生活力就愈衰退。原种和栽培种也应尽量减少传代次数。有的农户买上一支母种能扩6次，结果菌丝活力降低、产量一年不如一年，病害越来越多。
2.控制环境条件
食用菌菌种的代谢越活跃，则发生变异的概率越高，如食用菌生长周围环境温度高，菌丝代谢、繁殖旺盛，则发生变异的机会就大。
3.改善营养条件
很多食用菌菌种退化是由于营养条件的改变或缺乏而引起的。为了避免菌种生长中得不到充足营养，我们常用的方法是采用加富PDA来恢复菌丝活力，待菌种恢复良好性状后，再移植到普通PDA培养基上。
4.分离纯化菌种
长期单一使用食用菌也会引起菌种退化，我们常用的方法是每年从生产上表现优良性状的子实体进行组织分离、培养；或通过与野生品种杂交来提高其活力。