2.6　蛋白质的结构与功能

了解蛋白质的空间结构是理解蛋白质如何发挥其功能的重要依据。通常情况下，蛋白质分子通过与其他分子相互作用而发挥其功能。在生理条件下，蛋白质的构象具有柔性且动态变化，其构象变化与其他分子相互作用相关联，其他分子可以是分子氧、糖、蛋白质等，它们与蛋白质的结合是可逆的或不可逆的，可逆结合的分子被称为配体（ligand），一种蛋白质可以有一种或几种配体，蛋白质分子上结合配体的位点称为结合部位（binding site）。通常蛋白质结合位点的性质应该与配体互补，如结构的大小、形状、带电性以及疏水性等。蛋白质与配体结合会使蛋白质的构象发生变化，进而影响其功能。

2.6.1　肌红蛋白

肌红蛋白（myoglobin，Mb）是哺乳动物肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。潜水哺乳类如鲸、海豹和海豚的肌肉中肌红蛋白含量十分丰富，它们的肌肉呈棕红色，也使得它们能够长时间地潜在水里。

John Kendrew于1959年测定了抹香鲸肌红蛋白的晶体结构（图2.55）。肌红蛋白是由一条153个氨基酸残基组成的肽链和一个血红素（heme）辅基组成，分子质量是16700Da。除去血红素的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白（globin）。

肌红蛋白分子中多肽链由8段长短不等的α-螺旋组成，这8段螺旋习惯上命名为A～H，最长的含有23个氨基酸残基，最短的含有7个残基。螺旋区以外的无规则卷曲区肽链称为NA、AB……FG、GH、HC。分子中的每个氨基酸残基都有两个编号，一个是从N端开始总序列的编号，如第93位是His（表示为His93或His93）；另一个编号是在每个片段上的位置，如第93位His又为F8，即His在F螺旋上的第8位。

肌红蛋白分子中的8个螺旋片段分为两层，构成肌红蛋白的单结构域。肌红蛋白分子结构十分致密结实，分子内部只有一个能容纳4个水分子的空间。分子中有4个Pro残基分别在肽链的拐弯处，拐弯处还有因侧链的形状或体积不利于形成α-螺旋的Ser、Thr、Asn等残基。带有疏水侧链的氨基酸残基（如Val、Leu、Ile、Phe和Met）几乎被埋在分子内部，而分子外表面上分布的是带有亲水侧链的氨基酸残基，其亲水基团正好与水分子作用，使肌红蛋白成为可溶性蛋白质，一些介于亲水和疏水之间的残基（Pro、Thr、Ser、Ala、Gly和Tyr）在分子的内部和外表面都可以见到。

辅基血红素是由与亚铁离子（Ⅱ）配位的原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ）的四吡咯环系统组成（图2.56），处于肌红蛋白的疏水缝隙内。四个吡咯环通过相连，因此整个卟啉结构是不饱和的，具有高度共轭平面，另外还有4个甲基、2个乙烯基和2个丙酸基分别连接在4个吡咯环上。卟啉环中心的亚铁离子有6个配位键，其中4个与吡咯环的N原子相连，第5和第6配位键垂直于卟啉环平面，在环面两侧分别与珠蛋白的His93残基（近His）的咪唑（第5配位键）和O2或其他分子结合（第6配位键），并且氧又与珠蛋白的His64残基（远His）咪唑环紧密接触，形成一个空间位阻区域。

原卟啉Ⅸ属于卟啉类化合物，这类化合物在细胞色素、叶绿素以及其他一些天然色素中都有存在，具有较强的着色能力，肌红蛋白中的铁卟啉（血红素）使血液呈红色，叶绿蛋白中的镁卟啉（叶绿素）是植物显绿色的原因。

血红素中只有在Fe（Ⅱ）状态才能结合O2，如血红素暴露在氧气中，亚铁离子不可逆地变成三价铁离子，则失去了结合氧的能力。肌红蛋白和血红蛋白中的Fe（Ⅱ）被氧化成Fe（Ⅲ），形成高铁肌红蛋白（metmyoglobin）或高铁血红蛋白（methemoglobin），这是鲜肉放置一段时间后变成棕色的原因。

肌红蛋白的功能是结合氧并释放氧，结合氧的肌红蛋白称为氧合肌红蛋白，无氧的称为脱氧肌红蛋白。肌红蛋白（Mb）和配体O2的结合是一个可逆的过程，这个过程称为氧合作用，可以用一个平衡式来表示：

氧合肌红蛋白的解离常数K定义为：

肌红蛋白与O2的解离情况可以用饱和系数Y来表示，即氧结合部位结合氧的分数：

氧气的浓度[O2]可以用其分压表示，上式可以表达为：

肌红蛋白结合氧的情况可以通过氧合曲线看出（图2.57）。当氧的分压（）较低时，只有少量的氧与肌红蛋白结合（Y很小）；当氧的分压较高时，更多的氧与肌红蛋白结合；当很高时，几乎所有氧与肌红蛋白结合，此时肌红蛋白被氧饱和。当=K时，肌红蛋白与氧达到了半饱和状态，这样K就可以被认为是Y=0.5时的，定义为p50（肌红蛋白达到半饱和时的氧分压），实测值为2.8Torr。在生理范围内动脉血中为100Torr，静脉血为30Torr，肌红蛋白几乎被完全饱和。如=100Torr时，Y=0.97，因此肌红蛋白能有效地将氧气从毛细血管转移到肌肉细胞中。大多数情况下，肌红蛋白是高度氧合的，是氧的贮库。

氧合改变了Fe（Ⅱ）-血红素复合物的带电状态，使其颜色从暗红色（静脉血中血红素的颜色）变为亮红色（动脉血中的血红素颜色）。

除了O2外，CO、NO和H2S也能与血红素结合，它们的亲和力都比O2高，所以这些气体具有毒性，可引起人体中毒。游离的血红素与CO的结合力比与O2的结合力高20000倍，而肌红蛋白中的血红素与CO的结合力是与O2结合力的200倍。原因是当游离的血红素与O2结合时，形成的键有一定角度，而与CO形成的以直线形式结合。在肌红蛋白中，由于远His64存在形成的位阻排斥CO与血红素的直线形式结合，但不影响血红素对O2的结合，所以肌红蛋白中的血红素较游离血红素与CO的结合力降低很多。CO是生物体物质代谢的低水平副产物，因此这种结合能力具有一定的生理意义。

2.6.2　血红蛋白

血红蛋白（hemoglobin，Hb）是具有四级结构的蛋白质（图2.58），其主要功能是在血液中结合并运输氧。马的血红蛋白结构由蛋白质X射线晶体衍射之父Max Perutz经过20多年的研究确定，由此与肌红蛋白结构确定者John Kendrew分享了1962年的诺贝尔化学奖。哺乳动物不能依靠简单的扩散获得代谢所需要的氧，而是通过氧结合在血红蛋白分子上，由红细胞转运到循环系统的其他组织中。成熟的红细胞失去了核、线粒体及内质网等细胞器，但含有大约3亿个Hb分子，在人体内只能存活120天。

哺乳动物的血红蛋白是一个四聚体蛋白质，由4个亚基（α2β2）组成，αβ是二聚体，α与β之间的相互作用较α与α、β与β之间要强。血红蛋白的亚基（α-珠蛋白链和β-珠蛋白链）和肌红蛋白在氨基酸序列上具有明显的同源性，构象及功能也十分相似。血红蛋白的α链含有141个氨基酸残基，与肌红蛋白相比，有一个相对缩短的H螺旋区并缺失D螺旋；β链含有146个氨基酸残基，在C端H螺旋处有短缺。虽然α链、β链与肌红蛋白的三级结构非常相似，但是在氨基酸序列上却有很大差别。人的这3种多肽链只有27个位置上的氨基酸残基共有，比较多种不同血红蛋白中的氨基酸序列发现只有9个位置的残基共有，由此可以看出这些残基对血红蛋白分子的功能具有特别重要的意义。

血红蛋白的每个亚基都含有一个血红素辅基，与氧气的结合会改变整个血红蛋白四聚体的结构。血红蛋白有两个稳定状态的构象：脱氧血红蛋白构象为紧张态（T态，tensestate），氧合血红蛋白构象为松弛态（R态，relaxedstate）。这两种构象的血红蛋白都能与O2结合，但R态与氧的亲和力明显高于T态，结合氧后使R态更加稳定；而T态在缺氧情况下更加稳定。T态与氧结合导致血红蛋白构象发生变化，转变成R态，T态到R态过渡的基本特征是血红素周围的氨基酸残基侧链位置发生变化引起β亚基偶联得非常紧密。血红蛋白在动脉中与氧的饱和度可以达到96％，而在静脉中氧的饱和度只为64％，释放了大约1/3的氧。

血红蛋白和肌红蛋白都能结合氧，而且氧都是结合在血红素辅基上，但是血红蛋白有4个氧结合位点，适合运输氧，而肌红蛋白是单体，对较低的氧浓度变化不敏感，可以贮存氧并有利于氧在肌肉内扩散，增加氧气在肌肉中的溶解度，有利于氧从毛细血管向组织中扩散，因此氧结合血红蛋白的方式要比肌红蛋白复杂得多。图2.59所示氧合肌红蛋白曲线是双曲线形，而氧合血红蛋白曲线呈特征性的S形曲线，表明一个分子氧一旦与血红蛋白的一个亚基结合，便会促使其他三个亚基增加与氧的亲和力，第4个亚基的氧结合常数比第1个亚基的大几百倍。这是由于第1个亚基结合氧后引起血红蛋白分子的构象发生变化，促使其他亚基与氧结合。血红蛋白对氧的释放过程也同样，第1个氧释放可促使余下的氧更加容易释放。氧合曲线的起始部分斜率低，中间部分斜率增加。血红蛋白与氧结合的这种现象称为正协同性（positive cooperativity）。

血红蛋白可以在氧分压高时结合很多O2，在氧分压低时与氧具有较低的亲和力并可以释放氧，由R态到T态的构象转变很好地完成了生物体的生理需求。血红蛋白在氧分压为26Torr时达到半饱和（p50为26Torr），比肌红蛋白的p50（2.8Torr）高出约10倍，表明肌红蛋白对氧具有高度亲和性。肌红蛋白和血红蛋白的生理作用直接与它们在低氧压下对氧的相对亲和性有关，通常在高（如在肺部约100Torr）时，肌红蛋白和血红蛋白对氧的亲和性都很高，几乎都处于饱和状态。但当低于50Torr以下时，肌红蛋白对氧的亲和性明显高于血红蛋白对氧的亲和性，因此在肌肉等组织的毛细管内较低（20～40Torr）情况下，红细胞中的血红蛋白结合的很多氧被释放出来，释放出来的氧又与肌红蛋白结合。肌红蛋白和血红蛋白这种对氧亲和性的差异形成了一个有效地将氧从肺部转运到肌肉的氧转运系统（图2.60）。

配体与蛋白质中的一个结合位点作用，可以改变蛋白质的构象，从而影响其他位点与配体的结合，这类蛋白质称为别构蛋白（allosteric protein）。这种引起蛋白质分子构象变化而导致蛋白质活性改变的现象称为别构效应（allosteric effect）。血红蛋白的配体可以是分子氧，也可以是代谢的调控物（即效应物），如H+、CO2、2，3-二磷酸甘油酸（2，3-bisposphate glycerate，BPG）等，效应物可以是蛋白质的抑制剂，也可以是激活剂。血红蛋白结合和释放O2受到H+、CO2、2，3-二磷酸甘油酸等影响，这些物质在空间上与血红蛋白的结合部位虽然距离血红素辅基很远，结合于Hb活性部位以外的其他部位（别构部位），不直接涉及蛋白质活性，但是却对血红蛋白的氧合性质影响很大。

质子（H+）和CO2是有氧代谢产物，呼吸组织产生的CO2从组织扩散到毛细血管，在碳酸酐酶催化下，水化为碳酸，碳酸很容易解离成碳酸氢根离子和质子，在血中大多数的CO2以的形式被转运。

1904年丹麦生理学家Christian Bohr提出CO2能够降低血红蛋白对氧的亲和性。CO2浓度的增加及相应的pH降低，使得血红蛋白的p50升高，降低了血红蛋白对氧的亲和性，这一现象称为波尔效应（Bohr effect）（图2.61），它提高了氧转运系统的效率。在毛细血管中，CO2浓度较高，pH较低，有利于Hb释放O2，使组织获得氧的能力比单纯氧分压降低时多，而氧的释放又促进Hb与H+的结合，促进的生成，更有利于CO2的转运，消除组织呼吸形成的CO2所引起的pH降低的影响，起着缓冲血液pH作用。相反，在肺部，CO2水平较低，氧很容易与Hb结合，同时释放出质子和CO2，CO2的呼出又有利于氧合血红蛋白的生成。血红蛋白转运细胞所需的几乎全部氧外，还负责转运血中约50％的CO2，其中约10％通过肺释放。在肺部血红蛋白结合氧，运输到组织中，提供代谢所需要的氧，并且在组织中将代谢产物H+和CO2运输到肺和肾排出体外。HHb+表示血红蛋白质子化形式，血红蛋白的氧合平衡可以表示为：

O2和H+都可以与血红蛋白结合，但结合位点不同，H+可以与Hb有几种结合方式，如：①使β链的His146质子化，促使Hb转变为T态，释放氧；②使α链N端氨基酸残基质子化；③使其他位置的His残基质子化；④使其他基团质子化。另外，血红蛋白每个亚基的氨基端可以与CO2结合，形成氨甲酰血红蛋白，生成的H+产生波尔效应：

1921年Joseph Barcroft研究发现：高纯度的血红蛋白对氧的亲和性远比在全血中的血红蛋白对氧的亲和性大，推测血中除了CO2以外，还含有其他物质影响O2与血红蛋白的结合，这种物质就是D-2，3-二磷酸甘油酸（BPG）。BPG是糖代谢产物，现在所得到的S形血红蛋白氧合曲线都是在有BPG存在下获得的[图2.62（a）]。血红蛋白结合BPG会降低其对氧的亲和力，Hb和二者的结合是相互排斥的，血红蛋白氧合过程中BPG的影响可表示如下：

在红细胞中，BPG可以促使血红蛋白保持T态，从而降低血红蛋白对氧的亲和性。在低的（20～40Torr）下，没有BPG的血红蛋白不能将它结合的氧卸载给肌红蛋白。在等物质的量BPG存在下，20Torr时只有三分之一的血红蛋白被氧饱和，BPG的别构效应使得血红蛋白在组织氧分压低的情况下，将氧转移给肌红蛋白，所以BPG与脱氧血红蛋白结合紧密，而与氧合血红蛋白结合较弱。每个血红蛋白分子只与一分子BPG结合，BPG结合在T态血红蛋白的别构部位，即两个β亚基之间的空隙中[图2.62（b）]，腔内β亚基上带正电荷的氨基酸残基（如Lys82、His2、His143等）与BPG发生静电相互作用，使两个β亚基靠近，Hb与氧的亲和力降低。转变为R态时，Hb的两β亚基空隙变窄，BPG被挤出。

当人体缺氧（如处在高海拔）时，血红蛋白与氧结合减少大约1/4，但血液中的BPG浓度会增加，降低血红蛋白氧合的亲和力，促使血红蛋白释放氧，保证机体有氧代谢对氧的需要。在胎儿发育过程中，BPG调节血红蛋白的氧合作用，使得胎儿的Hb对氧亲和力高于母体，确保胎儿获得母体血液中的氧。胎儿的血红蛋白是α2γ2四聚体形式，它对BPG的亲和力要比成年人的低一些，而对氧的亲和力相对较高。

综上，血红蛋白与氧结合的S形曲线、波尔效应及BPG效应物使得血红蛋白输氧能力达到最高效率，并能够在一定的氧分压范围内完成转运氧的功能，保持机体内氧水平变化不会很大。此外，血红蛋白还保证了机体内有一个较稳定的pH环境。血红蛋白的别构效应充分反映了生物学适应性、结构与功能的高度统一性。

2.6.3　抗体

抗体（antibody）也被称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），是一类糖蛋白，也是血清中含量最丰富的蛋白质之一，由B淋巴细胞或B细胞产生，属于体液免疫系统（humoral immune system）。抗体是人类和脊椎动物在防御机制中阻止或消灭机体外部物质侵入而由免疫系统合成的物质。所有脊椎动物都有免疫系统，能够识别自身分子和外来分子，并能吞噬这些异物，因此免疫系统可抵御入侵的病毒、细菌、其他病原体以及对机体可能造成危害的分子。能够引起免疫反应的大分子或病原体称为抗原（antigen），如：蛋白质、核酸、多糖、病毒、细菌细胞壁等。抗体能够识别外来的抗原，一个抗原可以和许多抗体结合，每种抗体与抗原分子的特定部位结合，称为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位（epitope），抗原决定簇大多存在于抗原的表面，一个抗原可有多个决定簇。分子量小的分子不能诱导机体产生抗体，但它们与大分子结合后可诱导抗体产生，这类小分子物质被称为半抗原（hapten）。动物在遇到外源物质侵入时会产生大量的特异性抗体，这些抗体在机体内会保留很长时间，以至于以后再感染时抗体仍会与抗原反应，疫苗就是其中一例。

抗体具有两个主要特点：一是高度特异性，抗体只能与引起它产生的相应抗原发生作用。抗体与抗原特异结合形成抗体-抗原复合物，常不溶于水，从溶液中沉淀出来，通常称为免疫沉淀。体外的抗体-抗原沉淀反应已成为免疫学的研究基础。利用这一原理可检测动物之间的亲缘性，一个抗原的来源动物与接受该抗原的动物亲缘关系越远，产生抗体所需要的时间就越短，免疫反应越强烈。二是多样性，不同的抗原可以诱导产生不同的抗体，同一抗体可以和多种抗原反应。

抗体常用Ig表示，人的抗体可分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，许多脊椎动物中只存在IgG。IgG分子由四个亚基组成，两个相同的分子量约50000的亚基称为重链或H链（heavy chain），两个相同的分子量约为25000的亚基称为轻链或L链（light chain），这些亚基通过二硫键连接，呈Y形结构[图2.63（a）]。L链含有两个结构域，H链含有四个结构域，不同的IgG分子H链和L链的一级结构根据氨基酸序列的同源性可划分为可变区（variable domain，V区，轻链的可变区为VL，重链的可变区为VH）和恒定区（constant domain，C区，轻链的恒定区为CL，重链的恒定区为CH），糖结合在CH区[图2.63（b）]。重链上有3个恒定区，轻链有1个恒定区，恒定区的氨基酸序列对于所有抗体是相对恒定的，这可能是构成特有的免疫球蛋白结构域所必需的结果。抗体的N端结构域为V区，氨基酸的序列差异很大，负责抗体识别抗原，是与抗原特异结合部位。用木瓜蛋白酶水解抗体时，能产生一个可结晶的Fc片段（crystallizable fragment）和两个结合抗原的Fab片段（antigen-binding fragment）。

基于抗体与抗原之间的高度特异作用，抗体在生化分析和分离中得到广泛应用。

①多克隆抗体和单克隆抗体：多克隆抗体（polyclonal antibody）是多种不同的B淋巴细胞对一种抗原发生反应产生的抗体，是识别蛋白质不同部位的混合抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody）是单一B细胞群产生的同源抗体，具有高度均一性，只识别相同的抗原决定簇，特异性强。单克隆抗体技术由英国科学家Georges Köhler和Cesar Milstein于1975年发明，并获得1984年诺贝尔生理学或医学奖。

②酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是以待检测的抗原和酶标抗体的特异结合反应为基础，通过测定酶活力确定抗原的含量，可快速检测存在于样品中的少量抗原。样品中的蛋白质（抗原）被吸附在惰性物质表面（常用96孔聚苯乙烯板），用非特异性蛋白质（常用脱脂奶粉）封闭未结合样品的位置，以阻止之后加入的蛋白质（抗体）被表面吸附；加入抗原的特异性抗体（一抗）进行温育，使之与抗原结合；清洗掉没与抗原结合的一抗后，加入二抗-酶复合物进行温育，使之与一抗结合；添加酶底物，生成有色产物，产物的颜色深浅与样品中待测蛋白质的浓度成正比（图2.64）。ELISA具有操作简便、重复性和灵敏性高等特点，现已广泛应用于分子生物学、临床诊断以及食品安全等常规检测。

③免疫印迹法（immunoblot assay）也称Western印迹法（Western blotting），是将含有目的蛋白质的样品先经凝胶电泳分离，再将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜上，经过一抗、二抗-酶、底物处理薄膜（同ELISA），只有含目的蛋白质的条带才能显示出颜色，由此确定出目的蛋白质的位置和分子量。免疫印迹法能检测出样品中含有的微量成分。