第三节 登革热的实验室检测

一、登革病毒的分离培养

登革病毒血症可在发热前2～3天至初次感染开始后5天或再次感染后4天内检出，这段时间内患者的外周血、血清或血浆样本内都可分离出病毒。常用分离方法有敏感细胞培养分离、成年蚊虫胸腔接种分离和乳鼠脑内接种分离。

（一）蚊虫胸腔内接种

蚊虫胸腔内接种是敏感性最高的病毒分离方法。登革病毒四种血清型的病毒分离率在71.5%～84.2%之间。病程早期（前4天）的样本接种可获得更高的分离率，病程前4天样本接种后病毒分离率为85.3%,4天后分离率为65.4%。初次感染病人的病毒分离率（91.0%）高于再次感染者（77.6%）。

（二）乳鼠脑内接种

出生2～4天乳鼠脑内注射病人血清或血浆样本，每日观察，在死前取脑分离登革病毒。

（三）敏感细胞系培养分离

蚊虫和乳鼠脑内接种分离病毒对技术、安全性和可行性要求高，花费也高，故敏感细胞系培养分离更加常用。用于培养的敏感细胞常用蚊虫传代细胞系，如白纹伊蚊细胞C6/36、伪盾伊蚊AP-61、安波巨蚊Tra-284、CLA-1蚊虫细胞，或哺乳动物细胞LLC-MKZ、幼仓鼠肾细胞BHK21、Vero细胞、Vero-E6细胞。细胞培养分离法灵敏度只有约40.5%，且有少数毒株可能不引起细胞病变，此类病例不能通过细胞接种的方法检出。

除直接用于诊断外，病毒分离法还为体外实验如基因测序、病毒中和及感染实验提供病毒。病毒分离法诊断登革病毒的优点是可靠，适用于感染早期的疾病监测，缺点是需要时间较长，因此病毒分离法目前已极少用于临床诊断。

二、血清学检测方法

感染登革病毒后的急性期后期，血清学检测是较好的方法。登革病毒的常用血清学检测方法包括血凝抑制试验（hemagglutination inhibition, HI）、中和试验（neutralization test, NT）、间接免疫荧光抗体试验（indirect immunofluorescence assay, IFA）、IgM/IgG捕获ELISA法、补体结合试验、免疫斑点试验（dot immune-binding assay, DIBA）、免疫印迹和快速层析法。

（一）HI试验

此试验敏感性高，重复性好，操作简便，检出率高于病毒分离法，曾是登革病毒血清学检验的金标准。此法优点是试验所需试剂配置方便，可根据血清滴度不同判断初次感染或二次感染，HI滴度结果≥1∶2560，则为二次感染，若<1∶2560，则为初次感染。缺点是：（1）待检测的血清样本必须先经预处理以去除红细胞凝集的非特异性抑制剂；（2）准确的HI测试需要急性期和恢复期的血清样本，急性期和恢复期血清样本的滴度相差四倍或以上才能确诊近期感染；（3）此方法缺少特异性，不能区别登革病毒感染和其他相近种类的病毒感染，如乙型脑炎病毒、西尼罗河病毒，因此在其他黄热病毒也高发的地区使用受限。再加上易发生交叉反应并且不能区分登革病毒的血清型，现已逐渐被其他更加快速准确的方法所取代。

（二）空斑减少中和试验

空斑减少中和试验（plaque reduction neutralization, PRNT）可用于检测感染过登革病毒的患者的血清分型。基本方法是在不同稀释度的病人的血清中加入定量的病毒，接种到预先准备好的单层细胞培养数天，统计蚀斑数，计算该血清的蚀斑中和效价。最终滴定度是使蚀斑减少50%～90%的血清的最高稀释倍数。登革病毒初次感染者的血清能使蚀斑数减少90%。二次感染和抗体依赖性增强实验中，PRNT试验阳性反应中蚀斑减少50%～70%。PRNT是鉴别不同种类黄病毒的血清学检查金标准。传统PRNT法的缺点是耗时较长，需要活病毒，对操作人员技术要求高，且不能用于大量临床或流行病学样本的高通量分析。目前已有基于PRNT的改良法，运用伪病毒报告颗粒可有效检测登革病毒的四种血清型。

（三）IgM/IgG捕获ELISA法

此法的基本过程是以人抗IgM或IgG包被酶标板，病毒抗体、病毒抗原、二抗和酶按顺序相互结合孵育，最后用分光光度计检测显色程度代表不同滴度。鼠脑来源的病毒血凝素抗原或细胞来源的病毒抗原都可作为病毒抗原使用，两者的敏感性和特异性并无显著差异。目前IgM/IgG捕获ELISA法是判断初次感染和再次感染的常用指标。

目前市场上已有多种商品化ELISA试剂盒可用于登革病毒抗体检测，特异性和敏感性也很不错。ELISA法的优点是操作方便迅速，IgM-ELISA可检测出近期感染，IgM和IgG的吸光度比值可鉴别是初次还是二次感染。但ELISA法有两个缺点，一是血清中的风湿因子会影响登革病毒IgM的检测特异性，二是ELISA法用全部病毒抗原来检测登革特异性抗体，四个血清型之间易产生交叉反应。

（四）基于NS1抗原的检测方法

NS1抗原是登革病毒的一种非结构糖蛋白，在登革热发病早期的血清中就出现NS1蛋白，早于IgM抗体，因此检测NS1抗原可缩短登革热检测的窗口期。近年来研究发现，从登革热患者体温升高开始到临床期结束，均可在患者血清中检测出登革病毒NS1蛋白，甚至在检测不到RNA或有IgM存在的情况下，也能检测到NS1蛋白。NS1抗原检测已成为登革热实验室检测早期诊断的优选方法，国内外多个试剂厂家运用ELISA、免疫层析等方法生产试剂盒用于检测NS1抗原。另外还有研究表明可以运用不同血清型的NS1单抗用于登革热分型诊断。

三、分子生物学检测方法

与传统的病毒分离法相比，分子生物学检测方法敏感性更高、更快速。在近十几年来发展十分迅速，有良好的应用前景。

（一）环介导等温扩增法

LAMP（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种等温扩增方法，利用链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。LAMP的结果判断有多种方法，阳性产物电泳可见特殊的阶梯状条带，或者加入荧光染料观察荧光强度或者颜色改变判断是否为阳性反应，借助副产物焦磷酸镁沉淀离心后产生的白色沉淀，或者通过浊度仪实现定量。该方法适合基础条件较为薄弱的基层或者现场实验室，反应时间短，不需要特殊的仪器设备，肉眼可以观察结果，具有很强的实用性。LAMP技术目前在国内外得到了广泛的推广及应用，RT-LAMP法可用于登革病毒检测。

（二）依赖核酸序列的扩增技术

NASBA（Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA）是一种以RNA为模板进行等温核酸扩增的方法，可用于登革病毒扩增。此法借助逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和两对特异性引物实现。这种化学发光法，操作简便，灵敏度为98.5%，特异性为100%，可以检测样本中低于25空斑形成单位（plaque-forming unit, PFU）每毫升的登革病毒RNA，适合在登革爆发地区快速检测。

（三）转录介导的扩增方法

TMA（transcription mediated amplification, TMA）是目标序列单链RNA在逆转录酶作用下，以引物1为引导进行逆转录，形成RNA/DNA杂交双链分子，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，以引物2为引导合成双链DNA，由于在引物1上设计有T7启动子结合区，双链DNA在T7 RNA多聚酶作用下，转录出100～1000个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。TMA检测DENV RNA在RT-PCR检测阴性的急性期血清样本中有80%的检出率，在RT-PCR检测阳性的急性期血清样本中检出率达100%，即总检出率达89%。

（四）PCR法

Real Time-PCR（RT-PCR）是目前快速诊断登革病毒的最好方法之一，灵敏度在58.9%～100%，检测阈在0.1～3.0PFU/mL。RT-PCR的定量使用荧光色素实现，目前常用的有两种，即能与扩增DNA序列中特定寡核昔酸序列相结合的荧光探针如TaqMan探针和能在双链DNA中插入的特异荧光染料如SYBR green I。由于SYBR green I可结合到任何双链DNA上，包括引物二聚体和非特异性产物，影响目标产物的浓度检测，因此对引物要求较高。而TaqMan荧光探针杂交法只能在单管mRNA上使用，检测费用较贵。

RT-PCR引物来自登革病毒基因组的不同区域，可用于临床检测登革病毒及确定血清型。Lanciotti最早建立的两步法巢式RT-PCR中，两组与C/prM区对应的引物比较常用，包含用于第一轮扩增的外引物，以及鉴定4种血清型的特异性引物。经过两次PCR扩增，病毒基因组的信息量扩大，有助于提高检测的敏感性，方便检出病毒，同时还可鉴定具体的血清型以及分辨混合感染。

为降低样本交叉污染带来的假阳性，Harris等建立了一种单管复式RT-PCR法。此法的最低检测阈是DENV-1在1 PFU/mL, DENV-2是50PFU/mL, DENV-3是1PFU/mL, DENV-4是30PFU/mL。有研究证明一步法比两步法具有更高的检出率，值得在临床实验室推广。

目前RT-PCR法和其他方法联合应用诊断登革病毒越来越常见。如将一步法RT-PCR与单酶切-限制性片段长度多态性技术（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）相结合可以更快速有效地鉴定登革病毒分型。Vorndam首先报道了RT-PCR/RFLP技术可鉴别DENV的地理亚群，但需要扩增整个病毒基因组。经Gaunt和Gould改进后，RT-PCR/RFLP法可鉴别90%的已知E基因序列的黄病毒。2012年Ortiz等建立了一种新的一步法RT-PCR与单酶RFLP法结合，只需24小时就可鉴别DENV的四种血清型、黄热病毒、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎，且特异性>95%。

由于PCR反应的引物、酶、缓冲液、反应条件、病毒的基因组靶区域和PCR仪都可能影响PCR结果，而各地的条件都不相同，因此很难界定哪一种分子学检测方法更好，需要结合本地的实际条件加以应用。各种分子生物学检测方法的标准尚未统一，需要进一步研究摸索，相关的分子生物学检测试剂盒也正在开发。

（五）生物传感器

生物传感器是生物诊断设备，既可定性也可定量检测，有快速、灵敏、特异性高的优点，如果能研制出便于携带、自动化程度高的商业化要求的试剂盒，那生物传感器将会有很好的应用前景。登革病毒生物传感器在2000年开始出现，并不断改进。

人类的基因组DNA可能会影响病毒RNA的选择，因此生物样本的纯化和化学修饰十分重要。微流体设备（芯片实验室）和基于一次性芯片的技术可用于样本预处理，然而考虑到场地要求、设备要求和资金能力，这些设备可能不完全适用于快速检测试验的基本要求。当前大多数DENV生物传感器类型为压电晶体生物传感器、光生物传感器和电化学生物传感器。

压电式传感器中，两种不同的单克隆抗体固定在一个压电式传感器上，它们之间是一个免疫芯片，传感器可探测糖蛋白E和NS1蛋白，还有使用分子印迹聚合物来识别登革NS1蛋白的抗原决定部位。这样的设计规避了合成单抗的使用，可获得较好的灵敏度和特异性。最近，芯片技术发展为通过互补的寡核苷酸特异性杂交进行逆转录PCR，效果与Real-Time PCR相同。这项方法容易发生内源性和外源性互相干扰，因此对实验设备要求很高。

一种化学发光的光学纤维免疫传感器能与酶联免疫吸附法获得类似的DENV检测效果，并且灵敏度更高，或可用于无症状患者的检验。它的缺点是重复性差。其他利用光学途径的方法如磁珠、脂质体、报告探针等仍需要昂贵和复杂的分析仪器，复杂的数据处理或其他电子设备，花费多，设备不易携带，不易商业化。