第二节 微生物菌种选育的基本遗传操作

虽然很早以前，人们就有了种曲选育的观念，但直到近代人工诱变育种技术的建立，人类才开始真正改造微生物。此后，随着原生质体融合和重组DNA技术的应用，微生物育种技术迈入了真正意义的分子水平时代。

对微生物进行育种的首要条件：对微生物进行一定的遗传操作，创造遗传学上的变化，产生突变体。目前，产生突变体的方法有以下几种方法。

一、自发突变

自发突变指微生物在自然条件下受到紫外线及环境中其他致突因子的作用而产生突变的方法。这种方法简单易行，但发生自然突变的几率很低，一般为10－10~10－6，菌种选育效率很低，故很少应用于菌种选育。

二、人工诱变

人工诱变是用一定剂量的诱变因子，如NTG、60Co γ-射线、UV等处理微生物细胞，大幅度扩大基因突变频率，从而提高育种效率。人工诱变操作具有方法简便、快捷和收效显著等特点，在传统育种中广泛使用。1927年Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。之后人们发现其他一些因素也能诱发基因突变，并逐渐弄清了一些诱变发生的机理，为微生物诱变育种提供了前提条件。1941年Beadle和Tatum采用X射线和紫外线诱变红色面包霉，得到了各种代谢障碍的突变株。经过人工用诱变因子处理后，微生物细胞的突变频率大幅度提高，可达到10－6~10－3，比自发突变提高了上百倍。人工诱变过程中，诱变因子的种类、处理剂量、多种诱变因子复合处理、诱变后的处理条件、被处理微生物的生理状况（如，处理的是营养体细胞、休眠体芽孢、分生孢子还是除去细胞壁的原生质体）、细胞是单核还是多核以及菌种对诱变因子的敏感性等都对微生物的突变率具有显著的影响。

（一）诱变因子

诱变因子包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。

1．物理诱变因子

物理诱变因子包括紫外线、X射线、γ射线、激光、低能离子等。常用的电离辐射有X射线、γ射线、β射线和快中子等。其中对微生物诱变效果较好、应用的较为广泛的是紫外线、X射线和γ射线。

物理诱变因子可分为电离辐射和非电离辐射。其中X射线（波长为0.06~136nm）和γ射线（波长为0.006~1.4nm）是高能电磁波，能发射一定波长的射线，该射线在穿透物质的过程中能够把物质的分子或原子上的电子击出并产生正离子，属于电离辐射。当射线处理微生物细胞时，细胞首先接收辐射能量，穿过细胞壁、细胞膜，与DNA接触，主要引起DNA上的基因突变和染色体畸变。紫外线是一种波长短于紫色光的肉眼看不到的光线，波长为136~390nm，紫外线穿过物质时能使该物质分子或原子中的内层电子能级提高，但不会得到或失去电子，因而不产生离子，属于非电离辐射。紫外线照射微生物细胞，使得DNA链上的两个嘧啶碱基产生嘧啶二聚体，碱基不能正常配对，进而产生基因突变。

近年来，一些新型诱变剂被开发出来，并被证明有良好的效果。1996年，离子束诱变用于右旋糖酐产生菌，得到产量提高36.5%的突变株；1999年，N2激光辐照谷氨酸产生菌——钝齿棒状杆菌，谷氨酸产量和糖酸转化率比对照提高31%。低能离子注入育种技术是近些年发展起来的物理诱变技术。该技术不仅以较小的生理损伤而得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、成本低廉、对人体和环境无害等优点。目前利用离子注入进行微生物菌种选育时所选用的离子大多为气体单质离子，并且均为正离子，其中以N+为最多，也有报道使用其他离子的，如H+、Ar+、O6+以及C6+，辐射能量大多集中在低能量辐射区。

2．化学诱变因子

化学诱变剂是一类能与DNA起作用而改变其结构，并引起DNA变异的物质，它们与碱基接触发生化学反应，通过DNA的复制使子代细胞碱基发生改变而起到诱变作用。化学诱变剂往往具有专一性，它们对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影响，所造成的基因突变主要为碱基的改变，以转换为多数。其诱变效应和它们的理化性质有很大的关系，根据化学诱变剂的作用机理不同，可将其分为三类。第一类是碱基类似物，即天然嘧啶或嘌呤分子结构相似的物质，如5-BU,2-AP等。当将这类物质加入到微生物培养基中，微生物在繁殖的过程中就能将其掺入到微生物的DNA分子中，不影响DNA的复制。其诱变作用是取代核苷酸分子中的碱基，再通过DNA复制引起突变，又称为掺入诱变剂。第二类是碱基化学修饰剂，即能与碱基上的一个或多个基团发生化学反应，从而改变DNA的分子结构，引发突变，主要包括烷化剂如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等、脱氨剂如亚硝酸、羟化剂和金属盐类如氯化锂及硫酸锰等。其中，烷化剂是最有效，也是用得最广泛的化学诱变剂，其诱发的突变主要是GC~AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对缺失。这类诱变剂通常是配成一定浓度的母液与用缓冲液制备的单细胞悬液混合，在一定温度下处理一段时间，采用离心洗涤的方式除去药液。第三类是移码突变剂，如吖啶类化合物、EB等，它们插入DNA双链上的两个碱基之间，使DNA链拉长，两碱基间距离拉宽，造成碱基的插入或缺失，在DNA复制时造成突变点以后的所有碱基都向后或向前移动，引起全体三联体密码转录、翻译错误而突变，即移码突变。这类诱变剂的使用方法与碱基类似物的使用方法相近，均是混到培养基中，让微生物在繁殖过程中掺入到DNA分子中。化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎。

3．生物诱变因子

生物诱变是基于植物病原能够诱导其寄主形状产生可遗传的变异这一实验事实，并参照物理诱变、化学诱变而提出的一个新概念。在微生物遗传育种中，研究的较多的是Mu噬菌体，这是一类大肠杆菌的温和噬菌体，线型双链DNA分子，其DNA可以插入到宿主染色体的任何一个位点上，具有转座功能。当Mu噬菌体发生转座插入到宿主染色体上时，会引起突变，是典型的生物诱变剂。虽然在微生物、组织培养、质粒以及生物因子致癌等研究领域中常常涉及生物因子的致突变现象，如1962年Alikhanian观察到放线菌噬菌体的诱变效应，他们报告了利用噬菌体选育链霉素、红霉素和竹桃霉素的生产菌株；但相比于物理和化学诱变剂，生物诱变剂应用面比较窄，因此应用受到了限制。

（二）人工诱变育种的基本流程

人工诱变育种是指利用物理、化学等各种诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞，显著提高基因的随机突变频率，而后采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的优良突变株，以供科学实验或生产实践使用。在诱变育种过程中，诱变和筛选是两个主要环节，由于诱变是随机的，而筛选则是定向的，相比之下，筛选更为重要。其操作流程如图4-2所示。

1．诱变前的准备工作

（1）诱变前对出发菌株的了解

菌种选育的过程中，要不断进行移接、培养，如果不了解试验菌株培养过程中影响其生长代谢的主要因素，就有可能因干扰而造成漏筛或误筛。其中主要的影响因素有培养基的组成、移种的密度、培养的温度、湿度等。

（2）出发菌株的纯化

确定诱变菌株后，就要进行纯化，否则容易发生变异和染菌。通常可以采用常规的划线分离法和稀释分离法，若还达不到育种要求的，可采用显微镜操纵器分离单孢子，培养形成单菌落，获得完全真实的纯菌株。

（3）诱变剂的选择和诱变剂量的确定

诱变剂的选择和剂量主要取决于诱变剂对基因作用的特异性和出发菌株的特性。实践证明，并非所有的诱变剂对所有的出发菌株都有效。诱变剂量的选择是个复杂的问题，不单纯是剂量与变异率之间的关系，还涉及很多因素，如菌种的遗传特性、诱变史、诱变剂的种类及处理的环境条件等等，实验中要根据具体情况具体分析。

在育种工作中，常以杀菌率表示诱变剂的相对剂量。杀菌率的计算：取等量被处理菌体与未被处理菌体分别在完全培养基上培养，计数各自长出的菌落。各类诱变剂的剂量表达方式有所不同，如UV的剂量指强度与作用时间之乘积；化学诱变剂的剂量则以在一定外界条件下，用诱变剂的浓度与处理时间的乘积来表示。在实际工作中，诱变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定程度后，再增加剂量，诱变率反而下降。据有关研究结果表明，正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多出现于偏高剂量中。因此，目前在产量变异工作中，大多倾向于采用较低剂量。例如，以UV为诱变剂时，以前采用杀菌率为90%~99.9%的剂量，近来倾向于采用杀菌率为70%~80%，甚至30%~70%的剂量。特别是对经过多次诱变的高产菌株，因容易出现负突变，更应采用低剂量处理。一般认为，经长期诱变后的高产菌株，以采用低剂量为宜；对于遗传性状不太稳定的菌株，也应采用较温和的诱变剂和较低剂量处理；对于诱变史短的低产菌株，则可采用高剂量处理。实际诱变过程中如何控制剂量大小，物理诱变剂和化学诱变剂不太一样。物理诱变剂通过控制照射的距离、时间和照射过程中的条件（氧、水等）；化学诱变剂主要通过调节浓度、处理时间和处理条件（温度、pH等）。

2．诱变操作过程

（1）出发菌株的预培养。对出发菌株进行预培养，一般采用营养丰富的培养基，可在其中添加一些咖啡因、吖啶黄、嘌呤等物质，提高其突变率。

（2）单孢子（或单细胞）悬液的制备。在诱变育种中，所处理的细胞必须是处于均匀的悬液状态的单细胞，这样既可保证细胞均匀地接触诱变剂，又可保证生长出纯菌株。用单细胞微生物制备菌悬液时，一般选用经过前培养，必须要达到生理活性方面同步的最旺盛的对数生长期，通过离心洗涤，去除培养基，用无菌的生理盐水或缓冲液制备菌悬液，通过菌体计数，调整菌悬液浓度(106~108个/mL)供诱变处理。

对产孢子的微生物进行诱变时，采用成熟而且新鲜的孢子，置于液体培养基中震荡培养到孢子刚刚萌发，离心洗涤，加入无菌的生理盐水或缓冲液震荡分散，用无菌脱脂棉过滤，通过血细胞计数法进行孢子计数，调整孢子浓度(106~107个/mL)，供诱变处理。

（3）诱变处理。诱变剂的处理方法可分为单因子处理和复合因子处理。其中单因子处理就是采用单一诱变剂处理；复合因子处理就是采用两种以上的诱变因子共同诱发菌体突变。一般认为复合因子处理的效果要好于单因子处理，因为多因子复合处理可以取长补短，以弥补某种不亲和性和热点饱和现象，更容易得到多突变类型。

复合诱变是指两种或多种诱变剂的先后使用、同一种诱变剂的重复作用、两种或多种诱变剂的同时使用等诱变方法。某一菌株长期使用诱变剂之后，除产生诱变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等，这对生产不利，在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。普遍认为，复合诱变具有协同效应，如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用，复合诱变较单一诱变效果好。

（4）诱变后培养。诱变后的菌悬液一般不直接分离于平板，而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代，保证诱变发生的突变能够通过DNA的复制而形成稳定的突变体。

（5）筛选。菌种诱变处理后，经过后培养，涂布在琼脂平板上，由一个突变的单细胞或孢子发育成单菌落，突变的类型很多，归纳起来有两大类：第一类为形态突变株，另一类为生化突变株。这些突变株都混杂在诱变后处理的微生物中，根据筛选的目的将其分离筛选出来。

（三）突变株的筛选方法

1．设计高效筛选方案

在微生物群体细胞经诱变处理产生的突变个体中，绝大多数属于负变株，只有极少数是正变株。既要从大量的变异株中挑选产量较高的正变株，又要花最少的工作量，则必须设计简便、高效的科学筛选方案。筛选方案最好做到不仅可提高筛选效率，还可使某些眼前产量虽不高，但有发展后劲的潜在优良菌株不致被淘汰。根据实际工作经验，常将筛选工作分为初筛与复筛两步进行。初筛以量为主，准确性要求不一定高，只要定性测定即可，以尽可能选留较多有生产潜力的菌株。复筛以质为主，通过初筛比较，精确测定少量潜力大的菌株的代谢产物量，从中选出最好的菌株。

2．创造新型筛选方法

对产量突变株生产性能的测定方法一般也分成初筛和复筛两个阶段。初筛以粗测为主，可在琼脂平板上或摇瓶培养后测定。平板法的优点是快速、简便、直观，缺点是平板上固态培养的结果并不一定反映摇瓶或发酵罐中液体培养的结果。当然，也有十分吻合的例子。如用圆的厚滤纸片（吸入液体培养基）法筛选柠檬酸产生菌宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的效果很好。复筛以精测为主，常采用摇瓶培养方法或台式自控发酵罐进行放大试验，在接近生产条件的情况下进行生产性能的精确测定。

（1）抗药性突变株的筛选

抗药性基因是遗传研究和育种工作重要的选择性遗传标记，同时，有些抗药菌株还是重要的生产菌种。梯度平板法是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板，在其上涂布诱变处理后的细胞悬液，经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。在筛选抗代谢药物的抗性菌株以取得相应代谢物的高产菌株方面，此法能达到定向培育的效果。

（2）营养缺陷型突变株的筛选

营养缺陷型突变株既可作为杂交（包括半知菌的准性杂交、细菌的接合和各种细胞的融合等）、转化、转导、转座等遗传重组的基因标记菌种，又可作为氨基酸、维生素或碱基等物质的生物测定试验菌种；此外，利用该突变株还可了解生物体内合成氨基酸和核苷酸等物质的代谢途径，该突变株还可直接作为发酵生产氨基酸、核苷酸等有益代谢产物的生产菌种。

筛选营养缺陷型突变株的三类培养基如下。

①基本培养基(MM)：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低营养成分的组合培养基，称基本培养基。不同微生物所用的基本培养基是不相同的，有的成分极为简单，有的却很复杂，不能误认为凡是基本培养基的成分均是简单的，尤其是不含生长因子的培养基。

②完全培养基(CM)：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称完全培养基。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基类的天然物质（如蛋白胨、酵母膏等）配制而成。

③补充培养基(SM)：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的合成或半合成培养基，称补充培养基。它是在基本培养基中再添加某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢物或生长因子所制成，因此可专门选择相应的营养缺陷型突变株。

三、杂交育种

杂交育种是利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式而导致其菌株间的基因的重组，把亲代的优良性状集中在后代中的一种育种技术。杂交育种的理论基础是基因重组。由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，所以不论是方向性还是自觉性，均比诱变育种前进了一大步。下面以原生质体融合技术为例讲述杂交育种的基本操作过程。

原生质体融合(protoplast fusion)亦称细胞融合(cell fusion)，是指细胞外层的细胞壁被酶解脱壁形成原生质体后，在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，通过膜融合、胞质融合、核融合，接着基因组之间发生接触、交换，进而发生基因组的遗传重组，最后在适宜的条件下再生出细菌细胞壁、获得重组子的过程。1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量，从而开创了原生质体融合技术在微生物育种实际工作中的应用。

相较于常规杂交技术，原生质体融合可以大幅度提高亲本之间重组频率，扩大重组的亲本范围；具有许多常规杂交方法无法比拟的独到优点：(1)克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。(2)基因重组频率高，重组类型多。(3)可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。(4)存在着两个以上亲株同时参与的融合，可形成多种性状的融合子。此外，同基因工程方法相比，这一技术不需对试验菌株进行详细的遗传学研究，避免了分离提纯、剪切、拼接等基因操作，也不需高精尖的仪器设备和昂贵的材料费用。随着生物学研究手段的不断创新，原生质体融合技术的基本实验方法逐步完善，经过多年的实际应用证明，微生物原生质体融合是一项十分有用的育种技术。因此，原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现属间、门间，甚至跨界融合。原生质体融合的基本操作如下。

（一）制备原生质体

原生质体是指去掉细胞壁的球状体，其制备过程本质上是一个溶菌酶对细胞壁酶解的生化过程。因此，细菌细胞的破壁显得尤为重要。当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法，在实际工作中，最常用和最有效的是酶法，该法时间短，效果好。酶法中具体使用哪一种酶要根据所研究的特定微生物而定。在放线菌和细菌原生质体制备中，主要使用溶菌酶；而酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等；也有研究表明，使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好。

（二）原生质体的融合

融合就是把亲株的原生质体在高渗条件下进行混合。在原生质体融合中，诱导融合的方法主要有化学法（PEG促融法）、物理法（包括电融合和激光诱导融合法等）。

1．聚乙二醇(PEG)促融法

PEG分子具有负极性，可与正极性的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，从而在原生质体间形成分子桥，使原生质体发生黏连而促使原生质体的融合。该法的优点是不需要特别的仪器设备，操作简便；缺点是PEG是化学试剂，对原生质体具有一定的毒性，可能影响原生质体的再生。自1974年Kao发现PEG在适量Ca2+存在下能有效地诱导植物原生质体融合后，PEG也很快被用于微生物细胞的原生质体融合。

2．电融合法

在短时间强电场的作用下，当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体，使原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串，原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。该法的优点是融合频率高，无化学毒性，操作简便，可在显微镜下观察融合全过程。

3．激光融合法

激光诱导融合技术的原理是：先让细胞或原生质体紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激光照射接触处，从而使质膜击穿或产生微米级的微孔，质膜上产生微孔是一个可逆的过程，质膜恢复的过程中细胞连接微孔的表面曲率很高，使细胞处于高张力状态，此时细胞由哑铃形逐渐变为圆球状，进而细胞发生融合。该法的优点是毒性小，损伤小，具高度选择性；缺点是操作技术难度大，所需设备昂贵复杂。

（三）原生质体再生

原生质体的再生是指酶解去壁后得到的原生质体通过重建细胞壁，恢复细胞的完整形态且能够生长、分裂，这是融合育种的必需条件。原生质体的再生往往受原生质体化的因素的影响，因此在进行融合之前，应探讨原生质体形成和再生的最适条件。

（四）融合子筛选

在对A和B两种细胞的融合中，可能会形成AA、AB及BB三种融合形式。而我们要筛选出的是AB，因此融合子的筛选是融合过程中的关键。其中有下列几种筛选方法。

1．营养缺陷型标记筛选融合子

即融合双亲为不同的营养缺陷型（单缺或双缺），双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基进行培养，由于双亲遗传缺陷而丧失了合成某种物质的能力，在基本培养基上不能生长，只有营养缺陷得到互补后的融合子才能恢复生长，用这种方法即可检出融合子。如，以大肠埃希菌W4183(Arg-)和Fu20-1(Leu-)为亲本进行原生质体融合，在不加Arg、Leu的培养基上筛选出融合子。该法的优点是准确可靠。在排除污染的情况下，在基本培养基上长出的菌落即可初步判为融合子；缺点是会发生部分融合子遗漏、耗时、工作量大，而且可能会造成有害突变的出现。

2．抗药性标记筛选融合子

不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种差异或与菌种其他特性结合起来则可进行融合子的选择。Brodshaw等在很早以前就利用对真菌抑制剂有抗性的营养缺陷型菌株和对真菌抑制剂敏感的野生型进行原生质体融合，使融合子能在含有真菌抑制剂的基本培养基上生长。该法的优点是可以避免营养缺陷型标记的一些不足；缺点是抗药性的获得需要耗费一定的时间，同时，还需掌握好选择性培养基中药物的浓度。

3．荧光色素标记筛选融合子

在酶解制备原生质体时向酶解液中加入荧光色素，使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素，在一定的波长下呈现出不同的颜色，原生质体融合后，在荧光显微镜下通过观察及显微操作，即可直接选出带有两色荧光的融合子。龙建友等将经酚藏花红荧光染色标记的链霉素No.24菌株的原生质体与其诱变株Ms-24的原生质体经伊文思蓝荧光染色标记后进行融合，在荧光显微镜下筛选出同时带有红蓝荧光的高产秦岭霉素的融合子。该法的优点是能较好地保持双亲的优良性状；缺点是在显微镜下用显微操作器进行融合子的分离，因此难以获得大量的融合子。

4．灭活原生质体标记筛选融合子

该技术的原理：在原生质体融合之前，对单亲或双亲原生质体进行灭活，使其丧失再生的能力，当两亲株融合后，其致死损伤得到互补，便可获得能够存活的融合子。在此系统中，灭活的原生质体实际上起了遗传物质的载体作用。骆健美等将两株高产褐黄孢链霉菌SG-2002-1和SG-2002-2的原生质体分别经紫外灭活和热灭活后融合，获得能生长繁殖的融合子。该法的突出优点是不需要人为标记，从而大大减少了融合前对亲株进行遗传标记的工作量。

（五）原生质融合技术在微生物育种上的应用

1．通过融合杂交综合双亲优良性状，优化菌种

通过原生质体融合技术使2个菌株的遗传物质得到重组，从而获得兼具两个亲本优良性状的新菌株。Choi等将无絮凝性、乙醇产量高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CHY 1011)与有絮凝性、乙醇产量低的酿酒酵母(Saccharomyces bayanus KCCM12633)进行原生质体融合，获得的融合株CHFY 0321兼具了亲株KCCM 12633的絮凝性及亲株CHY1011高产乙醇的特性。张莉滟和张德纯将兼性厌氧菌保加利亚乳杆菌热灭活的原生质体作为遗传物质供体，采用电融合方法，诱导其原生质体与双歧杆菌融合，将其耐氧基因随机整合到长双歧杆菌中，提高其耐氧能力。黎永学等将双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合，初筛出具有双歧杆菌和酿酒酵母生物学特性、较稳定的融合细胞株BSF1和BSF2，克服了双歧杆菌因厌氧而不易开发利用的难题。

2．提高代谢产物的产量

Hou将酿酒酵母(S.cerevisiae)W303经EMS诱变，诱变菌株融合后获得的融合子S3-7乙醇产量比W303提高了13%。陆海鹏将一株产核黄素的假丝酵母10经紫外诱变后的亲株TL-2的原生质体与另一亲株酿酒酵母Yl131的原生质体融合，获得的融合株YT-3核黄素产量比亲株TL-2提高了25%。Prabavathy等报道了木霉菌(Trichoderma reesei)种内原生质体融合的研究，得到的融合子产纤维素酶活性比亲本提高了两倍。Gunashree等利用原生质体融合技术将营养缺陷的黑曲霉CFR335与无花果黑曲霉SGA01的原生质体经紫外诱变后进行种间融合，获得的融合子植酸酶产量较两亲株明显提高。在乳杆菌研究中，Yu等以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Lr-WT的诱变优良菌为出发菌，通过双亲灭活得到的融合菌株F2-2乳酸产量是野生菌的1.8倍。曾献春等将保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌进行乳酸菌原生质体融合，筛选出产酸量高且耐热性好的重组菌株。

3．耐高温菌种的选育

许多种微生物能在45~65℃生存，有的甚至更高。关于微生物耐热性的机理还不是很清楚，但其耐热性有很重要的应用价值。如在酒精酿造中，酿酒酵母于40℃时产酒量明显下降，因此选育出耐高温的菌株具有重要应用价值。Shi等将酿酒酵母(S.cerevisiae)SM-3经紫外诱变筛选得到的能于43℃生长的两菌株作为亲本进行原生质体的融合，选育出了能耐受55℃高温的融合菌。孙君社等利用电场诱导原生质体融合技术对产酒率高的菌株Sb1和产酒率低但耐高温的菌株No.30进行融合，选育出耐高温的酵母，解决了在纤维素类物质同步发酵过程中发酵温度同酶解温度不一致的问题。Setei等通过原生质体融合获得了42℃条件下发酵产酒精体积分数为6.0%的耐高温酵母。

四、基因工程育种

基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。基因工程育种是真正意义上的理性选育，按照人们事先的设计进行育种。

微生物基因工程育种的方案包括分离目的基因，选用合适的载体克隆目的基因片段，并将其转化到受体菌中，通过基因操作来提高基因剂量水平或强化启动子功能，最终达到提高菌株生产力的目的。基因工程育种技术的技术流程主要如下。

1．目的基因的获得

一般通过化学合成法、物理化学法、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法、Northern杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法等方法获得目的基因。

2．载体的选择

载体是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具，基因工程载体一般为环状DNA，在体外经酶切和连接后与目的基因结合成环状重组DNA，最后经转化，进入宿主细胞，并能在宿主细胞内大量繁殖及表达。到目前为止，人们已经研究和设计出许多不同的载体，据其来源可分为质粒载体、噬菌体载体和柯斯质粒三大类型。

3．重组子体外构建

基因工程的一个重要方面是将DNA分子进行切割和连接，这方面的工作是由酶来完成，负责切割的酶属于限制性内切酶，能在载体和目的DNA末端切出特异的黏性末端；负责连接的酶是DNA连接酶，能在两段DNA链间形成新的磷酸二酯键，构建成由载体和目的基因组合而成的重组子。

4．重组载体导入受体细胞

通过制备感受态受体菌细胞或直接通过高压电穿孔法，将重组子导入受体细胞。

5．重组体筛选和鉴定

以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子。

基因工程育种在微生物育种中的应用主要有以下几个方面。

通过基因工程法生产药物：利用基因工程技术从人或动物体内分离获得药物相关基因，通过体外重组转入微生物细胞中，使得微生物获得表达这些基因的能力成为新的工程菌。通过工程菌的发酵来生产胰岛素、红细胞生成素等蛋白质药物。这些药物包括治疗用的活性蛋白质或多肽类药物，如人干扰素、人白细胞介素、人生长素、松弛素、抑长素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、血小板生长因子、凝血因子等等；疫苗类，如甲肝疫苗、乙肝疫苗、疟疾疫苗、霍乱疫苗等；以及单克隆抗体及诊断试剂。

通过基因工程法提高菌种的生产能力：自20世纪80年代以来，利用基因工程提高菌种的生产能力已经在很多发酵领域获得成功，尤其是氨基酸发酵方面获得了很大的进展。如日本的Ajinomoto公司成功地利用载体将一种大肠杆菌基因移植到另一大肠杆菌中，使其甲硫氨酸的合成能力提高15倍，脯氨酸的生产能力提高12.5倍。中国科学院微生物研究所利用基因工程方法构建了基因工程菌M151，该菌株在普通培养基上生产色氨酸酶的活力提高98倍，其发酵液中的色氨酸可达160g/L。

通过基因工程法改进传统的发酵工艺：传统发酵工艺生产微生物代谢品常需要耗费大量的动力，尤其是好氧微生物发酵过程要提供大量的无菌空气和大功率搅拌来满足发酵对溶解氧的需求，否则其代谢物的生产能力会大大下降。若将与氧吸收传递相关的血红蛋白基因克隆到好氧微生物中，改造后的微生物在发酵时对氧的敏感度会大大降低，可有效地降低发酵时的耗能。

通过基因工程法提高菌种的抗性：酵母菌是食品工业的重要菌种，在面包制作和啤酒生产等行业具有广泛的用途，由于酵母是具有活性的微生物菌体，其保存和运输必须在低温下进行。我国的科技人员利用基因工程技术成功地构建了活性干酵母和耐高温酵母，使得酵母菌可在干燥的条件下常温保存和运输。中国科学院上海植物研究所研究构建的抗63株噬菌体的谷氨酸生产菌4－210，该菌株在噬菌体严重污染的情况下仍能维持正常生产。