第四节　组织培养育苗

一、植物组织培养的概念及特点

（一）植物组织培养概念

在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，并给予适合其生长、发育的条件，使之分生出新植株，统称为组织培养，也叫离体培养或试管培养（图3-48）。

（二）植物组织培养的特点

①组织培养的整个操作过程都是无菌状态。

②组织培养中培养基的成分是完全确定的，不存在任何未知成分，其中包括大量元素、微量元素、有机元素、植物生长调节物质、植物生长促进物质、有害或悬浮物质的吸附物质等。

③外植体可以处于不同的水平之下，但都可以再生形成完整的植株。

④组织培养可以连续继代进行，形成克隆体系，但会造成品质退化。

⑤植物材料处于完全异养状态，生长环境完全封闭。

⑥生长环境完全根据植物生物学特性人为设定。

二、植物组织培养的分类

对于植物组织培养来说，依据不同的分类方法可以分为不同的种类，现具体介绍如下。

（一）按外植体的来源分类

（1）植株培养　是指对具有完整植株形态的幼苗或较大的植株进行离体培养的方法。

（2）胚胎培养　是指对植物成熟或未成熟胚进行离体培养的方法。常用的胚胎培养材料有幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房。

（3）器官培养　是指对植物体各种器官及器官原基进行离体培养的方法。常用的器官培养材料有根（根尖、切段）、茎（茎尖、切段）、叶（叶原基、叶片、子叶）、花（花瓣、雄蕊）、果实、种子等。

（4）组织培养　是指对植物体各部位组织或已诱导的愈伤组织进行离体培养的方法。常用的组织培养材料有分生组织、形成层、表皮、皮层、薄壁细胞、髓部、木质部等。

（5）细胞培养　是指对植物的单个细胞或较小的细胞团进行离体培养的方法。常用的细胞培养材料有性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等（图3-49）。

（6）原生质体培养　是指对除去细胞壁的原生质体进行离体培养的方法（图3-50）。

（二）按培养过程分类

（1）初代培养　指将植物体上分离下来的外植体进行最初几代培养的过程。其目的是建立无菌培养物，诱导腋芽或顶芽萌发，或产生不定芽、愈伤组织、原球茎。通常是植物组织培养中比较困难的阶段，也称启动培养、诱导培养。

（2）继代培养　指将初代培养诱导产生的培养物重新分割，转移到新鲜培养基上继续培养的过程。其目的是使培养物得到大量繁殖，也称为增殖培养。

（3）生根培养　指诱导无根组培苗产生根，形成完整植株的过程。其目的是提高组培苗田间移栽后的成活率。

（三）根据培养基类型分类

（1）固体培养　琼脂、卡拉胶等固化（图3-51）。

（2）半液半固体培养　固液双层（图3-52）。

（3）液体培养　振荡、旋转或静置培养（图3-53）。

三、植物组织培养实验室的构成

要在组织培养实验室内部完成所有的带菌和无菌操作，这些基本操作包括：各种玻璃器皿等的洗涤、灭菌；培养基的配制、灭菌；接种等。通常组织培养实验室包括准备室、无菌操作室、培养室以及温室等，细分的话还必须包括药品室、观察室、洗涤室等（图3-54、图3-55）。

（一）准备室

主要在准备室完成一些基本操作，比如实验常用器具的洗涤、干燥、存放；培养基的配制和灭菌；常规生理生化分析等；存放常用的化学试剂、玻璃器皿、常用的仪器设备（冰箱、灭菌锅、各种天平、烘箱、干燥箱等）。还要准备大的水槽等用于器皿等的洗涤，还要准备蒸馏水制备设备，还有显微镜等观察设备等。此外，准备室必须要有足够大的空间、足够大的工作台。

（二）无菌操作室

主要用于进行植物材料的消毒、接种以及培养物的继代培养、转移等。要求配备超净工作台、空调等。无菌操作室要根据使用频率进行不定期消毒，一般采用熏蒸法，即利用甲醛与高锰酸钾反应产生蒸气进行熏蒸，用量为每平方米2ml，也可以在无菌操作室安装紫外灯，接种前开半小时左右进行灭菌。需注意的是，工作人员进入操作室务必要更换工作服，避免带入杂菌，务必保持操作室清洁。

（三）培养室

主要用于接种完成材料的无菌培养。培养室的温度、湿度都是人为控制的。温度通过空调来调控，一般培养温度在25℃左右，也与培养材料有关系，光周期可以通过定时器来控制，光照强度控制在2500～6000lx，每天光照时间在14h左右。培养室的相对湿度控制在70%～80%，过干时可以通过加湿器来增加湿度，过湿时则可以通过除湿器来降低湿度。此外，培养室还要放置培养架，每个一般4～5层，每层高40cm，宽60cm，长120cm左右。

（四）温室

在条件允许的情况下，可以安排配备温室，主要用于培养材料前期的培养以及组配苗木的炼苗，图3-54、图3-55为组织培养实验室的构成。

四、组织培养常用的仪器设备

（一）组织培养常用设备

1.天平

组织培养实验室需要2～3台不同精度的天平。感量0.001g的天平（分析天平）（图3-56）和感量0.01g的天平（电子天平）（图3-57）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。感量0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。

2.冰箱

各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温保存，某些试验还需植物材料进行低温处理，一般普通冰箱即可满足需要。

3.酸度计

用于测定培养基及其他溶液的pH，一般要求可测定pH范围1～14之间，精度达0.01即可。

4.离心机

用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取（图3-58）。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。

5.加热器

用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统（图3-59）。

6.高压灭菌锅

用于培养基、玻璃器皿以及其他可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格（图3-60～图3-62）。

7.干热消毒柜

用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜（图3-63）。

8.超净工作台

超净工作台是使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩，入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高（图3-64～图3-66）。

其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适等优点，通过过滤的空气连续不断吹出，直径大于0.03μm的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。

9.培养架

培养架是目前所有植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。其成本低，设计灵活，可充分利用培养空间，以操作方便、最大限度利用培养空间为原则。一般有4～5层，层间间隔40～50cm，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架配备2～4盏日光灯（图3-67）。

10.培养箱

细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养（图3-68）。

11.其他设备

可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备；电泳仪、萃取和色谱设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。

（二）组织培养常用仪器

常用的培养器皿有试管、三角瓶、培养皿、培养瓶等，选择时根据培养目的和方式以及价格进行有目的地选择。试管主要用于培养基配方的筛选和初代培养；三角瓶主要用于培养物的生长，但是价格要相对偏高；培养皿主要用于滤纸的灭菌及液体培养；目前生产上常用的培养器皿主要以罐头瓶为主。

除了培养器皿，常见的仪器设备还有接种用的镊子、剪刀、解剖针、解剖刀和酒精灯等；绑缚用的纱布、棉花；配制培养基用的刻度吸管、滴管、漏斗、洗瓶、烧杯、量筒；还包括牛皮纸、记号笔、电炉（现多为电磁炉）、pH试纸等。

五、组织培养培养基的组成

培养基是决定植物组织培养成败的关键因素之一。常见的培养基主要有两种，分别是固体培养基和液体培养基，两者的区别在于是否加入了凝固剂。培养基的构成要素包括以下几部分：

（一）水分

作为生命活动的物质基础存在。培养基的绝大部分物质为水分，实验研究中常用的水为蒸馏水，而最理想的水应该为纯水，即二次蒸馏水。生产上，为了降低成本，可以用高质量的自来水或软水来代替。

（二）无机盐类

植物在培养基中可以吸收的大量元素和微量元素都来自于培养基中的无机盐。在培养基中，提供这些无机盐的主要有硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠等，不同的培养基配方当中其含量各不相同。

（三）有机营养成分

包括糖类物质，主要用于提供碳源和能源，常见的有蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖；维生素类物质，主要用于植物组织的生长和分化，常用的有盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇，烟酸、生物素等；氨基酸类物质，常见的有甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，有助于外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化促进。

（四）植物生长调节物质

植物生长调节物质在培养基中的用量很小，但是其作用很大。它不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成。最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。

（五）天然有机添加物质

香蕉汁、椰子汁、土豆泥等天然有机添加物质，有时会有良好的效果。但是这些物质的重复性差，这些物质还会因高压灭菌而变性，从而失去效果。

（六）pH值

培养基的pH值也是影响植物组织培养成功的因素之一。pH值的高低应根据所培养的植物种类来确定，pH值过高或过低，培养基会变硬或变软。实验中常用氢氧化钠或盐酸进行调节。

（七）凝固剂

进行固体培养时，要在培养基中加入凝固剂。常见的有琼脂和卡拉胶，用量一般在7～10g/L。前者生产中常用，后者透明度高，但价格贵。

（八）其他添加物

有时为了减少外植体褐变，需要向培养基中加入一些防褐变物质，如活性炭、维生素C等。还可以添加一些抗生素，抑制杂菌的生长。

六、组织培养培养基的配制

1.培养基的种类

培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的名称，多数以发明人的名字来命名，如White培养基、Murashige和Skoog培养基（简称MS培养基），也有对某些成分进行改良的称作改良培养基。目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：①MS培养基，特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。②White培养基，特点是无机盐含量较低，适于生根培养。③B5培养基，特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知，有些植物更适宜在B5培养基上生长，如双子叶植物特别是木本植物。④N6培养基，特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

一般先配制母液备用，现在有配好的各种培养基干粉，一般现成培养基干粉中加了营养成分和琼脂，也有没加琼脂的，配制培养基前，根据需要购买。

2.培养基的配制步骤

一般来讲，任何一种培养基的配制步骤都是大致相同的，配1L MS培养基的具体操作如下。

（1）取一大烧杯或铝锅，放入约900ml的水，然后加入MS培养基干粉40mg（具体用量根据培养基瓶上说明），并不断搅拌，使其溶解。

（2）将加热熔解好的培养基溶液倒入带刻度的大烧杯中，加入培养所需的植物生长调节物质，定容到1L。

（3）用1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调整pH值。

（4）分装到培养容器中。

（5）高压蒸汽灭菌锅灭菌20min，出锅晾凉备用。

七、组织培养的程序

（一）启动培养

这个阶段的任务是选取母株和外植体进行无菌培养，以及外植体的启动生长，利于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型进行增殖。该阶段是植物组织培养能否成功的重要一步。选择母株时要选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株；选择外植体时可以采用茎段、茎尖、顶芽、腋芽、叶片、叶柄等。

外植体确定以后，进行灭菌。灭菌时可以选择次氯酸钠（1%）、氯化汞（0.1%～0.2%），时间控制在10～15min，清水冲洗3～5次，然后接种（图3-69）。

（二）增殖培养

对启动培养形成的无菌物进行增殖，不断分化产生新的丛生苗、不定芽及胚状体（图3-70）。每种植物采用哪种方式进行快繁，既取决于培养目的，也取决于材料自身的可能性，可以是通过器官、不定芽、胚状体发生，也可以通过原球茎发生。增殖培养时选用的培养基和启动培养有区别，基本培养基同启动培养相同，而细胞分裂素和矿质元素的浓度水平则高于启动培养。

（三）生根培养

第二阶段增殖的芽苗有时没有根，这就需要将单个芽苗转移到生根培养基或适宜的环境中诱导生根，如图3-71所示。这个阶段的任务是为移栽作苗木准备，此时基本培养基相同，但需降低无机盐浓度，减少或去除细胞分裂素，增加生长素的浓度。

（四）移栽驯化

此阶段的目的是将试管苗从异养到自养的转变，有一个逐渐适应的过程。此时需要对试管苗进行炼苗，使植株生长粗壮，并且打开瓶口，降低湿度。移栽之前要进行炼苗，逐渐地使试管苗适应外界环境条件，接着要打开瓶口，再有一个适应过程。炼苗结束后，取出试管苗，首先洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡，然后将小苗移栽到人工配制的混合培养基质中。基质要选择保湿透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙等，如兰花移栽时要选择草苔藓等（图3-72）。

八、组织培养的应用

（一）快速繁殖优良植物株系

组织培养具有时间短、增殖率高和全年生产等优点，比大田生产快得多。加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量个体。例如兰花、桉树、杨树、秋海棠等植物，用一个茎尖或一小块叶片为基数，经过组织培养，一年内可以增殖到10000～100000株，繁殖速度如此快，说明组织培养对于短期内需要大量繁殖的植物，如引入的优良品种、优良单株、育种过程中优良子代的扩大等，特别有用，而且对一些难以繁殖或繁殖很慢的名贵花卉、果木及稀有植物，同样具有重要意义。

（二）培育作物新品种

用组织培养方法培育作物新品种，已经取得了多方面的成就。例如，利用组织培养解决杂交育种中的种胚败育问题，获得了杂种子代，使远缘杂交得以成功；用花药培养和对未传粉的子房进行离体培养，获得了单倍体植株，从而开辟了单倍体育种的途径；通过胚乳离体培养，获得了三倍体植株，为改良农、林、果树和蔬菜的三倍体育种提供了新的方法；此外，还有利用原生质体培养及体细胞杂交进行天然突变系的筛选、外源遗传物质的导入等。

（三）获得无病植株

作物的病毒病害，是当前农业生产上的严重问题。尤其是营养繁殖的作物，病毒可以经繁殖用的营养器官传至下一代，以致随着作物繁殖代数的积累，病毒不仅绵延不绝，还会日益增多。其结果是作物退化减产，甚至导致某些品种绝灭（图3-73）。

根据病毒在植物体内分布并不均匀的特点，用生长点进行组织培养，结合病毒鉴定，可以得到无病毒植株，可使植株复壮，并能增加产量。在这方面，马铃薯、水仙、苹果、梨和花椰菜等作物，都取得了明显效果（图3-74）。

（四）保存和运输种质

由于有了组织培养方法，就无需再用一代代保存种子的方法去保存种质资源，而可以将植物器官、组织甚至细胞，在低温或超低温条件下进行长期保存。将来一旦需要，就可用组织培养方法迅速进行繁殖，不但大大减少了一代代保存材料所浪费的人力、物力和时间，而且也减少了在保存过程中因管理不善及病虫侵害所造成的损失。另外，由于用很小的空间保存了大量的种质资源，运输时也很方便。