二、液相色谱仪的发展方向

自20世纪70年代以来，高效液相色谱技术经历了快速的发展，在石油化工、有机合成、医药卫生、农业、食品、环境保护等领域获得了广泛应用。目前，近80%的有机化合物均可采用HPLC进行检测分析。然而，随着药物领域的高通量筛选、食品领域的快速检测以及环境领域的及时监控等检测需求的不断拓展，对HPLC在更高通量和更优性能的发展方面提出了新的要求。

2004年，Waters公司推出了ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪并带动亚2μm色谱柱快速发展；2005～2006年，赛默飞公司推出了LTQ Orbitrap，不仅作为一种新型高分辨质谱仪问世，同时作为检测器，推动了液相色谱-高分辨质谱联用在更广泛领域的应用；2007～2008年，多孔核壳颗粒和HILIC色谱柱引起人们的关注；2009～2011年，用于手性分离的多糖固定相及生物分子色谱柱开始进入人们的视野。纵观近10年的发展，为了趋近快速、超高效的目标，HPLC在色谱柱及固定相、超高压输液泵及高速采样检测器等方面体现出了新的发展趋势。

（一）色谱柱及固定相的发展

HPLC色谱柱是色谱系统的核心。制药、食品和环境的需求一直是HPLC色谱柱向高速、高分辨率、更好的峰形发展的主要驱动力。从20世纪70年代到90年代，在填充材料的标准颗粒尺度（10～3μm）的逐级缩小方面已经有稳定的改进。80年代后期，高纯度B型硅材料（低金属含量）的引入是一个巨大进步，减小了硅醇的活性，并在批次间的一致性方面有重大改进。现在高纯硅的使用是所有现代硅胶基质色谱柱的标准。

近年来，很多学者综述了HPLC色谱柱技术的进展，表1-3总结了重大行业使用率较高的，用于提高生产力、稳定性、选择性、保留时间或专业应用的色谱柱。

1.亚2 μm颗粒

1956年，Van Deemter就给出了使用非常小的颗粒进行快速、高效分离的预测。在过去几年中，典型填料的粒径不断减小，21世纪初的研究主要集中在亚2μm的硅胶颗粒上。正如预测的那样，这些粒子（例如，1.7μm）可以产生卓越的性能（约280000块塔板/m或约4μm/块塔板）。然而，填充亚2μm粒子的色谱柱会产生高的背压，通常采用填充内径为2.1mm的色谱柱的方式，通过黏性发热减小效率损失。对高压力和低分散（减少附加柱的谱带展宽）系统的要求导致了现代UHPLC系统的特点。进一步降低粒径至小于1.5μm可能会产生更高的速度和性能。然而，它也必须伴随着系统压力的大幅增加和毛细管色谱柱内径的减小。

2.核壳结构颗粒Kirkland

熔融的核或者核壳粒子可以减小质量转移过程中的阻力。近年来研发的第一个核壳粒子具有如下特点：2.7μm表面多孔硅材料，无孔的核心（1.7μm）和多孔的壳层（厚0.5μm）。这些亚3μm的颗粒与亚2μm的完全多孔材料相比似乎具有相似的效率，但是可以产生更低的压降。这种特殊的性能可能是由于壳体较短的扩散路径，或者比较狭窄的填料分布。由于快速分离和在生物分子方面的应用，核壳色谱柱迅速获得广泛的接受。越来越多的制造商可以提供各种键合相和不同尺寸的粒子（1.3μm，1.7μm，2.6μm，1.3μm和5μm）。因此，与多孔微细颗粒的色谱柱相比，这些色谱柱在所有应用中具有很强的竞争力。

3.杂化

将有机基团引入到无机硅基体中形成杂交颗粒的理念在20世纪70年代首次由Unger提出，然而第一根具有甲基基团的商业化的色谱柱在1999年才正式推出。与传统pH范围为2～8的具有常规单功能键合的硅颗粒相比，这些混合物中的键合相被证明具有很好的pH稳定性（pH范围为1～12）和较低的亲硅羟基活性。2005年，引入第二代桥联乙烯杂化（BEH），在高pH值流动相以及UHPLC的应用上获得了极好的反响。

迄今为止，传统单官能团的C18硅胶基质键合相由于批次之间重现性较好，仍是应用领域主要的产品。但是，新的键合化学反应使困难的分离（如极性嵌入式、苯基、己基苯基、氰基、戊烷氟苯基键合）的pH值稳定范围更宽（多官能的硅烷化学键或异丙基保护的硅烷），选择性增强。最近的一个创新方法称为表面带电杂化（CSH）技术，该项技术于2010年引入，由于在酸性、低离子强度流动相（如0.1%甲酸）条件下，对高碱性分析物的峰形的改善，该项技术立即在药物分析领域获得了很好的接受度。

4.亲水作用色谱（HILIC）

在反相HPLC条件下，若流动相中有机物含量比较低，就会导致相坍塌现象（键合相脱水），许多强极性化合物就无法获得足够的保留时间或者会存在问题。20世纪90年代由Alpert首次开发了HILIC模式，使用亲水固定相（硅、二醇、氰基、氨基、两性离子等），以水和乙腈作为流动相，在极性药物分析、辅助药物代谢、氨基酸、多肽、神经递质、低聚糖、碳水化合物、核苷酸或核苷方面的分析中越来越受欢迎。HILIC的实际保留机制可以认为是分析物分子“分区”到附着在亲水结合基团的水层。与RPLC相比，HILIC其他突出的优势包括“正交”选择性（样品制备兼容两种模式），对质谱具有更高的电喷雾离子化灵敏度（5～15倍），较低的操作压力。

5.固定化多糖手性固定相

成功包覆的多糖手性固定相（CSPs）的改进模式在20世纪末实现。与早期的CSPs具有相似的多功能，但是对于腐蚀性的溶剂具有更好的稳定性，可用于正相、极性有机和反相模式。

6.用于生物分子的色谱柱

20世纪80年代发展起来的大孔径硅和聚合物填料可有效完成大型生物分子的分离。随着重组蛋白如单克隆抗体（mAb）等生物制药技术的出现，质量控制中利用HPLC和毛细管电泳进行详细表征的需求变得更加紧迫。最近，亚2μm微粒和核壳大孔径颗粒以及一些创新的离子交换和尺寸排阻等材料也被证明可以有效地分离这些大分子的生物制剂。

（二）高压输送系统的发展

1.UHPLC概念的应用

高压输液系统的发展与色谱柱及固定相的小粒径发展是密不可分的。亚2μm色谱柱的高柱效必然要求更高的压力进行液体输送，只有较高的系统压力才能使更小微粒填充的柱子得到更快的分析速度或复杂样品更出色的分离。超高效液相色谱（UHPLC）的革命性创新始于1997年James Jorgenson教授在概念验证方面的研究，紧接着第一个商业化系统于2004年推出。现如今，从HPLC到UHPLC的转化大部分都是由主要制造商完成，这些制造商目前都可以供应某种类型的UHPLC产品。UHPLC在药物分析、食品安全等领域体现出了巨大的应用优势。表1-4概述了UHPLC的突出特点和优势。

与传统的HPLC相比，UHPLC具有分析速度快的优势，图1-15展示了一种药物分析由HPLC方法转移为UHPLC方法的谱图对比。从HPLC到UHPLC，根据几何尺寸按比例缩放色谱柱及操作参数，可以在相同分辨率的情况下将分析时间减少10倍，这并不罕见。“保证好的分辨率的情况下进行更快的分析”是大多数用户考虑购买更昂贵的UHPLC设备的主要原因。

UHPLC另一个重要的优势是其对复杂样品卓越的分离能力。峰容量是分辨率为1.0时色谱图上可以分辨的色谱峰个数；通常传统的HPLC为200个左右，而UHPLC可以在单一维度，对复杂的药品、天然产物和其他样品基质提供＞300的峰容量。

UHPLC的其他优势还包括节省溶剂（5～15倍），增强质量灵敏度（3～10倍），以及在保留时间（2～3倍）和峰面积（＜0.1%RSD）方面的卓越性能。但是，UHPLC不会增加浓度灵敏度（最理想的一种灵敏度），因为质量敏感度（分析物注入量）主要与柱的空隙体积有关，无法通过使用小的流通池来增加信噪比，除非延长流通池的路径长度（如60mm）。

2.输送系统附件的改进

此外，为了实现高通量、高重现性的应用，输液系统的其他部分也需要进行相应的改变，如使用改良的进样器和恒温器、内径较小的管路系统[＜0.005英寸（1英寸=2.54cm）]、更小的紫外检测器流动池（0.5～2μL），以保证UHPLC有比较低的系统扩散、更小的系统死体积（0.1～0.3mL）和更快的检测器响应/数据采集速率（＞40pt/s）。2015年匹兹堡分析化学与应用光谱会议（Pittcon，2015）上，具有更高的操作耐压、更低的样品扩散、更新颖的色谱柱柱温箱设计以及更加快速循环的自动进样器的第二代UHPLC产品层出不穷，这也证实了这种发展趋势。如赛默飞公司在会上展出的Vanquish UHPLC将普通的风扇强制循环对流传热模式改为直接传导加热模式，改善了色谱柱内部形成温度梯度的问题。图1-16是使用两种不同加热模式时色谱柱内部流体流型的模拟示意图。从图1-16可以看出，采用直接传导加热模式时色谱柱内没有形成温度梯度[见图1-16（a）]，最大化地保证了色谱柱的柱效；而采用风扇强制循环对流传热模式时色谱柱内部形成了对柱效极为不利的温度梯度[图1-16（b）]。

安捷伦公司在Pittcon 2015上新推出的Agilent 1290 Infinity Ⅱ UHPLC则对进样针模式进行改进，采用独立流路的双进样针设计模式，使进样循环间隔时间比单进样针大大缩短，可以以秒计，同时其交叉污染＜9mg/L。图1-17是新自动进样器的使用效果示意图。

3.超临界流体输送系统的发展

超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支。所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低黏度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。从理论上说，SFC既可以分析GC法难以处理的高沸点、不挥发性样品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分离时间，且可使用二者常用的检测器，也可与MS、FT-IR光谱仪等在线连接，因而可以方便地进行定性、定量分析。因此，超临界流体的出现，使液相色谱的分析更为全面。

图1-18为以CO2为流动相的超临界流体仪器，其中CO2 泵溶剂输送单元，仅用于CO2流体，用作萃取和分离分析的流动相，其内置一个制冷泵头控制器，以实现在恒定温度下输送CO2流体。BPR为背压调节器，用于为SFE和SFC系统流路保持一定压力。当用液体二氧化碳作为流动相时，它还具有温度控制功能，以防止因出口处二氧化碳气化吸热而冻结。先进的设计技术降低了该单元的内部体积，使得所有样品均进入质谱检测器，从而得到高灵敏度的分析。SFC单元通过超临界流体萃取样品中的目标化合物。样品萃取需要专用的萃取器。通过切换流速，可分别实现静态萃取与动态萃取。样品盘中的不同萃取器可分别控温，因此可避免样品在待检过程中发生高温分解。该系统将两个高压阀内置于超临界流体萃取单元内部，通过SFE单元萃取的化合物可直接在线加载至SFC单元，接着通过色谱柱进行分离，继而经由质谱检测器进行检测。该在线系统兼容了SFE用于前处理以及SFC用于分析，可自动将固体样品中的目标物直接萃取进行分析。在农残检测中，这将减少用于样品前处理85%的时间。该系统也有助于抑制不稳定化合物的分解，这是由于自动化的萃取是在避光且非氧化环境下进行的。

此外，近年来，将HPLC与超临界流体系统融合，以类似于GC的双柱系统的模式用于目标物的比较分析。事实上，在SFC系统的基础上，只需增加一个LC输液泵，即可轻松实现LC与SFC的自由切换。利用该系统，可正常使用常规LC系统。同时，与以往不同的是，当样品在LC上难以分离的时候，可以尝试使用SFC模式，以期在不同分离模式下获得不同的分离效果。图1-19充分显示了SFC在分离同分异构体时的优势。

（三）检测系统的发展

HPLC发展至今，检测器的种类主要包括紫外-可见吸收检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器、化学发光检测器和蒸发光散射检测器等，但是，始终没有一种完全通用的检测器可以实现统一的检测。近年来，质谱（MS）“检测器”、电雾式检测器（CAD）和自动方法开发系统（AMDS）的出现为HPLC检测系统的发展提供了新的动力。

1.质谱（MS）检测器

HPLC与质谱联用（LC/MS），集合了HPLC的分离能力和质谱卓越的灵敏度和选择性，已被视为完美的分析工具。质谱作为一种液相色谱的特殊“检测器”，使液相色谱拥有更广泛的应用领域。

当前，LC/MS是杂质和降解鉴定、药物研究中的高通量筛选技术，也是生物分析试验、环境污染物的在线监测和食品安全分析的首选技术，而且，LC/MS已经成为高效药物清洁验证以及潜在的基因毒性杂质测定的标准技术平台。

过去十年中，高分辨质谱HRMS（如TOF、OrbiTrap MS）和杂化质谱（如Quadrupole-TOF或ion trap-OrbiTrap）得到了快速发展。HRMS和UHPLC以及二维LC的联用使得代谢组学、蛋白质组学、De Novo蛋白测序和生物制药表征等领域的研究愈发活跃，而质谱作为液相色谱检测器的作用也发挥得淋漓尽致，使液相色谱从单纯的分离技术发展成为了化合物定性、定量鉴别的重要技术。

2.电雾式检测器（CAD）

缺乏理想的通用检测器常常被视为HPLC的局限，尽管UV/Vis检测器可以检测具有发色基团的化合物。示差折光检测器不适合梯度洗脱，敏感性不够。蒸发光散射检测器（ELSD）使用喷雾器技术与激光光散射检测，是HPLC的一个选择，也可以兼容梯度洗脱，但最近已经被CAD（使用喷雾器和电晕放电检测技术）超越，CAD可以使灵敏度更好（低至ng级），线性更佳。CAD正逐渐成为药物化学、反应过程监控以及原材料/辅料测试的主流检测器。

（四）自动化HPLC方法体系（AMDS）的发展

1.分析方法自动化开发

复杂混合物的HPLC方法开发是一个很耗时的工作，因为需要优化很多操作参数[柱尺寸、键合固定相和流动相A和B（有机溶剂/缓冲类型、pH值和离子强度）的类型、梯度洗脱时间和梯度范围、柱温度、流量]。一个常见的例子就是药物活性成分（API）稳定性指示分析或纯度测定，其中所有的杂质和降解产物必须分离，通过UV检测器进行准确的定量。多年以来，基于模拟、预测、单纯形优化、柱/流动相筛选的软件或自动化系统促进HPLC方法的开发。虽然它们似乎还没有很普及，但持续的改进提高了HPLC的性能和易用性。最新进入市场的是一个附加软件包，兼容两个常用的色谱数据系统。对于HPLC方法开发过程（优化）中最耗时的部分，该软件利用用户定义空间的自动化序列方法来解决，其中使用了实验设计（DoE）和质量源于设计（QbD）的原则。导入完整的序列结果之后，该软件还可以执行统计分析，并显示最佳条件。

岛津公司为新一代液相UHPLC Nexera设计了特殊的方法开发系统，该系统可借助专用控制软件（Nexera Method Scouting）和耐高压的柱切换系统，自动切换流动相和色谱柱，实现HPLC方法的高效开发。通常情况下，分析工作者对流动相和色谱柱的优化需要耗费大量的时间才能找到最佳的组合条件，而这套开发系统可以自动获取最多96种流动相色谱柱组合时的数据，可以最大限度地提升开发效率。图1-20显示了常规开发方法和自动开发方法的区别。

这种自动化的方法开发软件可以实现流动相和色谱柱的管理组合，能事先计算出各种流动相、样品的所需用量，并作为信息提供以预防流动相耗尽、样品不足等现象，还可以根据标注在色谱柱数据库中的色谱柱性能参数自动控制压力上限，避免色谱柱劣化。随着大数据、网络化应用的发展，液相色谱方法优化的自动化过程既节省了分析工作者宝贵的时间和精力，又提高了方法建立的重现性和高效性，自然成为其发展的一个重要趋势。

2.分析-制备方法的自动化转换

制备色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质，也就是从混合物中得到纯物质。因此，为了加快分离的时间并提高分离的效率，制备色谱的进样量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷相应加大，必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用相对多的流动相。通常的做法是从分析柱的规格开始逐渐放大规模，直至适合制备要求。但如从同一台仪器上进行规模放大，可节约流动相和试样的使用量，降低成本。如图1-21所示，规模放大时的一对色谱柱（分析柱和制备柱）使用同一特性的填料，只要一对色谱柱的柱长相同、填料粒径相同，则在两种柱子的单位截面积的进样量和线速度一致时，可得到同一色谱效果。采用这种方法可以快速获得理想的结果（图1-22）。

（五）多功能集成化的发展

在液相色谱的各个组件不断发展的背景下，液相色谱的功能拓展和集成方面近年来也有了很大的发展，如岛津、安捷伦和赛默飞世尔公司先后推出了不少拓展液相色谱功能的集成化设备，这些设备在单纯的液相色谱基础上通过六通阀、十通阀的引入，使液相色谱具备了在线预处理（提取、净化、除盐）、多维分析、改善检测能力（柱后衍生、梯度补偿）等功能，从而加快整个分析检测过程，提供更加丰富的分离检测信息。

2010年左右热电公司发布的双三元液相色谱仪（UltiMate 3000 DGLC）就是通过六通阀和十通阀将两套三元梯度泵置于一个体系内，借助不同的连接需要实现各种功能。

图1-23为双三元液相色谱的并联模式示意图。通过这种方式可将一台仪器当作两台仪器使用，同时完成两个不同方法的分析测试任务，相当于两台独立液相色谱的功能。并联模式可运用两个不同的分析方法，通过共享自动进样器和柱温箱，额外增加一个检测器就可基于阀的灵活切换实现一台仪器做两台仪器使用的技术。阀1～6位连接时，右泵-自动进样器-柱温箱-Detector1构成系统1，同时左泵-柱温箱-Detector 2构成系统2，两个系统同时进行分析。在系统1完成进样后，通过添加方法命令，将自动进样器释放给系统2，达到共用自动进样器和柱温箱的目的，提高了仪器的工作效率和分析通量。

图1-24为双三元液相色谱的串联模式示意图。这种模式可实现在线分析样品的同时离线清洗、平衡色谱柱，缩短了约20%～50%的分析时间，提高分析效率。首先选择两根相同的色谱柱，在柱温箱上配置一个两位置十通阀，采用双三元泵的右泵作为进样分析泵，左泵作为离线的清洗平衡泵。在A位时，色谱柱1进行梯度分析，同时色谱柱2进行离线清洗平衡；梯度分析结束后，阀切换至B位，色谱柱2与进样器及检测器相连接，进行梯度分析，同时色谱柱1进行离线清洗和平衡，整个过程在密闭系统中连续不间断地进行，提高分析效率。

此外，双三元液相色谱可在线去除流动相中的非挥发性缓冲盐，这对于液相色谱与质谱联用时十分有用。双三元梯度泵的右泵保持原来的分析流动相条件不变，目标成分在一维分析柱中实现分离，通过两位置六通阀将已被常规检测器检测的目标物储存至loop环中；左泵采用与MS兼容的挥发性流动相，将储存在loop环中的目标分析物洗脱至二维除盐柱中，利用质谱上固有的六通阀，将流动相中的非挥发性盐除去，再调整左泵流动相比例将目标待测物洗脱至MS。

（六）物质全分析能力的拓展

随着科学研究不断向精细化方向深入，复杂基质样品的分析已成为色谱分析的热点。常规色谱（又称一维色谱）在复杂样品分离方面很难满足要求，由于色谱体系和操作条件一旦固定，在一定时间内，最多能从色谱柱洗脱并达到一定分离度的色谱峰个数（峰容量）是有限的。David和Giddings的研究证实，如果色谱峰的个数超过峰容量的37%，则色谱峰的分离度就会大幅下降。然而组学的快速发展推动全成分分析的需求愈加强烈，因此多维色谱分离技术应运而生。其中岛津公司开发的全二维液相色谱是近年来最受关注的多维色谱之一。

从本质而言，全二维色谱即通过组合两个独立的分离系统，在对样品进行一维液相分离的同时，再对其进行在线连续二维液相分离。其不同于传统二维液相的中心切割模式，使用具有2个样品环的流路切换阀将一维和二维液相整合，借助流路切换阀的交替运行，从样品环将一维液相洗脱液连续不断地注入二维液相进行分离。图1-25为岛津Nexera-e全二维液相色谱系统的流路和工作方式。

与一般的一维液相相比，全二维分离系统得到的数据整合了一维和二维的分离结果，可提供更大的峰容量，有效减少色谱峰重叠，进而提供更多更准确的信息，已获得越来越多研究人员的关注和应用。图1-26显示了常规一维液相和全二维液相的差异，从图中可以明显看出二维分离的优越性。

总之，最近几年中，HPLC仍然是一个高度有活力的领域，在仪器、色谱柱技术、应用等方面有很多创新。科学家们最初将这些新技术应用于研究、开发和质量控制，他们是这项技术的早期采纳者，同时也是受益者。UHPLC在研究与开发领域被快速接受，并逐渐成为标准的UHPLC平台。新的色谱柱技术可以更快和更有效地分析复杂样品、手性分子和生物分子。UHPLC和二维液相与高分辨率质谱联用技术的快速进展，已经彻底改变了生命科学的研究，并将会在临床诊断、食品分析和环境等方面产生更大的影响。