第二节　豆类与油料作物检验技术

一、大豆蛋白质含量的测定（GB 5009.5—2016）

凯氏法一直被作为蛋白质定量的标准方法。该法是1883年由丹麦化学家凯道尔（Johan’ Kiedahl）创立的，它可用于所有动物性食品、植物性食品的蛋白质含量测定，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。该法具有很高的准确度和精密度，因此在食品分析、饲料分析、粮食品质分析及种子品质鉴定和生化研究工作中得到广泛应用。

1.适用范围

适用于油料粗蛋白质的测定，也是各种农产品与食品样品蛋白质定量分析的标准方法。

2.测定原理

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量，再乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

3.仪器和设备

凯氏定氮消化与蒸馏装置见图3-1，自动凯氏定氮仪、天平感量为1mg。

4.试剂与配制

（1）试剂

硫酸铜；硫酸钾；硫酸；硼酸；甲基红指示剂；溴甲酚绿指示剂；亚甲基蓝指示剂；氢氧化钠；乙醇。

（2）试剂配制

硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解并稀释至1000mL。

氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，稀释至100mL。

硫酸标准滴定溶液c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L或盐酸标准滴定溶液c（HCl）=0.0500mol/L。

甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于9 5%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

A混合指示液：2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

B混合指示液：1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

5.操作步骤

（1）凯氏定氮法

①试样处理。称取充分混匀的固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（约相当于30～40mg氮），精确至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45℃角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h。取下放冷，小心加入20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

②测定。按图3-1装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。

③向接受瓶内加入10.0mL硼酸溶液，1～2滴A混合指示剂或B混合指示剂，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0～10.0mL试样处理液，由小玻璃杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻璃杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻璃塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并水封。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，如用A混合指示液，终点颜色为灰蓝色；如用B混合指示液，终点颜色为浅灰红色。同时做试剂空白。

（2）自动凯氏定氮仪法

称取充分混匀的固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（约相当于30～40mg氮），精确至0.001g，置于消化管中，再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加50mL水，于自动凯氏定氮仪（使用前加入氢氧化钠溶液，盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A或B的硼酸溶液）上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。

6.结果计算

试样中蛋白质的含量按式（3-1）计算：

　　（3-1）

式中　X——试样中蛋白质的含量，g/100g；

V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；

0.0140——1.0mL硫酸［c（1/2H2SO4）=1.000mol/L］或盐酸［c（HCl）=1.000mol/L］标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m——试样的质量，g；

V3——吸取消化液的体积，mL；

F——氮换算为蛋白质的系数，大豆为5.71；

100——换算系数。

蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

注：当只检测氮含量时，不需要乘蛋白质换算系数F。

7.注意事项

①蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3体积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。

②20g/L硼酸吸收液每次用量25mL，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴。

③在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足。蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。

④加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。

二、蛋白质的快速测定法

双缩脲法是测定蛋白质含量常用方法之一。此法简单、快速，有较好的精密度，分析对象也比较广泛，适于快速分析。双缩脲法是一种比色测定方法，测定中需要有与被测样品成分相似或同类物质做标准样，标准样品的蛋白质含量也需要通过凯氏定氮法确定。

双缩脲法受蛋白质特异性的影响较小，除组氨酸以外，其他的游离氨基酸和二肽化合物均不显色；除双缩脲、一亚氨基双缩脲、二亚氨基双缩脲、氨基酰胺、丙二酸胺等少数化合物以外，非蛋白质均不显色。所以，双缩脲反应基本上可看作是蛋白质的特有反应。

双缩脲试剂经改进后，对于富含淀粉的粮食样品，可不预先提取蛋白质双缩脲而直接进行测定。若将反应温度提高到60℃，则反应时间可缩短到5min左右。但该法灵敏度不高，样品用量大。而且事先要用凯氏法测蛋白质含量，绘制出标准曲线或计算回归方程，比较麻烦。

1.适用范围

双缩脲法适用于生物化学领域中测定蛋白质含量，也适用于豆类、油料、米谷类等作物种子及肉类等样品的测定。

2.测定原理

当脲加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，蛋白质分子中含有肽键（—CO—NH—），与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，该配合物的最大吸收波长为560nm。

本法灵敏度较低，但操作简单快速，故常作为粮食作物的例行分析方法。

3.仪器与设备

①紫外-可见分光光度计。

②离心机（4000r/min）。

③恒温水浴锅。

④500mL容量瓶。

⑤50mL、100mL量筒。

4.试剂与配制

①碱性硫酸铜溶液

a.以甘油为稳定剂将10mL 10mol/L氢氧化钾和3.0mL甘油加到937mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入50mL 40g/L硫酸铜溶液。

b.以酒石酸钾钠作稳定剂将10mL 10mol/L氢氧化钾和20mL 250g/L酒石酸钾钠溶液加到930mL蒸馏水中，同时慢慢加入40mL 40g/L硫酸铜溶液，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。

②四氯化碳。

5.操作步骤

①标准曲线的绘制。以凯氏定氮法测出标准样品的蛋白质含量，并按不同蛋白质含量称取标准蛋白质样品。分别置于数支50mL比色管中，然后加入1.00mL四氯化碳进行脱脂，再用碱性硫酸铜溶液稀释至50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心10min，取离心后的透明液于比色皿中，选择在560nm处，以试剂溶液做空白试验测定各标准样液的吸光度（A）。以蛋白质含量为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

②样品的测定。准确称取样品（使得蛋白质含量在40～100mg之间）于50mL比色管中，同样加1.00mL四氯化碳，按上述步骤①在相同条件下进行显色，测定吸光A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质的质量，由此求得蛋白质含量。

6.结果计算

按式（3-2）计算测定结果：

　　（3-2）

式中　m1——由标准曲线上查得的蛋白质的质量，mg；

m——样品质量，g。

7.注意事项

①蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。

②标准曲线作完整之后，无需每次再作标准曲线。

③脂肪含量高的样品应预先用醚抽出弃去。

④样品中有不溶性成分存在时，可预先将蛋白质抽出后再测定。

⑤当肽链中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。

⑥本法操作简便，但相应的样品应具有一定的溶解度，或选择适当的溶剂或介质增加其溶解度，以减少因散射造成的影响。

⑦对浑浊样液除进行离心处理外，也可与系列浓度的类似样品显色液进行目视比色测定。

三、花生脂肪含量的测定（GB 5009.6—2016）

（一）索氏抽提法

1.适用范围

索氏抽提法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不易吸湿结块的样品的测定。水果、蔬菜及其制品、粮食及粮食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、水产及其制品、焙烤食品、糖果等食品中游离态脂肪含量可用本法测定。

2.测定原理

脂肪易溶于有机溶剂。试样直接用无水乙醚或石油醚等溶剂抽提后，蒸发除去溶剂，干燥，得到游离态脂肪的含量。

3.试剂和材料

（1）试剂

无水乙醚（C4H10O）；石油醚（CnH2n+2）（石油醚沸程为30～60℃）。

（2）材料

石英砂；脱脂棉。

4.仪器和设备

①索氏抽提器。

②恒温水浴锅。

③分析天平：感量0.001g和0.0001g。

④电热鼓风干燥箱。

⑤干燥器：内装有效干燥剂，如硅胶。

⑥滤纸筒。

⑦蒸发皿。

5.操作步骤

（1）试样处理

固体试样：称取充分混匀后的试样2～5g，准确至0.001g，全部移入滤纸筒内。

液体或半固体试样：称取混匀后的试样5～10g，准确至0.001g，置于蒸发皿中，加入约20g石英砂，于沸水浴上蒸干后，在电热鼓风干燥箱中于（100±5）℃干燥30min后，取出，研细，全部移入滤纸筒内。蒸发皿及粘有试样的玻璃棒，均用沾有乙醚的脱脂棉擦净，并将棉花放入滤纸筒内。

（2）抽提

将滤纸筒放入索氏抽提器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处，于水浴上加热，使无水乙醚或石油醚不断回流抽提（6～8次/h），一般抽提6～10h。提取结束时，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上无油斑表明提取完毕。

（3）称量

取下接收瓶，回收无水乙醚或石油醚，待接收瓶内溶剂剩余1～2mL时在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1h，放干燥器内冷却0.5h后称量。重复以上操作直至恒重（直至两次称量的差不超过2mg）。

6.分析结果的计算

试样中脂肪的含量按式（3-3）计算：

　　（3-3）

式中　X——试样中脂肪的含量，g/100g；

m1——恒重后接收瓶和脂肪的含量，g；

m0——接收瓶的质量，g；

m2——试样的质量，g；

100——换算系数。

计算结果保留小数点后一位。

7.注意事项

①样品应干燥后研细，样品含水分会影响溶剂提取效果，而且溶剂会吸收样品中的水分，造成非脂成分溶出。装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧，影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管样品中的脂肪不能抽提，造成误差。

②对含大量糖及糊精的样品，要先用冷水使糖及糊精溶解，经过滤除去，将残渣连同滤纸一起烘干，放入抽提管中。

③抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。

④过氧化物的检查方法：取6mL乙醚，加2mL 10%碘化钾溶液，用力振摇，放置1min后，若出现黄色，则证明有过氧化物存在，应另选乙醚或处理后再用。

⑤提取时水浴温度不可过高，以每分钟从冷凝管滴下80滴左右，每小时回流6～12次为宜，提取过程应注意防火。

（二）酸水解法

1.适用范围

酸水解法适用于各类食品中脂肪的测定，对固体、半固体、黏稠液体或液体食品，特别是加工后的混合食品，容易吸湿、结块，不易烘干的食品，不能采用索氏提取法时，用此法效果较好。水果、蔬菜及其制品、粮食及粮食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、水产及其制品、焙烤食品、糖果等食品中游离态脂肪及结合态脂肪总量可用本法测定。

2.测定原理

食品中的结合态脂肪必须用强酸使其游离出来，游离出的脂肪易溶于有机溶剂。试样经盐酸水解后用无水乙醚或石油醚提取，除去溶剂即得游离态和结合态脂肪的总含量。

3.试剂与配制

（1）试剂

盐酸；乙醇；无水乙醚；石油醚（沸程为30～60℃）；碘；碘化钾。

（2）试剂的配制

盐酸溶液（2mol/L）：量取50mL盐酸，加入到250mL水中，混匀。

碘液（0.05mol/L）：称取6.5g碘和25g碘化钾于少量水中溶解，稀释至1L。

4.材料

蓝色石蕊试纸；脱脂棉；滤纸（中速）。

5.仪器和设备

①恒温水浴锅。

②电热板：满足200℃高温。

③锥形瓶。

④分析天平：感量为0.1g和0.001g。

⑤电热鼓风干燥箱。

6.操作步骤

（1）试样水解

固体试样：称取约2～5g，准确至0.001g，置于50mL试管内，加入8mL水，混匀后再加10mL盐酸。将试管放入70～80℃水浴中，每隔5～10min以玻璃棒搅拌1次，至试样消化完全为止，约40～50min。

液体试样：称取约10g，准确至0.001g，置于50mL试管内，加10mL盐酸。将试管放入70～80℃水浴中，每隔5～10min以玻璃棒搅拌1次，至试样消化完全为止，约40～50min。

（2）抽提

取出试管，加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移入100mL具塞量筒中，以25mL无水乙醚分数次淋洗试管，一并倒入量筒中。待无水乙醚全部倒入量筒后，加塞振摇1min，小心开塞，放出气体，再塞好，静置12min，小心开塞，并用乙醚冲洗塞及量筒口附着的脂肪。静置10～20min，待上部液体清晰，吸出上清液于已恒重的锥形瓶内，再加5mL无水乙醚于具塞量筒内，振摇，静置后，仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内。

（3）称量

取下接收瓶，回收无水乙醚或石油醚，待接收瓶内溶剂剩余1～2mL时在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1h，放入干燥器内冷却0.5h后称量。重复以上操作直至恒重（直至两次称量的差不超过2mg）。

7.结果计算

试样中脂肪的含量按式（3-4）计算：

　　（3-4）

式中　X——试样中脂肪的含量，g/100g；

m1——恒重后接收瓶和脂肪的含量，g；

m0——接收瓶的质量，g；

m2——试样的质量，g；

100——换算系数。

计算结果保留小数点后一位。

8.注意事项

①测定的样品需充分磨细，液体样品需充分混合均匀，以使消化完全。

②水解后加的乙醇可使蛋白质沉淀，促进脂肪球聚合，同时溶解一些碳水化合物、有机酸等。后面用乙迷提取，因乙醇可溶于乙醚，故需加入石油醚，降低乙醇在醚中的溶解度，使乙醇溶解物残留在水层，并使分层清晰。

③挥干溶剂后，残留物中若有黑色焦油状杂质，是分解物与水一同混入所致，会使测定值增大，造成误差，可用等量的乙迷及石油醚溶解后过滤，再次进行挥干溶剂的操作。

④因磷脂在酸水解条件下分解为脂肪酸和碱，故本法不宜用于测定含有大量磷脂的食品如鱼类、贝类和蛋品。此法也不适于含糖高的食品，因糖类遇强酸易碳化而影响测定结果。

四、花生中黄曲霉毒素的测定（GB 5009.22—2016）

黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，是黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢产物。黄曲霉毒素有剧毒，同时还有致癌、致畸、致突变的作用，主要引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。黄曲霉毒素是目前发现的化学致癌物中最强的物质之一，主要存在于被黄曲霉污染过的粮食、油及其制品中，例如黄曲霉污染的花生、花生油、玉米、大米、棉籽中最为常见，在干果类食品如胡桃、杏仁、榛子中，在动物性食品如肝、咸鱼中以及在乳和乳制品中也曾发现过黄曲霉毒素。黄曲霉毒素在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。

1.适用范围

本测定方法为高效液相色谱-柱前衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的测定。

2.测定原理

试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液经黄曲霉毒素固相净化柱净化去除脂肪、蛋白质、色素及糖类化合物等干扰物质，净化液用三氟乙酸柱前衍生，液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。

3.试剂和材料

（1）试剂

甲醇（CH3OH）：色谱纯。

乙腈（CH3CN）：色谱纯。

正己烷（C6H14）：色谱纯。

三氟乙酸（CF3COOH）。

（2）试剂配制

乙腈-水溶液（84+16）：取840mL乙腈加入160mL水。

甲醇-水溶液（70+30）：取700mL甲醇加入300mL水。

乙腈-水溶液（50+50）：取500mL乙腈加入500mL水。

乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500mL乙腈加入500mL甲醇。

（3）标准品

AFTB1标准品（C17H12O6，CAS号：1162-65-8）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

AFTB2标准品（C17H14O6，CAS号：7220-81-7）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

AFTG1标准品（C17H12O7，CAS号：1165-39-5）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

AFTG2标准品（C17H14O7，CA号：7241-98-7）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

注：标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。

（4）标准溶液配制

标准储备溶液（10μg/mL）：分别称取AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG21mg（精确至0.01mg），用乙腈溶解并定容至100mL。此溶液浓度约为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后，在-20℃下避光保存，备用。

混合标准工作液（AFTB1和AFTG1：100ng/mL；AFTB2和AFTG2：30ng/mL）：准确移取AFTB1和AFTG1标准储备溶液各1mL，AFTB2和AFTG2标准储备溶液各300μL至100mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，三个月内有效。

标准系列工作溶液：分别准确移取混合标准工作液10μL、50μL、200μL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL至10mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度（AFTB1和AFTG1浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL；AFTB2和AFTG2浓度为0.03ng/mL、0.15ng/mL、0.6ng/mL、1.5ng/mL、3.0ng/mL、6.0ng/mL、12.0ng/mL的系列标准溶液）。

4.仪器和设备

①匀浆机。

②高速粉碎机。

③组织捣碎机。

④超声波/涡旋振荡器或摇床。

⑤天平：感量0.01g和0.00001g。

⑥涡旋混合器。

⑦高速均质器：转速6500～24000r/min。

⑧离心机：转速≥6000r/min。

⑨玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm。

⑩氮吹仪。

液相色谱仪：配荧光检测器。

色谱分离柱。

黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱（以下简称净化柱）或相当者。

一次性微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜使用。

筛网：1～2mm试验筛孔径。

恒温箱。

pH计。

5.操作步骤

（1）样品制备

采样量需大于1kg，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。

（2）样品提取

称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min（或用均质器均质3min），在6000r/min下离心10min（或均质后用玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。

（3）样品黄曲霉毒素固相净化柱净化

移取适量上清液，按净化柱操作说明进行净化，收集全部净化液。

（4）衍生

用移液管准确吸取4.0mL净化液于10mL离心管后在50℃下用氮气缓缓地吹至近干，分别加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，涡旋30s，在（40±1）℃的恒温箱中衍生15min，衍生结束后，在50℃下用氮气缓缓地将衍生液吹至近干，用初始流动相定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，过0.22μm滤膜，收集滤液于进样瓶中以备进样。

（5）色谱参考条件

色谱参考条件列出如下：

①流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇溶液（50+50）。

②梯度洗脱：24%B（0～6min），35% B（8.0～10.0min），100% B（10.2～11.2min），24% B（11.5～13.0min）。

③色谱柱：C18柱（柱长150mm或250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5.0μm），或相当者。

④流速：1.0mL/min。

⑤柱温：40℃。

⑥进样体积：50μL。

⑦检测波长：激发波长360nm；发射波长440nm。

⑧液相色谱图见图3-2。

（6）样品测定

①标准曲线的制作。系列标准工作溶液由低浓度到高浓度依次进样检测，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。

②试样溶液的测定。待测样液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进样分析。

③空白试验。不称取试样，按操作步骤中（2）～（4）的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。

6.结果计算

试样中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的残留量按式（3-5）计算：

　　（3-5）

式中　X——试样中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2的含量，μg/kg；

ρ——进样溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2按照外标法在标准曲线中对应的浓度，ng/mL；

V1——试样提取液体积（植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积，酱油、醋按定容总体积），mL；

V3——净化液的最终定容体积，mL；

1000——换算系数；

V2——净化柱净化后的取样液体积，mL；

m——试样的称样量，g。

计算结果保留三位有效数字。

五、植物油脂检验——扦样、分样法（GB/T 5524—2008）

1.适用范围

适用于液态油脂、固态油脂扦样。

2.原理

扦样和制备样品的目的是从一批样品中获得便于处理的油脂量。样品的特性应尽可能地接近其所代表的油脂的特性。

3.扦样工具

（1）扦样管

扦样管是不锈钢装置，由两个长度相同且紧密靠在一起的同心圆管组成，其中一个管可在另一个管中转动。每个管上都有纵向开口。在某一位置，管开启使油流入，通过转动内管而使管封闭。内管直径为20～40mm，整个长度上直径相同。当排空扦样管时，因两管上都分布有小孔，所以当纵向开口关闭时，管中的油能够从小孔排出。

该扦样管适用于圆筒中不同深度的扦样，扦样时，可以按住管顶直到指定深度。

（2）带底阀的扦样筒

带底阀的扦样筒分为上下两部分，上部顶端敞口，下部在筒体外侧装有较重的螺旋机构，其底端固定一轻型自重阀，以确保扦样装置自底部到顶部的稳固。当扦样筒在液体油脂中下落时，油脂对阀的压力使阀底一直处于打开状态，以确保油脂均匀地流入筒体。当停止下落时，底阀关闭，油脂从扦样筒所达的深度被抽出。

（3）扦样铲

扦样铲用于硬脂的扦样，由不锈钢制成，具有半圆形或C形的横截面。将其扭转插入油脂中，便取得一份油样。

4.扦样方法

从包装的产品中（包括消费者购买的小包装产品）扦样，对于不同规格的包装，采样数可按表3-2的推荐值。

包装液态油脂的扦样步骤：转动并翻转装满液态油脂的桶或罐，采用手工或机械的方式，用桨叶或搅拌器将油脂搅匀，从桶的封塞孔或其他容器的方便开口插入适当的扦样装置，从被扦样的每一容器中采集一份检样，从尽可能多的内容物部位采样；按等同分量充分混合这些检样样品形成原始样品。

5.试样制备

当需要进行污染物分析时，试样要从每罐中采集。也可以按照有关各方的协议从原始样品中制备试样，具体方式如下：

①从原始样品中制备称量过的平均样品。

②从每份原始样品中制备。

无论采用①或是②，分割制备的原始样品以获得至少4份试样，每份至少250g（当有特殊要求时，也可制备500g以上的试样）。不断地搅动以避免沉淀物的沉积。

六、植物油脂检验——水分及挥发物测定法（GB 5009.236—2016）

（一）沙浴（电热板）法

1.适用范围

本测定方法适用于所有的动植物油脂。

2.原理

在（103±2）℃的条件下，对测试样品进行加热至水分及挥发物完全散尽，测定样品损失的质量。

3.仪器和设备

①分析天平：感量0.001g。

②碟子：陶瓷或玻璃的平底碟，直径80～90mm，深约30mm。

③温度计：刻度范围至少为80～110℃，长约100mm，水银球加固，上端具有膨胀室。

④沙浴或电热板（室温约150℃）。

⑤干燥器：内含有效的干燥剂。

4.分析步骤

（1）试样制备

在预先干燥并与温度计一起称量的碟子中，称取试样约20g，精确至0.001g。

液体样品：对于澄清无沉淀物的液体样品，在密闭的容器中摇动，使其均匀；对于有浑浊或有沉淀物的液体样品，在密闭的容器中摇动，直至沉淀物完全与容器壁分离，并均匀地分布在油体中。检查是否有沉淀物吸附在容器壁上，如有吸附，应完全清除（必要时打开容器），使它们完全与油混合。

固体样品：将样品加热至刚变为液体，按液体试样操作，使其充分混匀。

（2）试样测定

将装有测试样品的碟子在沙浴或电热板上加热至90℃，升温速率控制在10℃/min左右，边加热边用温度计搅拌。

降低加热速率观察碟子底部气泡的上升，控制温度升高至（103±2）℃，确保不超过105℃。继续搅拌至碟子底部无气泡放出。

为确保水分完全散尽，重复数次加热至（103±2）℃、冷却至90℃的步骤，将碟子和温度计置于干燥器中，冷却至室温，称量，精确至0.001g。重复上述操作，直至连续两次结果不超过2mg。

5.结果计算

水分及挥发物含量（X）以质量分数表示，按式（3-6）计算：

　　（3-6）

式中　X——水分及挥发物含量，%；

m1——加热前碟子、温度计和测试样品的质量，g；

m2——加热后碟子、温度计和测试样品的质量，g；

m0——碟子和温度计的质量，g；

100——单位换算。

计算结果保留小数点后两位。

（二）电热干燥箱法

1.适用范围

本测定方法适用于酸价低于4mg/g的非干性油脂，不适用于月桂酸型的油（棕榈仁油和椰子油）。

2.原理

在（103±2）℃的条件下，对测试样品进行加热至水分及挥发物完全散尽，测定样品损失的质量。

3.仪器和设备

①分析天平：感量0.001g。

②玻璃容器：平底，直径约50m，高约30mm。

③电热干燥箱：主控温度（103±2）℃。

④干燥器：内含有效的干燥剂。

4.分析步骤

（1）试样准备

在预先干燥并称量的玻璃容器中，根据试样预计水分及挥发物含量，称取5g或10g试样，精确至0.001g。

（2）试样测定

将含有试样的玻璃容器置于（103±2）℃的电热干燥箱中1h，再移入干燥器中，冷却至室温，称量，准确至0.001g。重复加热、冷却及称量的步骤，每次复烘时间为30min，直到连续两次称量的差值根据测试样品质量的不同，分别不超过2mg（5g样品时）或4mg（10g样品时）。

注：重复加热多次后，若油脂样品发生自动氧化导致质量增加，可取前几次测定的最小值计算结果。

5.结果计算

同沙浴法。

七、大豆油脂中磷脂的测定（GB/T 5537—2008）

1.适用范围

磷脂是由甘油、脂肪酸、磷酸、氨基醇和环醇等构成的化合物。本测定方法适用于植物原油、脱胶油及成品油。

2.原理

植物油中的磷脂经灼烧成为五氧化二磷，被热盐酸变成磷酸，遇钼酸钠生成磷钼酸钠，用硫酸联氨还原成钼蓝，用分光光度计在波长650nm测定钼蓝的吸光度，与标准曲线比较，计算其含量。

3.仪器和用具

①分光光度计：具1cm比色皿。

②分析天平：分度值0.0001g。

③马弗炉：可控制温度，主要使用温度在550～600℃。

④封闭电炉：可调温。

⑤沸水浴。

⑥瓷坩埚或石英坩埚：50mL、100mL能承受的最低温度为600℃。

⑦容量瓶：100mL、500mL、1000mL。

⑧移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

⑨比色管：50mL。

4.试剂和溶液

①盐酸：1.19g/mL。

②氧化锌。

③氢氧化钾。

④浓硫酸：1.84g/mL。

⑤钼酸钠。

⑥硫酸联氨。

⑦磷酸二氢钾：使用前在101℃下干燥2h。

⑧2.5%钼酸钠稀硫酸溶液：量取140mL浓硫酸，注入300mL水中，冷却至室温，加人12.5g钼酸钠，溶解后用水定容至500mL，充分摇匀，静置24h备用。

⑨0.015%硫酸联氨溶液：将0.15g硫酸联氨溶解在1L水中。

⑩50%氢氧化钾溶液：将50g氢氧化钾溶解在50mL水中。

1∶1盐酸溶液：将盐酸溶解在等体积的水中。

磷酸盐标准储备液：称取干燥的磷酸二氢钾0.4387g，用水溶解并稀释定容至1000mL，此溶液含磷0.1mg/mL。

标准曲线用磷酸盐标准溶液：用移液管吸取磷酸盐标准储备液10mL至100mL容量瓶中，加水稀释并定容，此溶液含磷0.01mg/mL。

5.操作步骤

（1）扦样

按GB/T 5524—2008中的规定执行。

（2）试样的制备

将装有实验室样品的容器置于50℃的干燥箱内，当样品温度达到50℃后，振摇使样品尽可能均匀。如果加热混合后样品没有完全澄清，可在50℃恒温干燥箱内将油脂过滤或用热过滤漏斗过滤。为避免脂肪物质因氧化或聚合而发生变化，样品在干燥箱内放置的时间不宜太长。过滤后的样品应完全澄清。

（3）绘制标准曲线

取六支比色管，按顺序分别注入磷酸盐标准溶液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL，再按顺序分别加水10mL、9mL、8mL、6mL、4mL、2mL。接着向六支比色管中分别加入0.015%硫酸联氨溶液8mL，2.5%钼酸钠稀硫酸溶液2mL。加塞，振摇3～4次，去塞，将比色管放入沸水浴中加热10min，取出，冷却至室温。用水稀释至刻度，充分摇匀，静置10min。移取该溶液至干燥、洁净的比色皿中，用分光光度计在650nm处，用试剂空白调整零点，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，含磷量（0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg）为横坐标绘制标准曲线。

（4）制备试液

根据试样的磷脂含量，用坩埚称取制备好的试样，成品油试样称量10g，原油及脱胶油称量3.0～3.2g（精确至0.001g）。加氧化锌0.5g，先在电炉上缓慢加热至样品变稠，逐渐加热至全部炭化，将坩埚送至550～600℃的马弗炉中灼烧至完全灰化（白色），时间约2h。取出坩埚冷却至室温，用10mL 1∶1盐酸溶液溶解灰分并加热至微沸，5min后停止加热，待溶解液温度降至室温，将溶解液过滤注入100mL容量瓶中，每次用大约5mL热水冲洗坩埚和滤纸共3～4次，待滤液冷却到室温后，用50%氢氧化钾溶液中和至出现混浊，缓慢滴加1∶1盐酸溶液使氧化锌沉淀全部溶解，加2滴。最后用水稀释定容至刻度，摇匀。制备被测液时同时制备一份样品空白。

（5）比色

用移液管吸取上述制备的被测液10mL，注入50mL比色管中。加入0.015%硫酸联氨溶液8mL，2.5%钼酸钠稀硫酸溶液2mL。加塞，振摇3～4次，去塞，将比色管放入沸水浴中加热10min，取出，冷却至室温。用水稀释至刻度，充分摇匀，静置10min。移取该溶液至干燥、洁净的比色皿中，用分光光度计在650nm下，用试样空白调整零点，测定其吸光度。

6.结果计算

试样中磷脂含量按式（3-7）计算：

　　（3-7）

式中　X——磷脂含量，mg/g：

P——标准曲线查得的被测液的含磷量，mg；

m——试样质量，g；

V1——样品灰化后稀释的体积，mL；

V2——比色时所取的被测液的体积，mL；

26.31——每毫克磷相当于磷脂的毫克数。

当被测液的吸光度值大于0.8时，需适当减少吸取被测液的体积，以保证被测液的吸光度值在0.8以下。

每份样品应平行测试两次，平行试样测定的结果符合精密度要求时，取其平均值作为结果，计算结果保留小数点后三位。

八、植物油脂肪酸含量的测定（GB 5009.168—2016）

1.适用范围

本测定方法适用于毛细管柱气相色谱内标法测定食品中总脂肪、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸。

水解-提取法适用于食品中脂肪酸含量的测定；酯交换法适用于游离脂肪酸含量不大2%的油脂样品的脂肪酸含量测定。

2.原理

（1）水解-提取法

加入内标物的试样经水解，乙醚溶液提取其中的脂肪后，在碱性条件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，经毛细管柱气相色谱分析，内标法定量测定脂肪酸甲酯含量。依据各种脂肪酸甲酯含量和转换系数计算出总脂肪、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量。动植物油脂试样不经脂肪提取，加入内标物后直接进行皂化和脂肪酸甲酯化。

（2）酯交换法

将油脂溶解在异辛烷中，加入内标物后，加入氢氧化钾甲醇溶液通过酯交换甲酯化，反应完全后，用硫酸氢钠中和剩余的氢氧化钾，以避免甲酯皂化。

3.试剂和材料

（1）试剂

①盐酸（HCl）。

②氨水（NH3·H2O）。

③焦性没食子酸（C6H6O3）。

④乙醚（C4H10O）。

⑤石油醚：沸程3.0～60℃。

⑥乙醇（C2H6O）（95%）。

⑦甲醇（CH3OH）：色谱纯。

⑧氢氧化钠（NaOH）。

⑨正庚烷［CH3（CH2）5CH3］：色谱纯。

⑩三氟化硼甲醇溶液，浓度为15%。

无水硫酸钠（Na2SO4）。

氯化钠（NaCl）。

异辛烷［（CH3）2CHCH2C（CH3）3］：色谱纯。

硫酸氢钠（NaHSO4）。

氢氧化钾（KOH）。

（2）试剂配制

①盐酸溶液（8.3mol/L）：量取250mL盐酸，用110mL水稀释，混匀，室温下可放置2个月。

②乙醚-石油醚混合液（1+1）：取等体积的乙醚和石油醚，混匀备用。

③氢氧化钠甲醇溶液（2%）：取2g氢氧化钠溶解在100mL甲醇中，混匀。

④饱和氯化钠溶液：称取360g氯化钠溶解于1.0L水中，搅拌溶解，澄清备用。

⑤氢氧化钾甲醇溶液（2mol/L）：将13.1g氢氧化钾溶于100mL无水甲醇中，可轻微加热，加入无水硫酸钠干燥，过滤，即得澄清溶液。

（3）标准品

①十一碳酸甘油三酯（C36H68O6；CAS号：13552-80-2）。

②混合脂肪酸甲酯标准品。

③单脂肪酸甲酯标准品。

（4）标准溶液配制

①十一碳酸甘油三酯内标溶液（5.00mg/mL）：准确称取2.5g（精确至0.1mg）十一碳酸甘油三酯至烧杯中，加入甲醇溶解，移入500mL容量瓶后用甲醇定容，在冰箱中冷藏可保存1个月。

②混合脂肪酸甲酯标准溶液：取出适量脂肪酸甲酯混合标准移至到10mL容量瓶中，用正庚烷稀释定容，储存于-10℃以下冰箱，有效期3个月。

③单脂肪酸甲酯标准溶液：将单脂肪酸甲酯分别从安瓿瓶中取出转移到10mL容量瓶中，用正庚烷冲洗安瓿瓶，再用正庚烷定容，分别得到不同脂肪酸甲酯的单标溶液，储存于-10℃以下冰箱，有效期3个月。

4.仪器设备

①匀浆机或实验室用组织粉碎机或研磨机。

②气相色谱仪：具有氢火焰离子检测器（FID）。

③毛细管色谱柱：聚二氰丙基硅氧烷强极性固定相，柱长100m，内径0.25mm，膜厚0.2μm。

④恒温水浴：控温范围40～100℃，控温±1℃。

⑤分析天平：感量0.1mg。

⑥旋转蒸发仪。

5.分析步骤

（1）试样的制备

在采样和制备过程中，应避免试样污染。固体或半固体试样使用组织粉碎机或研磨机粉碎，液体试样用匀浆机打成匀浆于-18℃以下冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。

（2）试样前处理

①水解-提取法。称取均匀试样0.1～10g（精确至0.1mg，约含脂肪100～200mg）移入到250mL平底烧瓶中，准确加入2.0mL十一碳酸甘油三酯内标溶液。加入约100mg焦性没食子酸，加入几粒沸石，再加入2mL 95%乙醇和4mL水，混匀。

在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠甲醇溶液8mL，连接回流冷凝器，（80±1）℃水浴上回流，直至油滴消失。从回流冷凝器上端加入7mL 15%三氟化硼甲醇溶液，在（80±1）℃水浴中继续回流2min。用少量水冲洗回流冷凝器。停止加热，从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温。

准确加入10～30mL正庚烷，振摇2min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正庚烷提取液大约5mL，至25mL试管中，加入大约3～5g无水硫酸钠，振摇1min，静置5min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定。

②酯交换法。适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品。

a.试样称取。称取试样60.0mg至具塞试管中，精确至0.1mg，准确加入2.0mL内标溶液。

b.甲酯制备。加入4mL异辛烷溶解试样，必要时可以微热，试样溶解后加入200μL氢氧化钾甲醇溶液，盖上玻璃塞猛烈振摇30s后静置至澄清。加入约1g硫酸氢钠，猛烈振摇，中和氢氧化钾。待盐沉淀后，将上层溶液移至上机瓶中，待测。

（3）测定

①色谱参考条件。取单脂肪酸甲酯标准溶液和脂肪酸甲酯混合标准溶液分别注入气相色谱仪，对色谱峰进行定性。

a.毛细管色谱柱：聚二氰丙基硅氧烷强极性固定相，柱长100m，内径0.25mm，膜厚0.2μm。

b.进样器温度：270℃。

c.检测器温度：280℃。

d.程序升温：初始温度100℃，持续13min；100～180℃，升温速率10℃/min，保持6min；180～200℃，升温速率1℃/min，保持20min；200～230℃，升温速率4℃/min，保持10.5min。

e.载气：氮气。

f.分流比：100∶1。

g.进样体积：1.0μL。

h.检测条件应满足理论塔板数（n）至少2000/m，分离度（R）至少1.25。

②试样测定。在上述色谱条件下将脂肪酸标准测定液及试样测定液分别注入气相色谱仪，以色谱峰峰面积定量。

6.结果计算

（1）试样中单脂肪酸甲酯含量

试样中单脂肪酸甲酯含量按式（3-8）计算：

　　（3-8）

式中　Xi——试样中脂肪酸甲酯i含量，g/100g；

Fi——脂肪酸甲酯i的响应因子；

Ai——试样中脂肪酸甲酯i的峰面积；

——试样中加入的内标物十一碳酸甲酯峰面积；

——十一碳酸甘油三酯浓度，mg/mL；

——试样中加入十一碳酸甘油三酯体积，mL；

1.0067——十一碳酸甘油三酯转化成十一碳酸甲酯的转换系数；

m——试样的质量，mg；

100——将含量转换为每100g试样中含量的系数。

脂肪酸甲酯i的响应因子Fi按式（3-9）计算：

　　（3-9）

式中　Fi——脂肪酸甲酯i的响应因子；

ρsi——混标中各脂肪酸甲酯i的浓度，mg/mL；

A11——十一碳酸甲酯峰面积；

Asi——脂肪酸甲酯i的峰面积；

ρ11——混标中十一碳酸甲酯浓度，mg/mL。

（2）试样中饱和脂肪酸含量

试样中饱和脂肪酸含量按式（3-10）计算，试样中单饱和脂肪酸含量按式（3-11）计算：

　　（3-10）

　　（3-11）

式中　XSaturated Fat——饱和脂肪酸含量，g/100g；

XSFAi——单饱和脂肪酸含量，g/100g；

XFAME i——单饱和脂肪酸甲酯含量，g/100g；

FFAMEi-FAi——脂肪酸甲酯转化成脂肪酸的系数。

（3）试样中单不饱和脂肪酸含量

试样中单不饱和脂肪酸含量（XMono-UnsaturatedFat）按式（3-12）计算，试样中每种单不饱和脂肪酸甲酯含量按式（3-13）计算：

　　（3-12）

　　（3-13）

式中　XMono-UnsaturatedFat——试样中单不饱和脂肪酸含量，g/100g；

XMUFAi——试样中每种单不饱和脂肪酸含量，g/100g；

XFAMEi——每种单不饱和脂肪酸甲酯含量，g/100g；

FFAMEi-FAi——脂肪酸甲酯i转化成脂肪酸的系数。

（4）试样中多不饱和脂肪酸含量

试样中多不饱和脂肪酸含量（XPoly-UnsaturatedFat）按式（3-14）计算，每种多不饱和脂肪酸含量按式（3-15）计算：

　　（3-14）

　　（3-15）

式中　XPoly-UnsaturatedFat——试样中多不饱和脂肪酸含量，g/100g；

XPUFAi——试样中每种多不饱和脂肪酸含量，g/100g；

XFAMEi——每种多不饱和脂肪酸甲酯含量，g/100g；

FFAMEi-FAi——脂肪酸甲酯转化成脂肪酸的系数。

（5）试样中总脂肪含量

试样中总脂肪含量按式（3-16）计算：

　　（3-16）

式中　XTotalFat——试样中总脂肪含量，g/100g；

Xi——试样中每种脂肪酸甲酯i含量，g/100g；

FFAMEi-TGi——脂肪酸甲酯i转化成甘油三酯的系数。

结果保留三位有效数字。