1-3 透射电子显微镜样品的制备
【实验目的】
1.掌握透射电子显微镜的成像原理与制样方法；
2.学习观察生物样品亚细胞结构。
【实验原理】
电子显微镜主要分为两类：一类为透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM），简称为透射电镜；另一类为扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM），简称为扫描电镜。
透射电镜依靠透射电子成像，分辨率高，视场小，广泛应用于样品局部切片的超微结构和纳米材料等。而扫描电镜利用二次电子成像，分辨率高，图像立体感强，主要用于样品表面及其断面立体形貌的观察。二者制样技术也有不同，透射电镜主要使用超薄切片技术、负染技术、投影技术和复型技术等。而扫描电镜则主要使用临界点干燥（critical point drying）技术、冷冻干燥技术、蚀刻技术、组织导电技术和切片腐蚀技术等。
电子显微镜的发展与物理学具有密不可分的关系。1926年，德国物理学家Busch提出了用轴对称的电场和磁场对电子束进行聚集，发展成电磁透镜；1932年，德国科学家Max Knoll和Ernst Ruska研制出第一台透射电镜（点分辨率达到50nm）。之后，商品化的电子显微镜开始出现。1939年，德国西门子公司生产了第一台透射电镜。我国于1959年由中科院长春光学精密机械与物理研究所研制出第一台透射电镜。扫描电镜发展较透射电镜稍晚。1965年，英国剑桥科学仪器有限公司研制出商品化的扫描电镜。我国于1975年由中科院北京科学仪器厂研制出第一台扫描电镜。
在此，我们主要介绍透射电子显微镜的原理（图1-3-1），以及植物组织样品的超薄制样技术。
透射电镜主要由四部分组成：照明系统，包括电子枪和聚光镜；成像系统，包括物镜、中间镜和投影镜等；真空系统以及记录系统等。
照明系统的电子枪由阴极、控制极、阳极构成。阴极灯丝一般为金属钨，加电压后产生热电子，形成电子束。阳极与阴极相对，用以加速由阴极发射的电子束。控制极位于阴、阳极之间，可通过改变电子枪中电场分布作用来控制电子束的发射。从电子枪发射出的电子束，束斑尺寸大，相干性与平行性差。为此，需经两级聚光镜进一步将电子束会聚成近似平行的照明束。
图1-3-1 透射电子显微镜原理图（修改自吴晓京，2002）
成像系统是电子显微镜的核心，由三级电磁透镜组成。电子束通过聚光镜之后便进入样品室，透过样品的电子束接下来要经过物镜聚焦。物镜是短焦强磁透镜，使试样形成一次放大像，其放大倍数一般为100～300倍。电镜的分辨率主要取决于物镜，因而必须尽可能降低像差。目前高质量物镜分辨率可达0.1nm左右。另外，现代电镜都会在物镜上加装光阑进一步减少球差。中间镜是长焦距弱磁可变倍率透镜，能把物镜形成的一次中间像投射到投影镜物面上。调整中间镜的电流，可以改变放大倍数。位于透镜组最下端的投影镜是短焦强磁透镜，能把中间镜形成的二次像放大到荧光屏上，使试样最终放大到约100万倍的大小。有的电镜会装有两个投影镜。电镜的总放大倍数即三级电磁透镜倍数的乘积。
电镜对真空具有严格的要求。由于电子束在大气中自由射程短，与气体分子的碰撞会发生电离放电，造成能量损失。样品也同样有可能被气体分子污染。另外，灯丝容易被氧化，真空度不好会降低其使用寿命。因而电镜需要良好的真空系统。电镜真空泵有多种类型，在此不再详述。
记录系统有观察窗、荧光屏、照相室或高分辨率CCD等。观察窗由一定厚度铅玻璃组成，可以防护X射线。荧光屏涂有荧光粉，在电子束照射下产生绿色荧光，使电子像转换为肉眼可见图像。旧式电镜一般采用照相底片进行感光记录。但现在新型电镜普遍采用高分辨率CCD进行电子记录，可在电脑中直接保存图像。
透射电镜常用50～200 kV电子束，由于电子穿透能力较弱，因而样品厚度一般控制在60～100nm，所以需要将样品制成超薄切片。制样技术是得到优良电镜图片的关键。另外，由于采用电子束成像，样品需要有较高的电子密度，所以超薄切片还需要用重金属盐溶液进行染色。之后在铜网的承载下装入样品杆，放入真空样品室进行观察。
样品制备包括取材与固定、脱水、浸透、超薄切片以及染色等步骤。
样品取材的原则可以简单总结为“小、快、准、狠”。组织块要小于1mm3，取样要快，用锋利的刀片准确截取需要观察的部位。取样后，要将组织材料尽快固定。即采用化学试剂或冷冻、干燥及高温等物理方法迅速杀死细胞，使细胞组织瞬间停止生命活动，其内含物会立即凝固而不瓦解，并尽可能使细胞中的各种细胞器及大分子不发生位移。
固定液一般用缓冲液稀释，常用的缓冲液有PBS、二甲砷酸盐缓冲液等，前者对材料具有生理保护作用，且无毒，应用广泛。后者适用于免疫电镜以及与细胞化学有关的电镜实验，但有毒性，使用要小心。一般缓冲液pH用于动物组织时为7.2～7.4，用于植物材料时为6.8～7.0，而高度含水组织则为8.0～8.4。
固定方法也有多种选择，但以双固定法应用最广泛，效果最好。这种方法一般先将材料用2%～3%的戊二醛或者2%～4%的多聚甲醛进行前固定，再用1%的锇酸进行后固定。注意：固定液要新鲜配制。
甲醛分子较小，对生物材料的渗透能力强于戊二醛，并能保存样品中酶的活性。但甲醛不能较好固定细胞基质。适于临床取材，对组织尺寸没有严格的限制。常与戊二醛混合使用。
戊二醛渗透快，对蛋白质交联速度快。不能保存脂肪，对磷脂固定效果较差，细胞膜显示欠佳。适用样品较长时间保存及远距离取材。
锇酸，即四氧化锇，具有固定和电子染色双重作用。对脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白固定效果较好，不与RNA和DNA反应，不能固定糖原，低浓度锇酸不保存微管。由于其分子较大，导致渗透速度慢，但作为强氧化剂，其反应速度快。锇酸极易挥发，对黏膜及角膜刺激性大，在使用时应注意个人防护。
包埋剂的选择也至关重要。理想的包埋剂应与脱水剂有较好的相容性；渗透与包埋期间对细胞成分抽提少，能良好保持组织细微结构；在聚合期间不能引起样品收缩；切片时有较好的均匀性和硬度；不妨碍染液对超薄切片的浸染；在高放大倍数下不显示任何包埋剂的结构，具有非常低的背景。
【试剂与器材】
1.0.2mol/L PBS：0.2mol/L Na2HPO4，0.2mol/L NaH2PO4，pH7.0.
2.2.8%戊二醛（Sigma）：用0.2mol/L PBS稀释，用前加入Triton X-100至终浓度为0.02%（体积分数）。
3.醋酸双氧铀，工作浓度一般为2%，用50%乙醇或超纯水配制，并于4℃保存，出现沉淀或者变色说明已经失效，不能再使用。
4.柠檬酸铅工作液：在10mL超纯水中加入0.01～0.04g柠檬酸铅，并加入10mol/L NaOH 0.1mL，混匀，以防止碳酸铅沉淀产生。
5.1%锇酸：用0.2mol/L PBS配制，用前加入Triton X-100至终浓度为0.02%（体积分数）；锇酸为剧毒化学品，使用应注意安全防护。
6.Spurr包埋树脂（SPI）硬配方：VCD树脂10g, DER7368g, NSA 25g, DMAE 0.3g，混合均匀，于4℃保存。
7.LR White包埋树脂配方：LR White 100g中加入催化剂过氧化苯甲酰（benzoyl perox-ide）1.998g，充分振荡混匀后，于4℃保存。
8.0.3%方华（Formvar，聚乙烯醇缩甲醛）溶液，无水乙醇（分析纯），丙酮（分析纯）。
循环水式多用真空泵（SHD-Ⅲ，阳光科教）；台式电热恒温培养箱（WP25，天津泰森特）；超薄切片机（EM UC7，Leica）；20 kV透射电子显微镜（G220 Twin, Tecnai）；铜网等。
【实验步骤】
准确截取需要观察的组织块，体积小于1mm3。样品固定采用双固定法，具体操作如下：
1.将样品浸泡到2%～3%的戊二醛固定液中，对于植物材料，由于细胞壁和液泡阻碍固定液迅速渗入，一般需用真空泵抽气2～4h，时间根据样品幼嫩程度而异，一般判断标准是恢复到正常大气压后，样品能沉入固定液底部即可，并4℃固定过夜。
2.漂洗：用0.1mol/L PBS将材料漂洗3次，以洗去固定液，每次15min。
3.固定：用1%锇酸避光固定材料，应置于4℃冰箱中，固定24h。
4.漂洗：用0.1mol/L PBS将材料漂洗3次，每次15min。
使用梯度浓度的有机溶剂将样品中的水分置换。一般选取乙醇（或丙酮），按照如下梯度进行：20%乙醇15min→30%乙醇15min→40%乙醇15min→50%乙醇15min→60%乙醇15min→70%乙醇15min（可在此步短暂存放样品，保存于4℃）→80%乙醇15min→90%乙醇15min→100%乙醇15min，最后应在100%乙醇中多次脱水，每次15min。
梯度脱水时间也因样品幼嫩程度而异，对于表面附有蜡质、较硬或机械强度较大的样品可以适当延长脱水时间。
样品脱水完成后，需要使用梯度浓度的包埋剂置换出样品中的乙醇。一般选取的包埋剂有LR White树脂和Spurr树脂：
1.LR White为水溶性树脂，需要在无氧条件下，在催化剂引发下聚合。样品脱水完成后，以1:1的比例加入无水乙醇和LR White树脂，混匀后室温渗透4h以上（也可过夜）。接着将样品转移至纯LR White树脂中，室温渗透2h以上（也可过夜）。最后将渗透好的样品放入包埋用模具中（一般用EP管或胶囊），加入纯LR White树脂，没过样品。在65℃条件下严格无氧聚合24h至树脂凝固。
2.Spurr属于环氧树脂类，需要将若干树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂按比例配制。将脱水完成的样品放到EP管中，按照如下比例依次浸透样品，并用封口膜封住，放到旋转仪上进行充分浸透：
3/4丙酮+1/4 Spurr包埋剂2～4h→1/2丙酮+1/2 Spurr包埋剂过夜→1/4丙酮+3/4 Spurr包埋剂10～12h→100%Spurr包埋剂过夜→100%Spurr包埋剂10～12h→100%Spurr包埋剂过夜（开盖敞开挥发丙酮），最后将渗透好的样品放入包埋模具中，用纯Spurr包埋剂没过样品，60℃聚合2d至树脂凝固。
已经凝固并包埋有样品的树脂需要保存在干燥的环境中，在湿度大的环境下机械强度会降低，影响切片效果。
包埋时使用的模具主要有塑料EP管、橡胶包埋槽、胶囊等。LR White一般使用EP管或胶囊，因为可以密封隔绝空气利于聚合，另外样品一般沉在管底尖端，便于修块。橡胶包埋槽具有整齐排列的开放性的凹槽，适用于Spurr树脂的包埋，并且样品可以进行定向，便于切片。
超薄切片是指将包埋后组织切成纳米级切片，并附着在电镜载网上的过程。该过程一般包括包埋块的修整、半薄切片定位、超薄切片三步工作。
首先对包埋好的样品进行修块，修去多余的树脂，使样品被局限在很小的体积内，切面大小一般在0.5mm2，上下边要平行。用于半薄切片和超薄切片的刀有两种：玻璃刀和钻石刀。玻璃刀是通过制刀机将长玻璃条切割断裂而成。其价格低廉，制作方便；但性质不稳定，容易被氧化变钝，因而不能长期存放，需要现做现用。而钻石刀性质较为稳定，容易获得高质量切片。但价格昂贵，容易损伤，使用时必须特别注意。在实际切片过程中，一般先用玻璃刀进行半薄切片（切片厚度1～3μm），将样品定位到自己想要观察的位置。对半薄切片染色并用光学显微镜镜检符合要求后，再进一步修块，换用钻石刀进行超薄切片（切片厚度100nm左右）。超薄切片需要用水槽承接，并用附有一层方华膜的铜网捞出来。
生物样品的图像反差来源于样品对电子束的散射能力。原子序数越高，电子密度越高，散射电子的能力越强。但是生物样品主要由C、H、O、N、P、S等低原子序数的元素组成，未经染色的超薄切片反差很弱。因此，需使用重金属盐溶液进行染色，以增强样品反差。一般电镜样品采用醋酸双氧铀-柠檬酸铅染液进行双染色。
醋酸双氧铀主要以提高核酸、蛋白质和结缔组织显微的反差为主，对膜染色效果较差。柠檬酸铅密度大，对细胞膜以及脂类染色效果好。二者联用可以取长补短，达到很好的效果。
样品首先用2%醋酸双氧铀染色1h。由于铜网很小，操作需要很小心，一般将染液滴到塑料膜上，再将铜网载有样品的一侧放到染液滴上，并加上盖子防止蒸发。此方法一般称为“小液滴染色法”。染色完毕后，用镊子小心夹起铜网，置于盛有超纯水的小烧杯中温柔上下抖动冲洗。重复2～3次后，用滤纸轻轻吸去水滴，干燥。接下来同样用小液滴染色法，对样品用柠檬酸铅染色1～10min，并用超纯水清洗2～3次，干燥后，便可置于上样杆中，进行透射电镜观察。
【结果与分析】
图1-3-2 水稻雄蕊药室四层壁细胞电子显微图片
（宋巍提供，胡迎春老师帮助制样）
E，表皮层；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层
【注意事项】
1.锇酸为剧毒化学品，使用应注意安全防护，并于通风橱中进行操作；
2.醋酸双氧铀具有放射性，应注意防护；
3.使用LR White树脂包埋要严格厌氧。
【参考文献】
1.陈力.1998.生物电子显微术教程.北京：北京师范大学出版社.
2.姚骏恩.2002.我国电子显微镜的研制与发展.电子显微学报，21（3）：345-358.
3.付洪兰.2004.实用电子显微镜技术.北京：高等教育出版社.
4.吴晓京.2002.现代大型分析测试仪器系列讲座之二：透射电子显微镜.上海计量测试，（3）.