第三节　天然药物化学成分鉴定

天然药物化学成分是药用动植物在生长过程中积累的化学物质，包括糖类、苷类、醌类化合物、苯丙素类（包括简单苯丙素、香豆素、木脂素）、黄酮类、萜类、挥发油、生物碱类、甾体类、三萜类、鞣质等多种类型，反映了植物科、属、种的特征，具有多种多样的生物活性，是天然药物发挥药效的物质基础。从天然药物中提取分离得到单体成分之后，需要对单体成分的结构进行鉴定，只有在结构明确的基础上，才能进行构效关系、结构改造等进一步的研究工作。因此，天然药物化学成分的结构研究是天然药物化学的一个重要环节。结构研究一般按下面的过程进行。

从天然药物中分离到的活性成分多种多样，许多化合物的结构还很复杂，随着科学技术的进步，特别是紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、质谱（MS）和核磁共振谱（NMR）的相继问世，天然药物化学成分的鉴定方法发生了巨大的变化，结构测定工作趋向于微量化、快速化和准确化。

一、天然药物化学成分的鉴定顺序

对于一种未知天然化合物而言，其结构鉴定的次序为：

对于一种已知天然化合物而言，其结构鉴定的一般程序是：

（1）测定样品的熔点，与已知品的文献值对照，比较是否一致或接近。

（2）测定样品与标准品的混熔点，看所测定的熔点值是否下降。

（3）将样品与标准品分别点于同一薄层色谱或纸色谱上，比较其Rf值是否一致。

（4）测定样品的红外光谱图，与标准品的红外光谱或标准谱图进行比较，看其是否完全一致。

获得真正的单体是鉴定和研究结构的前提。纯度不合格，会给结构测定工作带来更大难度，甚至会导致结构测定工作的失败。熔点、沸点、密度、比旋度、折射率等物理常数的测定，都有利于有效物质纯度的确定。对于结晶型的有机物需要测定其熔点、比旋度；如果是液体化合物则需要测定其沸点、相对密度、折射率及比旋度等。

（1）高分辨质谱（HR-MS）法　目前确定分子式最常用的是质谱法（MS）。高分辨质谱法（HR-MS）不仅可给出化合物的精确分子量，还可以直接给出化合物的分子式。也可通过质谱中出现的同位素峰的强度推定化合物的分子式。得到一个化合物的实验式后，还要进一步用场解吸质谱、快原子轰击质谱或制备衍生物再测定其质谱等方法测定它的分子量，以求得化合物的分子式。高分辨质谱仪可将物质的质量精确测定到小数点后三位，是目前测分子量最精确的方法。例如，表1-5中所列C8H12N4、C10H12N2O、C10H12O2、C10H16N2四种化合物的分子量同为164，但精确质量并不相同，在高分辨率质谱仪中很容易进行区别。

分子式确定后，即可按下式求算分子的不饱和度（以u表示）：

u=NⅣ-++1

式中，NⅠ为一价原子（如H）的数目；NⅢ为三价原子（如N、P）的数目；NⅣ为四价原子（如C、Si）的数目。O、S等二价原子与不饱和计算无关，故不予考虑。

（2）元素分析法　有时化合物的分子离子峰不稳定，难以用HR-MS测出，确定分子式需要进行元素定性分析，检查含有哪几种元素，并测定各元素在化合物中所占的百分含量，从而求出化合物的实验式。元素的定性定量分析现在多用自动元素分析仪测定，通过元素分析的方法，确定化合物组成元素的种类和比例，从而求出化合物的分子式。

例如，从刺果甘草根中分得某白色晶体，元素定性分析表明该白色晶体只含C、H、O三元素，元素定量分析的结果如下：C 79.35%，H 10.21%。可知O元素的含量=100%-79.35%-10.21%=10.44%。三种元素在分子结构中所占比例为：

C：79.35÷12=6.61

H：10.21÷1=10.21

O：10.44÷16=0.65

化合物分子结构中原子个数比为：6.61∶10.21∶0.65=10.17∶15.71∶1≈10∶16∶1。因此，该化合物实验式为C10H16O，分子式为（C10H16O）n，n=1，2，3…

确定化合物分子式后，就需要推断官能团和分子结构。一般需要测定并解析化合物的有关光谱学数据，如该样品的紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱和质谱；测定其有关理化常数，如不同pH、不同溶剂中的溶解度及灼烧实验、化学定性反应等。综合分析所得的信息，并结合文献调研，对化合物的结构类型、基本母核、所含官能团种类及结构中含有的芳环数或双键等进行推导和综合分析，以确定化合物可能含有哪些功能团，具何种母核，属于哪类化合物，从而推定化合物的分子结构。

确定待测样品的分子结构骨架主要依靠各类天然药物化学成分的呈色反应，如羟基蒽醌类化合物通过碱液显色反应检识；黄酮类化合物可用盐酸-镁粉反应、四氢硼钠还原反应等鉴定；强心苷类化合物可利用甾体母核、α，β-五元不饱和内酯环和α-去氧糖等各种呈色反应的结果综合考虑加以判断；苷类化合物则可以通过各种水解反应，然后再以各种呈色反应及色谱对照，分别鉴定生成的苷元及糖的种类等。官能团的确定可利用样品与某种试剂发生颜色变化或产生沉淀等进行判断。

在进行天然药物化学成分的提取、分离、精制过程中，往往可获得对该化合物的部分理化性质（如酸碱性、极性、色谱行为等）的认识，常可为判断该化合物的基本骨架或结构类型提供重要的参考依据。例如饱和脂肪酸类成分一般呈白色蜡状或片状结晶，极性较小，易溶于亲脂性溶剂，在甲醇等极性溶剂中很容易析出结晶，在硅胶薄层色谱展开时，需要展开剂的极性较小，展开后斑点无荧光，当用含浓硫酸的显色剂显色后烘烤时，显浅蓝色条状斑点，拖尾很严重，若在展开剂中加入少许冰醋酸后再展开，拖尾现象明显改善。

此外，由于同科、同属生物常含有相同或类似的化合物，在进行天然药物化学成分的结构鉴定时，应对文献中有关其原生物或近缘生物成分的报道进行调查，这对于确定化合物的结构骨架会有很大的帮助。

通过一定的依据判断待测样品可能为已知化合物时，在有对照品的情况下，测定物理常数（包括熔点、沸点、比旋度、折射率和密度等）。如果样品与对照品的物理常数相同，色谱中的Rf值相同，则可判定样品与对照品为同一化合物。如果欲鉴定的化合物为文献中记载的物质时，应测定该化合物及衍生物的各种波谱以确定其化学结构。在此基础上，综合运用经典的理化方法和各种波谱法，对单体化学成分进行鉴定或结构测定。此时如已推测出该化合物的结构类型，则应充分查找有关该结构类型、结构确定的最新文献。此外，考察它们的生物合成途径，也有助于确定其化学结构。

近代各种波谱法，在鉴定或确定天然药物化学成分的化学结构中，发挥着极为重要的作用。化合物结构的确定往往是化学分析、仪器分析、植物化学分类学及文献工作的相互配合、综合分析而获得的结果。

二、结构测定常用的波谱分析

紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱和质谱等近代波谱技术属于仪器分析的范畴，是测定天然产物成分结构的重要手段，已成为广大药学工作者必须掌握的一门技术。它的优点是所需样品少，分析速度快，结果准确。

紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长（200～400nm）的紫外光，由低能级（基态）跃迁到高能级（激发态）而产生的一种光谱。所吸收能力的大小ΔE与化合物键的类型有关，也就是与化合物的结构有关。分别测量特定溶液的吸光度，并用波长对吸光度和摩尔吸光系数作图，得到的图谱就是紫外吸收光谱图（见图1-15）。

紫外光谱在有机化合物结构研究中的应用主要有以下几方面。

（1）确定未知化合物是否含有与某已知化合物相同的共轭体系　当未知化合物与已知化合物（或称模型化合物）的紫外光谱形状一致时，可以认为两者具有相同的共轭体系。若有对照品时，通常将样品与对照品在相同条件下的紫外光谱进行对照，若两个化合物相同，其紫外光谱应完全相同。但要注意，紫外光谱相同，只能反映两者均含有某一特定的共轭体系，分子结构不一定完全相同。若无对照品，可查找有关光谱文献进行核对，此时一定要注意测定溶剂等条件与文献一致。

（2）确定未知结构中的共轭结构单元　紫外光谱是研究不饱和有机化合物结构的常用方法之一。对于确定分子中是否含有某种发色团（即不饱和部分的结构骨架）是很有帮助的，具体方法是：

① 将λmax的计算值与实测值进行比较　当用其他物理或化学方法判断某化合物的结构为A或B时，则可分别计算出A和B的λmax，再与实测值进行对照。

② 与同类型的已知化合物UV光谱进行比较　结构复杂的有机物，尤其是天然药物化学成分，难以精确地计算出λmax，故在进行结构分析时，经常将样品的紫外光谱与同类型的已知化合物紫外光谱进行比较。根据该类型化合物的结构——紫外光谱变化规律，判断两者的结构类型是否相同。

红外光谱是研究分子运动的吸收光谱，能充分反映功能团与波长的关系，所以对确定未知物的结构非常有用。

采用2.5～15μm范围内的不同波长为光源，通过依次照射样品，化合物分子中各种基团选择性地吸收待定波长的电磁波后，产生化学键的振动和转动，从而形成红外吸收光谱。

红外光谱图中的横坐标用波数σ（cm-1）或波长λ（μm）表示，纵坐标用百分透光度（T）表示，也有用吸光度（A）表示的。由于纵坐标是百分透光度而不是吸光度，所以红外吸收光谱曲线和紫外吸收光谱曲线的峰是相反的，即红外吸收光谱中的吸收峰，实际是向下的“谷”。波长与频率的关系式如下：

（cm-1）=

红外吸收光谱是化合物分子结构的客观反映。某个化合物的红外光谱图同它的熔点、沸点等物理常数一样，是该化合物的特征，尤其是有机化合物的红外吸收峰多达几十个，就如人的指纹彼此各不相同。因此，用来研究天然产物成分的结构既简便迅速又可靠，应用十分广泛。应用红外光谱测定分子中的基团，是利用各基团的特征吸收峰所出现的波长、强度和形状来判断的。具有不同功能团和化学键的化合物的IR吸收特征是不同的。这为未知成分化学结构的推测与确定，提供了极有价值的资料。

关于吸收峰位置与分子结构的关系，已总结了一些规律，通常将红外光谱图划分为九个区段（见表1-6）。根据表中的数据，可了解化合物红外光谱的特征；反之，也可根据红外光谱特征，初步推测化合物中可能存在的特征基团，为进一步确定化合物的结构提供信息。

核磁共振是具有磁矩的原子核（如1H、13C）在磁场作用下，以射频进行照射，产生能级跃迁而获得的共振信号。记录吸收信号强度，对应其吸收频率作图所得的图谱即为核磁共振谱。

核磁共振谱中最常用的有氢谱（1H NMR）和碳谱（13C NMR）。

（1）氢核磁共振谱　又称质子核磁共振谱，此谱所提供信息有 1H的类型、1H的数目及相邻原子或原子团情况，对于天然药物成分的结构测定具有非常重要的意义。

（2）碳核磁共振谱　13C NMR谱比1H NMR谱作用更大，13C NMR谱图没有积分曲线，但13C的化学位移比1H大得多，并且13C核与直接相连的1H核也会发生偶合作用。在决定天然药物化学成分（也叫碳化合物）结构时，与1H NMR相比，13C NMR无疑更为重要。碳谱和氢谱的相互补充，已成为研究天然产物化学成分结构不可缺少的工具。

解析核磁共振图谱一般可按下述步骤进行：首先观察可以区分的吸收峰及其化学位移，根据化学位移推测该峰可能归属的化学结构；然后通过比较偶合常数，找出自旋偶合裂分的吸收峰，考察发生相互偶合的核之间的氢原子数目；再由积分曲线计算出相应吸收峰的原子数目；并观察峰的形状，确定基团与基团之间的关系，推测化合物的结构；最后结合化合物的理化性质及IR、UV、MS等结果确定化合物的结构式，必要时可与化合物的标准NMR谱比较核实。

化合物的分子受到高能量电子流撞击失去一个电子而成为带正电荷的离子，电离后分子在高能电子撞击后又再碎裂成不同质量的碎片离子，这些离子在电场和磁场的作用下，按质量大小排列成谱，记录下来的图谱即为质谱。用质谱来测定分子式和相对分子质量是目前最快速和最准确的方法，同时也是研究有机分子结构强有力的工具之一。

在研究天然药物化学成分结构时，应根据待测成分的性质选择合适的质谱类型。极性较小的化学成分，如结构中不含糖基的苷元结构、脂肪酸等成分，可选择EI-MS，可以得到强的分子离子峰［M］+，且常为基峰，从而得到化合物的分子量，无需做成衍生物即可进行测定。

对于极性大、难以气化及对热不稳定的化学成分，如苷类化合物，在EI-MS中往往看不到分子离子峰，须制成甲基化、乙酰化或三甲基硅烷化等适当的衍生物，才能在EI-MS中观察到分子离子峰。对于这类极性大、难以气化及对热不稳定的化学成分，可以使用场解吸质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）及电喷雾质谱（ESI-MS）等软电离质谱技术，能够直接进行测定，且能获得很强的分子离子峰［M］+或准分子离子峰，若是苷类化合物，还能同时获得有关苷元及糖基部分的重要结构信息，为苷类化合物的结构确定提供了重要的依据。

由于质谱法样品用量少，提供信息多，尤其是色谱-质谱联用系统的出现，使质谱分析法在有机化合物结构分析中占有更重要的地位。目前，质谱分析法正广泛应用于化学、化工、石油、半导体、医药卫生、环境科学等各方面，并已成为化合物结构测定非常重要的工具。