第二节　沉淀技术

沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。沉淀一般只能达到初步纯化的目的，此技术较为成熟，目前广泛应用于实验室和工业规模蛋白质等生物产物的回收、浓缩和纯化。通过沉淀，既可使目的物沉淀下来，也可将杂质沉淀下来，使目的物留于上清液中。据沉淀机理的不同，其可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。

对于许多药品生产来说，去除沉淀剂是必不可少的操作。食品和药品中都不得含有沉淀剂，回收沉淀剂既是保证产品质量的需要，也是降低生产成本的需要，尤其是价值高的亲和沉淀剂。经典的操作是用洗涤法，用少量水或缓冲液将沉淀物中的其他杂质重新溶解，利用溶解度的不同将目的物与杂质相互分离。如果沉淀剂和目的物在缓冲液中都溶解，可用超滤或色谱的方法将它们分离。

蛋白质的相对分子质量在（1～100）万之间，其颗粒大小属于胶体离子的范围，又由于其表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的胶体溶液。可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度来降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀，而这两个因素又与溶液性质（如电解质的种类、浓度、pH等）密切相关。所以蛋白质的沉淀可采用加入无机盐的盐析法、加入酸碱调节溶液的pH的等电点沉淀法、加入水溶性有机溶剂的有机溶剂沉淀法等。

一、盐析法

水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（0.15～0.2mol/L）最大，低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。不同的蛋白质盐析时所需的盐的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的（见表1-3）。不仅蛋白质，许多生化物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如20%～40%饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀；使用43%饱和度的硫酸铵也可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清液中。但盐析法应用最广的还是在蛋白质领域内。

常用的盐析用盐包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等。其中硫酸铵价格便宜；溶解度大且受温度影响很小，在25℃时其溶解度为766g/L；硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来；且对酶没有破坏作用，所以在生产中应用最普遍。

盐析操作时加入固体硫酸铵粉末，加入时速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解并防止局部浓度过高。为确定盐析剂硫酸铵的用量，可通过查表求硫酸铵水溶液由原饱和度达到所需饱和度时每升溶液应加硫酸铵的量（见表1-4）。

二、有机溶剂沉淀法

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数（表1-5是一些物质的介电常数），使溶质之间的静电引力增加，聚集形成沉淀，并且水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，使溶质分子表面水化层被破坏，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，从而沉淀析出。

由表1-5可以看出，乙醇、丙酮的介电常数都很较低，是最常用的沉淀用溶剂。2.5mol/L甘氨酸的介电常数很大，可以作为蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。

与盐析法相比，有机溶剂沉淀法的优点是分辨率高于盐析；乙醇等有机溶剂沸点低，易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易。但该法易使蛋白质等生物大分子变性。有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，因此，在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行，最好在0℃以下。为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作时还应不断搅拌，溶剂应少量多次加入。同时，为了减少有机溶剂对蛋白质的变性作用，得到的酶蛋白沉淀不要放置过久，要尽快加水溶解。

乙醇沉淀法早在20世纪40年代就应用于血浆蛋白质（如血清白蛋白）的制备，目前仍用于血浆制剂的生产。除此之外，乙醇还常用作许多食用级和药用级酶制剂的沉淀剂。实际操作中，乙醇的用量应根据试验来确定。

三、等电点沉淀法

两性电解质在溶液pH处于等电点时，分子表面电荷为零，导致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶液的pH，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作称为等电点沉淀法。

不同的两性生化物质，等电点不同。以蛋白质为例，不同的蛋白质具有不同的等电点，根据这一特性，用依次改变溶液pH的办法，可将不同的蛋白质分别沉淀析出，从而达到分离纯化的目的。

通常情况下，两性电解质在等电点及等电点附近仍有相当的溶解度（有时甚至比较大），用等电点沉淀法往往沉淀不完全，加上许多生物分子的等电点比较接近，故很少单独使用等电点沉淀法，往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀法一起使用。

等电点沉淀法可用于所需生化物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，在实际工作中普遍用等电点沉淀法作为去杂手段。如从猪胰脏中提取胰蛋白酶原（pI=8.9）时，在粗提取液中先调pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质（pI≈3.0）。

与盐析法相比，等电点沉淀的优点是无需后继的脱盐操作，但在采用该法时必须注意溶液pH不会影响到目的物的稳定性，且一般要在低温下操作。