放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）的基本原理是，采用限量放射性核素标记的抗原［*Ag］和可变量的非标记待测抗原［Ag］与定量的特异抗体［Ab］发生竞争性免疫结合反应，通过测定复合物［*Ag-Ab］的放射性来计算出待测非标记抗原的量。这种竞争关系可以用下列反应式表示：

上式中的代表符号：*Ag（定量标记抗原）；Ab（限量的特异性抗体）；Ag（未知量非标记抗原）；*Ag-Ab（标记抗原抗体复合物）；Ag-Ab（非标记抗原抗体复合物）。

由于*Ag与Ag两者的免疫活性完全相同，即对Ab具有同样的亲和力。当*Ag、Ag、Ab三者处于同一反应体系中时，由于*Ag和Ab为恒量，若*Ag和Ag的总量大于Ab上的有效结合位点时，*Ag与Ag即进行竞争结合反应，*Ag-Ab的形成量随着Ag量的增加而减少。即Ag量的增加将抑制*Ag与Ab的结合，致使*Ag-Ab的形成量减少、游离的*Ag量相应增加。因此，测定*Ag-Ab或*Ag的量即可推算出被测的Ag量。这种现象称为竞争结合反应（competitive binding reaction），这种*Ag-Ab的量（因变量）与Ag量（自变量）之间存在的竞争性抑制的函数关系，是RIA的定量基础。分析中，首先以不同已知量的标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以*Ag-Ab的结合复合量（B或B%）、或*Ag的游离量（F或F%）、或R（R = F/B）为纵坐标；以标准品Ag为横坐标的剂量效应的竞争抑制曲线（也称标准曲线）来表示。然后以未知样品Ag测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应Ag的剂量。

放射免疫分析（RIA）试剂盒由国家批准的生产单位提供，使用者应按说明书的要求合理使用。一般试剂盒都包括三种主要试剂：抗体、标记抗原、非标记标准抗原（标准品）。很多试剂盒还提供分离试剂或材料、缓冲液及质量控制用的样品等。

合格抗体应具备三个条件，即高亲和力、高特异性、高滴度。高亲和力的抗体是高质量RIA的前提。只有这样的抗体才能获得高灵敏度和高精密度的标准曲线。抗体的高特异性非常重要，待测样品中往往含有与待测物质结构相近的类似物，如果抗体特异性不高，则类似物也能与抗体结合，影响分析结果的准确度。

目前，RIA用的抗体大多由专门的研究单位或生产RIA试剂盒的厂家提供。可能是多克隆（polyclonal），也可能是单克隆（monoclonal）抗体。一般说前者容易达到高亲和力，后者的特异性更好，而且后者可使抗体的来源得到长期保证。

对标记抗原的主要要求是：①比活度和放化纯度必须足够高，以保证分析的灵敏度；②半衰期不能太短，以便完成运输、保存和整个分析过程；③不改变原有抗原的特性（特异性、亲和力、免疫活性等）。基于以上要求，目前大分子抗原（蛋白质）主要用 ¹²⁵I标记。小分子半抗原可选 ¹²⁵I或 ³H为标记核素。用 ¹²⁵I标记蛋白质，每一蛋白分子不应超过一个原子的 ¹²⁵I， ¹²⁵I过多可导致蛋白质免疫活性或其他特性的变化。标记方法应较温和，勿用易使蛋白质性质发生变化的强氧化或强还原反应。 ³H标记半抗原，容许每一分子达1～4个 ³H原子甚至更多，但也需保证不改变抗原的特性。

标准品是定量的依据，要求尽量提高其纯度，配制时浓度应准确，并注意保存，以保证其质量。

质控样品库（QC pool）是专为质控而制备的、与待测样品性质相同且含量为已知的样品。它们在对偏差和漂移的监测中起着决定性作用。对质控样品的基本要求是：在分析的全过程中与待测样品有相同的行为特点；制备和保存必须有良好的稳定性和重现性；应有足够的量供长期使用，新旧两批质控样品交接时必须平行测定至少两次，以保证它们的连贯性；应包括与标准曲线使用范围相呼应的高、中、低三种剂量。

在放射免疫分析中，当实施分离流程后，绝大多数情况是除去游离抗原，保留和测定复合物的放射性。少数情况是除去复合物，测定游离抗原的放射性。游离抗体无放射性，不干扰测量，是否除净并不重要。分离流程有液相和固相两大类，现分述如下。

在液相环境中进行，终止反应后，用一定方法收集抗原抗体复合物，测量其放射性。常用的分离方法有双抗体沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法或PEG与双抗体法联合法、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法等。以上方法均可使抗原抗体复合物（B）沉淀，然后测定B部分的放射性。另一种吸附分离法，系用右旋糖酐包被活性炭（称DCC）或其他吸附剂，吸附小分子游离抗原，离心后分离出留在上清液中的复合物供放射性测量。

是预先将抗体吸附在某种固体支持物上，抗原抗体反应就在支持物上进行，反应结束后只需洗去周围未结合的游离抗原，再测定固体支持物上的放射性。很多材料可供选做固体支持物，如塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙等）、纤维素、凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、多孔玻璃微球等。

固相分离法是RIA近年来发展较快的领域。例如磁性颗粒法将固相颗粒（如纤维素） 与含铁化合物（如氧化铁）连接，再与抗体连接，此种颗粒在磁场吸引下不需离心即可与游离标记抗原分开。

RIA的操作流程一般包括加样、温育、分离结合和游离部分、测放射性、数据处理等五个步骤。

一般在室温（有的系统需用冰浴）中进行。在一系列试管中加入相同剂量的抗体、相同剂量的标记抗原，以及不同剂量的标准抗原（作标准曲线用）或一定量样品。有两种方式：一种是经典加样法，即抗体、抗原及标准抗原或样品全部加完后开始温育，另一种是顺序加样法，即先加抗体和非标记抗原或样品，温育一定时间后再加入标记抗原。后一种加样法可以提高非标记抗原竞争结合抗体的能力，因而灵敏度有一定提高，但稳定性（stability）和重现性（reproducibility）较差。此外，应设有非特异结合（non-specific binding，NSB）管，NSB管内不加抗体，只加标记抗原，故测得的放射性代表分离材料对标记抗原的非特异性吸附。所有试管测得的总结合的放射性减去非特异结合的放射性，才是抗原抗体的特异结合的放射性。

全部试管的加样总体积应取一致，并保持规定的pH范围，因此试剂都以同一缓冲液配制，和将各管补足到相同体积。不同系统都有一个获得抗原抗体最高结合率的pH范围，多数是在7.4～7.7间，但也有例外，应通过预实验选定。

不同系统RIA反应达到平衡所需温育时间和温度不同。有的随温度降低使亲和力（Ka）提高，分析灵敏度也提高，有的则温度对Ka的影响不大。但是，温度降低将使反应达到平衡的时间延长，所以选用什么温度，应依据所需的灵敏度及临床需要检验报告的缓急来选定。选定后不可随意变动。时间到达后即转入分离流程。

分离结合和游离部分可参照前面所述，从众多分离方法中选用一种，达到将结合和游离部分的最佳分离。

如果是 ¹²⁵I抗原，通常都可直接用NaI闪烁计数器测量cpm值，如果是 ³H标记抗原，往往需要将样品加至闪烁液作均相、乳状液或固相测量。同一批样品和标准品的测量效率相同，通常不必将cpm换算成dpm。

数据处理是将实测结果（cpm）在标准曲线上换算成标本中待测物的含量或浓度。现已开发出多种计算机软件供选用。目前应用的主要是以质量作用定律为基础的几种数学模型，现分述如下：

设标准管的剂量为X（X1，X2，…），Bo为X = 0时的结合率，Bx为X = X1，X2，…时的结合率，若以Log Bx/（Bo-Bx）为纵坐标，Log X为横坐标，可得到一条逐级下降的直线，其数学表达式是：

通过最小二乘回归分析，求得 a和 b，代入上式，再以待测样品的Bx逐个代入上式，即可求得各样品的含量X。本法优点是简易，用计算器也可拟合，缺点则是：① Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度；② 如有突出值，整条拟合线会偏离；③ 在顺序加样法中生成的不是直线，不可用。

本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下：

式中Y是各实验点的结合率（包括NSB），X是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时的结合率（包括NSB），b代表Logit-Log函数中的斜率（拟合时先由计算机求出），c代表结合率（减NSB） 降低一半时X的剂量，d代表NSB。上式由最小二乘法对各标准管的实测数据拟合得到a、b、c、d，再将待测样品的实测数据代入，求出含量。本法优于Logit-Log法之处为 ：通过拟合求NSB，而且不丢失0剂量点。但是①理论上可导出，本法只适用于平衡法，若要用于顺序加样法，应略加改变，变为五参数Logistic模型；②也会受突出值影响而偏离。

本法的特点是：①采取稳健回归法进行曲线拟合，在大多数情况下能排除标准曲线突出值的干扰；②严格根据质量作用定律推导；③把非特异结合作为与游离标记抗原成比例的参数引入模型的函数，不必事先减去；④不仅适用于平衡法，也适用于顺序加样法。其函数式如下：

式中c = 1/Ka，p* = 标记抗原初始浓度，q = 抗体初始浓度，b = NSB所占游离抗原的%，R = F/B，X = 标准品或待测物的量。

根据上述几种数学模型测量到的结果，最后需换算成待测物的量或浓度，现已有各种计算机软件供选用。使用者应当尽可能选用较先进的软件，使换算结果更为可靠。