时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是20世纪80年代初问世的标记免疫检测技术。其主要特点是以镧系元素如铕3 + （Eu ^{3 +} ）等标记抗体或抗原作为示踪剂。

与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。

镧系元素包括铕（Eu）、钐（Sm）、铽（Tb）和钕（Nd）等，通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。

镧系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出镧系离子，然后与荧光增强液中的β-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强镧系核素荧光免疫分析（dissociation-enhanced-lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）。

镧系核素的发光时间较长，如Eu ^{3 +} 和Sm ^{3 +} 的荧光衰变时间分别达到4.3×105ns和4.1×104ns，而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4～10ns，通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。此外，镧系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，stokes位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。

1.Eu ³⁺ 标记物可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。密封后4℃或−20℃保存，但应避免反复冻融。若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。

2.固相抗体或抗原固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。

包被抗原纯度要求高；包被抗体要求效价高，亲和力强。包被后经牛血清白蛋白封闭，干燥后在4℃、密封、避光、干燥的环境中保存。

3.若增强液试剂纯度不高、器皿清洁度不良或不明原因的污染等，均可导致增强液荧光本底升高。因此必须注意试剂的纯度；批号的差异，器皿要用10g/L的EDTA·Na ₂溶液浸泡，再用三蒸水洗涤。新配制增强液应用100ml塑料瓶在4℃下保存。

4.校准试剂或标准品，系指用生物液或缓冲液配制的一组不同浓度的待测物质溶液，用于制作计量-反应曲线或用作阴、阳性对照和cut off值校准。其浓度已用法定标准物为基准进行标定，标示值与实测值的偏差不得超过±10%。蛋白质类生物活性物质应进行免疫活性测定，证明其同质性。4℃或−20℃保存。

以Wallac公司auto DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统测定hTSH为例，整个检测过程用时2.5小时左右。步骤如下：

1.将100μl待测样品或标准品按顺序加入抗体包被的微孔条中。

2.每孔加入100μl稀释过的Eu ^{3 +} 标记抗体工作液。

3.孵育2小时。

4.洗涤6次，除去游离Eu ^{3 +} 标记抗体。

5.每孔加增强液200μl，反应5分钟。

6.测定荧光强度并经数据处理计算待测物质浓度。

TRIFA法易受内源性和外源性镧系离子的污染，这是由于在自然环境中镧系离子存在十分广泛，如空气中的尘埃、烟雾，北方地区尤甚。故需严格控制实验条件，防止污染。

1.器材的清洁度　实验所用的一切器材，包括微孔条、加样器、加样头、试剂瓶必须专用，并经严格洗涤，方法是：2mol/L盐酸浸泡24小时，再经0.1%环化二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸泡2～4小时，蒸馏水冲洗3～5次，再用高纯度蒸馏水冲洗2～3次，45～50℃干燥后密封储存。

2.蒸馏水的质量　蒸馏水的纯度直接影响所制的缓冲液、增强液和洗涤液的本底荧光，通常要求采用三蒸水，最后一次蒸馏采用亚沸石英蒸馏器处理。

3.所有实验用试剂必须作本底荧光测定，首先测增强液本底荧光，应<1500 cps，其余试剂各取25μl，加增强液200μl，振荡15分钟，放置20分钟后测荧光强度，以不高于增强液本底荧光30 %为合格。

4.操作者必须严格执行操作规程　不得用手直接接触加样头尖部、微孔条的孔部，加样完成后，应在微孔条上粘贴同样大小的胶纸以防尘埃污染，Eu ^{3 +} 标记物制备场所应与分析实验场所严格分开，以防大计量Eu ^{3 +} 污染环境。