第二章　临床诊断

第一节　实验室检查

包虫病是一种人兽共患寄生虫病，其临床诊断需要医生根据病人的流行病学接触史、各种临床表现，并借助实验室检查和特殊仪器检查结果，对病人所患疾病做出判断。实验室检验在包虫病的诊断中起着重要的作用。包虫病实验室检查主要包括常规实验室检查、病原学检查、免疫学检查、分子生物学检查等。按卫生计生委包虫病诊断标准及处理原则，需要做下列不同原理和方法的检测：

1.检测血清中特异性抗体；

2.检测血清中特异性循环抗原或免疫复合物；

3.痰液和咳出物的寄生虫学检查；

4.临床标本的病理组织学检查。其中1、2项属于免疫学检查，第3、4项属于病原学检查，我们将在以下的章节中逐一列出。

一、包虫病的一般血液学检查

1.囊型包虫病

一般情况下，囊型包虫病病人的常规实验室检查没有很主要的特异性，在血液学检查中可表现其血红蛋白、红细胞和白细胞总数没有明显变化，但部分病人嗜酸性粒细胞会增高。有报道50%包虫病病人可能会有嗜酸性细胞的相对增高和绝对增高。在包囊不完整的少数囊型包虫病病人外周血或脑脊液（脑包虫病人）中，亦可能有嗜酸粒细胞增高，当包虫囊破裂囊液漏出时常会造成嗜酸性粒细胞的显著增加。嗜酸性粒细胞计数参考区间为：0.05～0.5/L。

2.泡型包虫病

泡型包虫病病人的常规实验检查亦没有特异性，伴有脾脏增大的病人可出现白细胞总数和血小板数量的降低，进展期的病例常出现淋巴细胞减少，嗜酸性粒细胞常降低甚至缺如。

二、包虫病的临床生化检测

1.囊型包虫病

囊型包虫病病人的常规生化实验室检查没有特异性，在肝脏的囊型包虫病病人，可能会显示正常生化检测指标，若伴有并发症则导致生化指标改变，例如，胆汁淤积高血胆红素，转氨酶升高，γ谷氨酰转移酶（γ-GT）升高；包虫囊破入胆道系统的病人，可出现明显的一过性γ-GT和碱性磷酸酶（AKP）浓度的升高，或者高淀粉酶血症和嗜酸性粒细胞升高（>500/µl）。约30%的囊型包虫病例中亦可观察到高丙种球蛋白血症的出现。

2.泡型包虫病

泡型包虫病病人常出现血沉的升高，而伴随肝内胆管狭窄或堵塞的病人可伴有黄疸（或不伴有黄疸）的胆汁淤积所引起相应实验室指标的改变。高丙种球蛋白血症常在病人中可检测出，反映了特异性和多克隆的抗体反应。

三、包虫病的寄生虫学检查

在寄生虫感染中，检查出寄生虫病原体是确诊的主要依据。包虫病的病原学诊断是由肝或其他部位包囊中抽取的液体沉淀内查找棘球蚴头节，或痰液和咳出物中找到头节或囊膜片。

包虫病的囊由囊壁和内容物构成，外层是角质层（laminated layer），厚度为1～4mm不等，呈半透明乳白色，似粉皮状，松脆易裂；内层为生发层（germinal layer），也有叫胚层，厚度22～25μm。囊内容物为囊液和生发囊、原头蚴、子囊和孙囊等。囊液（hydatid fluid，cyst fluid）无色透明或微带黄色，内含自囊壁脱落的生发囊、原头蚴、子囊等悬浮其中，这些悬浮物又被称作囊砂（hydatid sand）。

光镜：角质层可见无细胞结构，呈多层纹理状；生发层紧贴角质内，有很多细胞核。

电镜：电镜下有无数微毛延伸到角质层内。原头蚴（亦称原头节，protoscolex），圆形或椭圆形，大小170μm×122μm左右，头部具顶突和吸盘，向内翻卷收缩，保护其内的数十个小钩，而没有像成虫头节一样的顶突腺。

四、包虫病免疫学检查

免疫诊断学检查对于诊断包虫病感染非常有用，联合多项检查结果是目前最有价值的血清学诊断，可在有创检查前采用。对人体包虫病的免疫试验主要是检测包虫病抗体，阳性率80%～90%，假阳性5%～10%，影响免疫反应的因素很多，非特异性反应可见于感染其他肠道寄生虫病、癌症和慢性免疫疾病的病人。阴性结果不能除外包虫病，因为一些包虫病病人不产生抗体，可能与个体免疫差异、包囊的部位和囊壁厚度有关。

包虫病免疫学检测应特别注意以下特点：①肝内包囊比肺内包囊更易于激活抗体反应，如果忽略部位的话，对于具有完整包囊的囊型包虫病病人而言，抗体检查敏感性最差；②肺、脑、脾的包虫囊血清诊断率较低，而骨包虫更易刺激抗体反应；③包虫囊瘘或破裂可刺激产生强烈的抗体反应；④衰退、钙化或死亡的包虫囊，血清学检查常可呈阴性。

包虫病实验室免疫诊断及研究方法见表2-1-1。

（一）目前已不常用的免疫学检查方法

1.间接血凝试验（Indirect haemagglutination test，IHA）

是以红细胞作为包虫病抗原的载体，如病人血清中含有包虫病特异性抗体，会发生红细胞凝集的血清学检测方法，Garbedian等1957年首先用于包虫病诊断。阳性率约71%～100%，亦可出现假阴性或假阳性反应。不能提供检测抗体的亚型类别，容易发生异常的非特异凝集，实验过程较为繁琐，需要配制醛化绵羊红细胞等，不易标准化，不适用于临床检测，所以目前已不常用。

2.对流免疫电泳试验（Counter-immunoelectrophoretic assay，CIEP）

是将包虫病抗原和待测血清分别置于电泳仪琼脂凝胶两端的孔中，由于电泳和电渗作用使抗原抗体相向移动，如待测血清中含有包虫病特异性抗体会形成沉淀线。该方法具有一定的特异性，“弧5”就是通过该实验确定，但在囊虫病人也可出现阳性，所以在应用时需注意鉴别。由于实验过程相对繁琐，还受到电泳电渗条件的限制，一般不用于临床检测。

3.间接荧光抗体法（Indirect fluorescent antibody method，IFA）

是将包虫抗原与未标记的特异性抗体（如病人血清）结合，然后使之与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）结合，三者的复合物可发出荧光。由于需用荧光显微镜判断结果，限制了它的应用范围，无法应用于临床。

4.聚苯乙烯乳胶凝集试验（Latex agglutination test，LA）

是用聚苯乙烯乳胶颗粒代替红细胞为载体的凝集试验。LA试验操作简便易行，操作简单，快速，阳性率在50%～92.2%之间。但非特异性反应率较高，LA阳性率最低为76.79%，假阳性率最高为8.05%，敏感性和特异性均稍差于IHA、ELISA等检测方法，没有在临床检测中推广开来。

5.琼脂凝胶扩散试验（Agar gel diffusion test，AGD）

是将包虫病抗原和待测抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线，是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。已证实该方法的与囊虫病病人血清有交叉反应，但是其在囊虫病不流行的地区相对特异。该方法耗时很长，需肉眼观察沉淀线的存在，目前已不用于临床检验。

6.补体结合试验（Complement fixation test，CFT）

补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，如果反应系统中存在包虫病特异抗体，则包虫抗原、抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统（SRBL与相应溶血素），由于反应中无游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性；如待测血清中不存在抗体，则仍有游离的补体存在，当加入指示剂时会出现溶血，为补体结合试验阴性。对包虫病诊断阳性率为80%，约5%呈假阳性反应（本病与吸虫病和囊虫病之间有交叉免疫现象）。实验相对繁琐，需要使用补体、红细胞等，目前已不适用于临床检测。

7.淋巴细胞转化实验（Lymphocyte Transformation in vitro，LT）

Eg原头节能使小鼠的淋巴细胞迅速母细胞化并进行分裂，对3H-胸腺嘧啶的摄入量也增加，对棘球蚴早期的生长和转移具有控制作用；而感染后期T淋巴细胞减少，转化功能降低，细胞免疫反应受到抑制，造成棘球蚴在体内长期寄生并发育生长。LT实验能够通过分离病人血液中的淋巴细胞，加刺激物培养后加入3H-胸腺嘧啶或MTT，观察淋巴细胞增殖转化功能，从而来反映病灶的情况，但需要进行淋巴细胞分离和培养，仅在科研中适用，不适用临床检测。

（二）目前常用的免疫学检查方法

1.酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

酶联免疫吸附试验，简称酶联试验。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可用作包虫病病人的辅助诊断、血清流行病学调查和监测疫情。

根据实验条件和检测目的不同，可设计出各种不同类型的检测方法。

（1）间接法

【试验原理】

利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

【操作步骤】

①将特异性棘球蚴抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。②加稀释的受检者血清：其中的包虫病抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性包虫病抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。③加酶标抗抗体（羊抗人IgG抗体）：与固相复合物中的人抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。④加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

【临床意义】

用于包虫病特异性抗体的检测，为临床实验室诊断所常用。

【方法学评价】

敏感性，特异性由所使用的抗原来决定，一般来说，囊液抗原EgCF，弧5抗原，头节抗原等抗原有较高的敏感性，90%～95%不等；而抗原B的敏感性63%～82%不等，但特异性相对更好（77%～100%）。

（2）双抗体夹心法

【试验原理】

固相中的特异性抗体与受检抗原结合，利用酶标记的特异性抗体以检测已与固相结合的受检抗原，故称双抗体夹心法。

【操作步骤】

①将包虫病特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。②加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的包虫病循环抗原与固相载体上的包虫病特异抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合的物质。③加酶标包虫病特异抗体，使固相免疫复合物上的包虫病抗原与酶标包虫病抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量正相关。④加底物，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行包虫病抗原的定性或定量。

【临床意义】

用以检测包虫病循环抗原，但敏感性仅在50%左右。也常用于检测包虫病感染犬的粪原抗原检测。

（3）斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）

【试验原理】

斑点ELISA（dot-ELISA）是20世纪80年代发展起来的一种ELISA技术，选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，然后目测或用光密度扫描仪定量。

【试验方法】

将棘球蚴抗原点在硝酸纤维素膜上，室温或37℃干燥，以含5%脱脂奶粉或20%小牛血清的PBS封闭后，加入1∶50或1∶100稀释的血清，室温1h或37℃30min，洗涤3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温下1h或37℃30min，洗涤3次；底物为3，3′二氨基联苯胺（DAB）或4氯-1-乙萘酚（4-Cin），显色10min，用蒸馏水或PBS洗涤、干燥保存。判断标准：浅紫色（+），紫色（++），紫黑色（+++），出现（+）以上为阳性，无色或无圆点轮廓为阴性。敏感性和特异性较高，不需要复杂仪器，可以目测结果，尤其适合基层推广。王兰珍等用人、羊、牛肝棘球蚴囊液抗原对43例泡球蚴病、81例非泡球蚴病病人及75例健康人进行了试验，结果显示：人、羊、牛棘球蚴囊液抗原检测的阳性率分别为100%、100%、86%，说明用前两种抗原作诊断抗原效果优于最后一种。

【临床意义】

该法简易，快速，无需特殊的仪器设备，适合于现场应用，现有的资料初步证明具有诊断病人和考核治疗效果，有广阔的应用前景。

（4）亲和素-生物素-酶复合物酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）

【试验原理】

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取，对生物素具有高度亲和力，生物素是从卵黄和肝组织中提取。

生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应，大大提高ELISA的敏感度。

【操作步骤】

①先将亲和素和生物素化的酶标记物按一定比例形成ABC复合物（Avidin-Biotinyl-HRP complex），再加羊抗人IgG，形成ABC-羊抗人IgG复合物。②将生物素化的棘球蚴抗原包被在固相载体上。③加入包虫病病人的待测血清。④让标本中的包虫病抗体与固相载体上的包虫病特异抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合的物质。⑤加入含羊抗人IgG的ABC复合物，使固相免疫复合物上的包虫病抗体与ABC复合物中的羊抗人IgG结合，彻底洗涤未结合的抗体。⑥加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。颜色深度代表标本中受检抗体的量。

【临床意义】

主要用于人体包虫病抗体的检测，ABC-ELISA法敏感性显著高于ELISA间接法。

（5）酶标葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附试验（SPA-ELISA）

【试验原理】

SPA（葡萄球菌A蛋白）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，它能与人及多种哺乳动物血清IgG的Fc段结合，且这种结合同抗-IgG与IgG结合相似，因而可用SPA代替抗-IgG。

本试验用过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白（PRP-SPA）取代酶标第二抗体，其余均与ELISA相同。使用囊液粗抗原，敏感性高，假阳性率也较高，用纯化的抗原可提高特异性。

【试验方法】

先于酶标反应板孔内包被抗原100µl/孔，置37℃孵育2h，4℃过夜；次日弃抗原，用pH7.4 PBS-T洗液连续洗3次，加待检稀释血清100µl/孔，置41℃孵育15min；弃血清，同上洗涤加HRP-SPA酶标记物100µl/孔，置41℃孵育15min；弃液后连续洗涤5次，加OPD底物溶液100µl/孔，同上孵育；加2MH2SO450µl终止反应。每板设阴性对照2孔和阳性对照1孔。结果判定同其他酶联免疫吸附试验。

【临床意义】

本试验主要用于包虫病抗体的检测。有报道用Burstein氏纯化抗原对包虫病人及非包虫病人做SPA-ELISA，以阴性对照OD均值+3SD为阳性标准时，敏感性为92.86%，非包虫病人和健康人各为2.03%和0，其特异性为97.7%。本法具有操作简便，快速及特异性高的优点。

（6）固相小珠酶联免疫吸附试验（Solid bead ELISA）

【试验原理】

本试验采用聚苯乙烯小珠作为固相载体，其他与ELISA间接法基本原理相同。

【试验方法】

同ELISA间接法，聚苯乙烯小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。捕获标本中的包虫病特异性抗体，通过酶联显色反应而判断结果。

【临床意义】

主要用于检测人体包虫病抗体，检测的敏感性为95%，包被抗原的小珠在4℃下可保存一年。

（7）鉴别诊断酶联免疫吸附试验（DD-ELISA）

【试验原理】

Em1可与囊型包虫病（CE）和泡型包虫病（AE）病人血清发生反应，Em2仅能与AE病人血清发生反应，采用两种抗原（Em1和Em2）作为包虫抗原，用间接法，测定抗体，因而可以鉴别病人感染的虫种。

【试验方法】

操作上将两种抗原同时包被在酶标板上，检测步骤同ELISA间接法，仅每份待测血清各加入不同抗原反应孔中，判断结果时根据与何种抗原结合呈阳性初步判断为CE或AE。

【临床意义】

用于囊型包虫病（CE）感染和泡型包虫病（AE）病人的鉴别。

（8）组合抗原包虫病酶联免疫吸附试验（MA-ELISA）

【试验原理】

由于单一抗原在传统酶联免疫试验中因抗原不同而有不同的敏感性和特异性，以新疆包虫病临床研究所温浩等研制的“组合抗原包虫病快速诊断试剂盒（定量）”将四种不同的包虫病特异性抗原组合起来用于包虫病的诊断，以提高诊断的敏感性并兼顾其特异性。四种抗原物质含粗的囊液抗原、头节抗原及纯化的细粒棘球蚴特异性抗原B和泡球蚴特异性抗原Em2，在酶联反应板微孔条上预包被，配以酶反应液及TMB显色剂，采用间接ELISA方法检测包虫病病人血清中的特异性抗体。在需要提高诊断的敏感性时，将四项中任何一项阳性时均判为阳性；在需要提高诊断的特异性时，在细粒棘球蚴三项均为阳性时才判为阳性。

【试验方法】

①加样品：A、B、C、D行分别为四种不同的包虫特异性物质，每份待测血清经样本稀释液1∶100倍稀释后，分别加入A、B、C、D四个不同孔中各100μl，同时加阴性对照（不用稀释）、阳性对照（不用稀释）及空白对照（样本稀释液），各加100μl。于37℃保温30min，或室温1h。②用洗涤液（浓缩液1瓶加蒸馏水至500ml使用）洗板4次，每次浸泡30s后拍干。③加入酶反应液，每孔加2滴，于37℃保温20min，或室温1h。④用洗涤液洗板4次，每次浸泡30s后拍干。⑤每孔加入底物A液和B液各1滴，轻轻摇匀后37℃保温10min，或室温15min，加终止液1滴。⑥空白调零，450nm比色。

【结果判断】

临界值（CUTOFF）=2.1×阴性对照OD值。测试标本A、B行任一OD值>临界值，则包虫试验结果阳性。测试标本C行OD值>临界值，则考虑为细粒棘球蚴结果阳性。测试标本D行OD值>临界值，则泡球蚴结果阳性。测试标本A、B、C、D四行均OD值<临界值，则包虫试验结果阴性。

【临床意义】

本法采用灵敏度高的酶联免疫吸附试验，又同时用囊型和泡型包虫病的不同抗原检测特异性抗体，可兼顾敏感性和特异性，并可对两型包虫病做出初步的鉴别诊断，利于实验室应用和大规模流行病学调查，是值得推广的实用型包虫病诊断工具。其临床和流行病学中使用的评价详见附录Ⅱ。

2.固相免疫金银法（GSIA）

该类方法是一种有发展前途的实验技术。胶体金标记蛋白质最大特点是在标记中金颗粒与蛋白分子之间无共价键结合，是通过电荷之间的范德华引力结合，不影响蛋白原有的生物活性。本试验的特点是将胶体金标记技术用于包虫病免疫诊断上。GSIA的特异性、敏感性，与ELISA相近，且制作简便、经济，又可以避免ELISA底物对操作者的致癌作用，成为包虫病免疫诊断的一种新的实用发展方向。林文玉等用免疫金银法对59例临床或手术确诊的包虫病人血清检测阳性率为79%（31/39），酶标ELISA检测阳性率为82%（32/39），统计学无差异，说明二者的诊断效能相当。

（1）点免疫胶体金渗滤法（Dot Immuno-Gold Filtration Assay，DIGFA）

【试验原理】

以新疆包虫病临床研究所温浩研制的“组合抗原包虫病特异性抗体检测试剂盒（胶体金法）”（图2-1-1）为例，其原理是将棘球蚴的四种诊断性抗原组合固相在特制的载体（反应板）上，通过点免疫胶体金渗滤法（DIGFA）快速检测人体包虫病感染。反应板的样品孔中间点有阳性控制物，四周为四种抗原即：囊液抗原（EgCF）、头节抗原（EgP）、对囊型包虫病特异性的B抗原（EgB）和对泡型包虫病特异的Em纯化第二抗原（Em2）。检测标本可为血清或全血。

【试验方法】

①血清检测：将采集的血清及试剂盒复温至室温（不低于20～25℃），以试剂盒中A液稀释血清后加100μl于反应板上，经B液3滴→C液3滴→B液3滴的加样顺序，3min左右即得到检测结果。所有反应板中间的阳性控制点均显色，质量合格；②全血检测：预加2滴土豆凝集素于EP管中，加全血2滴→静置3min凝血→加A液3滴混匀→取100μl加于反应板上→B液3滴→C液3滴→B液3滴，6min左右即可得到检测结果（图2-1-2）。

【结果判断】

EgCF、EgP用于包虫病初筛试验；EgB用于细粒棘球蚴病确诊试验；Em2用于泡球蚴病确诊试验。阳性：“+”淡红色；“++”红色；“+++”紫红色；阴性：“-”，四个测试点无红色斑点或只出现痕迹者判为阴性（图2-1-3）。

【临床意义】

详见附录Ⅱ。

本法已在新疆各医院和西北地区包虫病流行病学调查中广泛应用，因其简便易行，敏感性和特异性均达90%左右，为囊型和泡型包虫病的诊断和鉴别诊断提供了良好的依据，已成为包虫病实验室诊断和流行病学调查的一个重要组成部分。

（2）金标层析法（Gold Immunochromatographic Assay，GICA）

【试验原理】

以上海寄生虫病研究所薛海筹等研制的“快速诊断包虫病免疫层析纸条”为例，将包虫病抗原包被在硝酸纤维素膜上，与待测血清中包虫病抗体结合，再与胶体红色金标记的羊抗人IgG结合，形成抗原抗体复合物，而不被洗去（图2-1-4）。

【试验方法】

将棘球蚴混合抗原以线型包被于硝酸纤维素膜上，与试纸下端的金标羊抗人IgG抗体共同制成层析纸条，把试纸条直接插入稀释5倍的待测血清（10μl）中，加入3滴水，层展2分钟后，若血清中有包虫病抗体，则在反应线出现相应红色。

【临床意义】

用于包虫病抗体检测。该方法简便易行，产品易于室温保存，适合于流行区普查工作，据报告敏感性为91%，对囊虫病而言特异性为96.77%（60/62），对血吸虫病为91.67%（11/12）。

3.免疫印迹试验（immunoblot或Western blot）

【试验原理】

是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术（immunoprobing technique），是用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法，用于诊断的免疫印迹试验以采用酶标记的探针（即二抗及其标记结合物），更为安全方便，称酶免疫转移印迹试验（enzyme immunotransfer blotting，EITB）。目前主要用于Em18的免疫印迹法检测。

【试验方法】

其操作过程如下：收取人工感染多房棘球蚴的长爪沙鼠腹腔中的包囊，剪碎后收集原头节，反复洗涤后，用去氧胆酸钠溶液溶解并抽提后，用PBS透析，收集抗原，测定蛋白质含量并调整至2mg/ml浓度。用12%或20%浓度聚丙烯酰胺凝胶或8%～16%梯度胶（厚1.5mm）按常规进行SDS-PAGE电泳。在长度为6cm的胶上每一大孔加蛋白质400μg。电泳后按常规转移至硝酸纤维膜上（孔径0.45μm）。然后切成膜条，进行免疫印迹试验。待检血清稀释1∶50。在分子量为18kD位置出现酶免疫染色条带者为阳性。利用批量制备抗原分离的薄膜条带，有可能成为适用于现场查病的特异性诊断药盒，不失为一项具有诊断潜能的新技术。

【临床意义】

Ayadi等用Western-blot来检测包虫病血清中可以用作诊断抗原的条带。经过191份血清检测（105份来自细粒棘球蚴病病人，86份来自健康对照和其他疾病病人），检测到48个不同的抗原条带，其中有一个35kDa的条带能与Ag5的单抗标记的条带发生共迁移，但是在免疫电泳中能与Ag5发生沉淀反应的血清只有68%被这个35kDa的条带检测出。说明该35kDa的条带虽有抗原诊断作用但价值不及Ag5。他们还发现了一个能与泡状棘球蚴抗原发生特异反应的8kDa的条带可以被80%的细粒棘球蚴病病人血清识别而不与86份对照血清发生反应，说明该抗原可以作为AE和CE的共同抗原。21、30、95kDa的条带都至少能被50%的病人血清检测出，而且105份血清中103份血清至少能识别8、21、30、35或92kDa特异性抗原中的一个。他们的研究结果说明Western-blot可以作为诊断细粒棘球蚴的有效的诊断方法，与其他诊断学方法相比它的优点在于可以确定特异性抗原条带的分子量。商用的蛋白免疫印迹产品已经问世。Liance M等将来自泡状棘球蚴幼虫抗原的商品化蛋白免疫印迹IgG（LDBIO Diagnositics，Lyon，France）用于鉴别诊断AE和CE，对50份CE病人和61份AE病人血清的检测结果显示对该实验对包虫病病人血清IgG的检出率是97%，能够将76%的AE病人从CE中区分出来，但是对两型包虫病都无法区别现症感染和既往感染。GadeaI的研究也表明了酶联免疫印迹转移实验敏感性和特异性均可达到100%，优于传统的间接血凝、乳胶凝集试验、嗜碱性粒细胞脱颗粒试验，但对肺透明包虫囊的诊断效果不佳。

（三）人体包虫病免疫诊断方法研究的进展

1.IgG及其亚型在包虫病诊断和治疗随访中的应用

（1）IgG亚类与细粒棘球蚴自然病程：

Zarzosa MP等将6种免疫学试验用于诊断和手术后随访，表明敏感性最高的是检测特异性IgG的ELISA法（83.5%），敏感性较差的是检测特异性IgE的ELISA法（44.3%）和IEP（50.6%）。同时发现对单个包虫囊肿病人及多个子囊病人的诊断敏感性无统计学差异。在对手术后病人的随访中发现凡是术后未复发病人在术后1～3个月内抗体滴度短暂上升后在3个月后开始下降直至48个月为阴性。而术后一年内复发的病人表现为术后抗体滴度持续增高，术后3～4年复发的病人表现为术后3个月后抗体滴度逐步降低，而复发时抗体滴度又开始上升，这些结果说明术后抗体滴度持续升高后逐步降低后再升高是复发和再感染的标志。

Daeki AO等（2000年）研究了IgG亚类与细粒棘球蚴自然病程的关系，对临床无症状但经体检B超证实患有细粒棘球蚴的病人用AgB-ELISA法和免疫印迹法检测了病人血清总IgG及其亚类IgG1-IgG4。发现有单囊（TypeⅠ）或有分层、子囊（TypeⅡ、Ⅲ）的包虫病病人血清IgG4水平增高，而囊肿发生浸润或钙化（TypeⅣ、Ⅴ）的病人IgG1、IgG4水平降低，从研究结果可以看出特异性IgG4抗体反应总是和包虫囊肿（TypeⅠ-Ⅲ）的发生发展阶段相共存，而IgG1-IgG3总与包虫囊肿的退化阶段（TypeⅣ-Ⅴ）相关联，提示IgG4是包虫囊肿生长疾病发展的标志，而IgG1-IgG3则与囊肿浸润或被宿主破坏的阶段相显著增高。

（2）IgG亚类在诊断及术后随访中的作用：

温浩等早在1994年的报道里就证实了两种包虫病均存在棘球蚴特异性IgG亚型IgG1和IgG4，并且在泡型包虫病人血清中更容易检出，而IgG2和IgG3在两型包虫病均不甚敏感；IgG1主要识别囊型包虫病弧5抗原的38kDa亚单位，而IgG4识别的是囊型包虫病抗原B的20kDa、16kDa和12kDa亚单位。IgG1和IgG4可识别多房棘球蚴原头节提取物的44kDa、35kDa、21kDa和17.5kD蛋白组分，IgG4在泡状棘球蚴活性病变时水平较高，而经手术治疗去除病灶后就很快甚至早于总体IgG水平降低，而特异性IgG4的重新检出往往提示复发，这为泡型包虫病根治性手术或肝移植术后随访提供了有利的价值。

Guerri ML等（2000年）研究了IgG亚类在诊断及术后随访中的作用。他们82例临床证实的包虫病病人血清及10份健康对照血清进行了间接血凝试验和ELISA法研究了所有阳性血清中的IgG亚类，他们发现82名病人中有81人都能检出总IgG，而IgG2和IgG3在有症状的病人中的阳性检出率是94.4%，在有包虫囊肿而未行治疗的病人中阳性检出率是100%，而在包虫囊肿已钙化或已行手术根治的病人中阳性检出率则是0，他们的研究表明IgG1、IgG4均具有良好的特异性，可联合使用，手术或药物生效后IgG4可转为阴性，若有疾病复发或包虫囊肿残留则IgG为阳性，故IgG4可以作为包虫病随访的良好指标。

IgG亚类酶联免疫检测基本方法如下：相应包虫囊液抗原（或B抗原或头节抗原，根据自己需要）3～4μg/ml以碳酸缓冲液（pH9.6）稀释包板，4℃过夜；洗涤和封闭（含0.1%Tween20和5%脱脂奶粉的PBS）同ELISA基本方法；待测血清1∶200稀释后加入相应的孔内，室温孵育1.5h，洗板4次；加入适当稀释于PBS的单克隆鼠抗人IgG1或IgG4等亚型抗体，室温孵育1小时，洗板4次；加入碱性磷酸酶标记的二抗（羊抗鼠γ链（或Fc段）特异性抗体），室温孵育1h，洗板4次；加入底物如对硝基苯磷酸二钠盐（p-Nitropheny1 phosphate，PNPP），室温20min，酶标仪在405nm比色测出吸光度。

2.单克隆抗体的研究

Craig等（1981）首先将单克隆抗体法技术用于包虫病研究。他们用接种感染包虫的BALB/C小鼠作为脾细胞供体与小鼠骨髓瘤细胞（P3-NsX1/1-Ag-1，NS-1）杂交得到了两株分泌的McAb偶联Sepharose-4B柱，亲和层析纯化包虫囊液抗原，并用间接ELISA法评价了纯化抗原的免疫活性和特异性。实验表明粗抗原和感染水泡绦虫（T.hydatigena）和肝片吸虫（F.hepatica）的绵羊血清交叉反应率很高，而亲和纯化抗原与上述蠕虫的绵羊血清交叉反应率明显下降，特异性提高。但应用纯化抗原检测时其对应的光密度值（O.D）值较粗抗原有所下降。单克隆抗体的出现使包虫病的检测从传统的检测特异性循环抗体发展到检测循环免疫复合物（CIC）和循环抗原（CAg），McAb具有质地均一、产量高及重复性好等优点。继Craig之后，诊断用McAb不断问世并将其用在诊断、抗原表位的确定上显示了粗抗原无法比拟的优势。李富荣用单克隆抗体斑点酶联免疫吸附试验（McAb-Dot-ELISA）检测46位确诊包虫病病人血清循环抗原，35例呈阳性反应阳性率为76.09%，14例猪囊虫病人，50例健康人的血清均为阴性。敏感性和特异性较好，可用于包虫病的诊断和疗效考核。景涛等用单一单克隆抗体铺底，多个单克隆抗体混合作为后续捕捉抗体的夹心固相ELISA体系，解决了以往单位点单克隆抗体特异性与敏感性之间此消彼长的矛盾。如果采用杂交瘤技术生产的针对保护性抗原的单克隆抗体，就可以纯化保护性抗原，作为疫苗保护性抗原则具有更为实际的用途。总之，杂交瘤技术及其生产的单克隆抗体以它所特有的优点和应用潜力为包虫病的免疫诊断，免疫保护及抗原分析提供了非常有用的手段，必将促进对包虫和宿主关系的深入了解和抗包虫保护性疫苗的研制。

3.包虫病循环抗原和循环免疫复合物检测的研究

应用多克隆抗体的ABC-ELISA和双抗体ELISA检测包虫病人血中的循环抗原CAg，阳性率均未超过40%（柴君杰等，1987；曹和沟等，1989）。McAb技术的发展和应用，对CAg的检测有明显的帮助。黄启华等（1992）应用生物素标记的MCAb，进行夹心ABC-ELISA，检测包虫病人血清中CAg的阳性率为60.19%（60/103），22份囊虫病人血清未出现交叉反应。胡庆和等（1994）用抗细粒棘球蚴McAb的生物素—抗生物素抗原斑点试验（ABC-AST），检测包虫病病人血清CAg的阳性率为98.8%（82/83），但检测多房棘球蚴病人的阳性率为83.6%（97/116），表明两者有共同抗原成分。以上不同的检测结果提示，CAg检出率高低不一，可能与采用方法的敏感性不同有关，棘球蚴在人体器官寄生部位的不同也会有影响。此外应考虑到，CAg在血流中有相当一部分会以免疫复合物（IC）的形式存在，设法使IC中的CAg完全游离出来，可望提高检出率。传统的方法是对IC进行酸解离，Craig等应用单抗多抗夹心法检测82例手术证实包虫病人体内CAg，检测前用酸处理血清，检出率为85.3%，14例对照组均呈阴性反应。以酸处理病人血清可使CAg检出率增高，是抗原抗体复合物分解为CAg所致。哈小琴等（1994）报道，将血清样本以3.5%聚乙二醇沉淀出IC，再以1%胰蛋白酶消化，随后检测CAg，其敏感性较未处理组提高6倍，比传统的酸解离法提高4倍多。感染包虫1周后即能检测出循环抗原，因此可用于早期诊断。李富荣（1996）行单抗斑点ELISA检测包虫病病人CAg阳性率为76.1%，李雄行单抗中和ELISA检测阳性率为30%。以上CAg检出水平的不同与制备单抗或多抗质量有关，而在血清中游离循环抗原的实际含量也直接影响到检测结果。Craig认为当包虫病病人体内CAg达高峰时可与抗体结合，形成抗原抗体复合物，因此在疾病的慢性期测不到CAg和抗体，必须测定CIC才能显示阳性反应。还发现大多数抗体阴性包虫病病人血清中可查到CIC，故检查CIC有辅助和提高CAg和抗体的检出效果。

（1）循环抗原检测方法：

①将抗包虫单克隆抗体用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜后用PBS-T洗板3次。②每孔加入含10%小牛血清的PBS-T 100μl，于37℃下封闭1h，洗板3次。③待检血清用上液稀释为1∶2，每孔加100μl，每份标本加两孔，37℃温育1h，洗板3次。④加入工作浓度的HRP标记单抗100μl 37℃ 1h后，洗板3次。⑤加入OPD底物溶液100μl，37℃ 30min。⑥加入2mol/LH2SO450μl，终止反应。⑦测各孔OD490。⑧对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（5～10μg/ml抗原100μl），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值+3SD为阳性临界值。

（2）循环免疫复合物检测方法：

①用0.01mol/L pH8.4硼酸盐缓冲液将PEG6000配成7%溶液，取此液100μl加等量1∶2待检血清混合置室温下1h后，3000r/min离心1h。②吸去上清液，在沉淀中加含有8mol/L尿素的0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液0.5ml，溶解沉淀物。③用此液包被酶标板每孔100μl，每份标本包被两孔，4℃过夜后，洗板3次（阳性及阴性对照同样处理）。④每孔加含有10%小牛血清的PBS-T100μl，37℃封板1h，洗板3次。⑤加入工作浓度HRP标记的抗包虫单克隆抗体100μl，37℃下1h后洗板3次。⑥加OPD底物100μl，37℃下30min。⑦加入2mol/LH2SO450μl终止反应。⑧测各孔OD490。⑨对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔，阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值+3SD为阳性临界值。

4.包虫病病人标本中DNA的检测

目前应用的方法主要为核酸分子杂交（核酸探针技术）和基因的PCR扩增技术（聚合酶链反应）两种方法。具有敏感性高，特异性强，是使用方便，应用面广的研究手段。探针为棘球蚴的特异核酸序列，用于检测棘球蚴特异性基因在病人标本中的存在。

冯笑梅根据细粒棘球蚴基因片段克隆与序列分析，设计了一对特异性引物，P1 5′ GGAATGGAGAGAAGTTAC 3′ P2 5′ GCAACCTCCGGAACTTG C 3′。以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板，经PCR扩增获得471bp特异性区带增产物纯化后，用DIG标记DNA，将制备成的特异性核酸探针用于细粒棘球蚴检测。经对大肠杆菌、粪肠杆菌、结核分枝杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑点杂交，只有细粒棘球蚴出现单一471bp特异性区带。PCR的灵敏性为检出单个原头蚴及100～10fg水平的DNA，而斑点杂交的敏感性为2500fg。异源性DNA即使提高点膜量，亦不出现阳性反应。配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点。为包虫病的早期诊断和流行病学调查提供了科学依据。

5.包虫病病人其他组织体液中抗原、抗体的检测

有报道采用人体分泌物（唾液、鼻涕、尿液等）做酶联免疫试验，其方法更为简便。Parija（1997），赵兵（1999），Ravinder（2000），从包虫病病人浓缩尿液中已检测到特异性的代谢抗原。与血清标本平行比较，尿中抗原检测的敏感性和特异性达到100%（Sadaka等2002）。赵兵应用McAb夹心ELISA法检测尿液抗原进行流行病学调查表明，方法简便、快速、敏感的优点。

（1）唾液检验：

多年来在包虫病免疫诊断中血清一直是抗体检测的主要体液，由于抽血具有损伤性和传染危险性，而唾液采集较血清安全易得，无损伤性和无痛苦，唾液中包虫病抗体检测的研究更加必要。朱兵（1992）首次对包虫病病人唾液中IgG抗体进行ELISA检测，检测唾液特异性抗体，方法如下：①抗原制备：采用囊液抗原。②操作方法：在抗原致敏的载体板孔内加待检原倍稀释唾液100µl，37℃孵育15min；弃唾液，用pH7.4PBS-T洗液连续洗5次，加HRP-IgG标记物100μl/孔，同上孵育；弃液后连续洗涤5次，加OPD或TMB底物溶液100μl/孔，37℃显色5min，以2MH2SO4 50μl终止反应。③结果判定：在酶标仪上测读OD450值，以阴性对照OD均值+3SD为阳性临界值。④评价：阳性率为78.85%，唾液和血清两样本总符合率为92.31%。用于寄生虫病唾液抗体检测方法主要有EITB、ELISA、DAT和IHA，但EITB法的敏感性不如ELISA法，朱兵对ELISA、IHA和LA 3种包虫病人唾液抗体检测方法比较表明，IgG-ELISA敏感性为84.4%，IgA-ELISA为35.19%，IHA为8.75%，LA不具特异性和敏感性，IgG-ELISA法的特异性为90.74%。将唾液抗体IgG-ELISA法用于包虫病现场普查显示，唾液抗体阳性率为16.8%（21/121），在21例唾液抗体阳性者中，影像学（B超、X线）检查发现包虫囊性占位或既往有包虫病手术患病史者13例，符合率为61.9%（13/21）。本法操作简便、经济、敏感性和特异性较高，适合作为包虫病临床和流行病普查诊断方法。

（2）囊液检验：

某些疾病也会形成囊肿样病变，囊内有液体存在，在临床手术前无法鉴别是否属于包虫病时，可进行有保护的穿刺获得囊液，然后鉴定该囊液是否属于包虫病。方法是：①酶联点免疫方法：将抗包虫囊液的抗体预包被在硝酸纤维素膜上，属于包虫囊液的样本就会与其结合，再加入酶标记的抗包虫囊液抗体，通过底物就会显色，从而判断样本是否来源于包虫病。②胶体金免疫层析法：将抗包虫囊液的抗体预包被在硝酸纤维素膜上，含有包虫囊液的样本顺层析试纸条上行，先与胶体金标记的抗包虫囊液抗体结合，继续上行至包被抗体线时，再与该线结合使得该反应线显色，从而判断样本是否来源于包虫病。该方法敏感性和特异性都是较好，目前尚需更多样本的验证。

6.重组抗原及多肽用于包虫病的血清学免疫检测

自然抗原由于来源和制备问题，常常会出现批间差异而造成敏感性和特异性等评价指标不稳定，而重组抗原和多肽则由于其成分已知，重复性和特异性好，更适合做批量化检测用。目前实验室常用的重组抗原有rAgB8/1，rAgB8/2，EpC1，rEm18等，跟抗原B相关的多肽有p65、P175、P176、P177、pGU4等（表2-1-2），其中rEm18的快速金免疫层析法试纸条已研制成功并商业化（Sako et al.，2009）。

附录I：常用的包虫病诊断抗原

包虫病免疫诊断的敏感性与特异性不仅和所用的试验方法有关，而且跟试验中所采用的为何种抗原密不可分。在第二节中所介绍的诸多方法中，所用抗原为单一抗原或组合多种抗原，或自然抗原或人工合成抗原，对试验结果的影响均各有不同。本节介绍几种最为常用的诊断抗原。

1.囊液抗原（EgCF）

【性质】

从牲畜体内取出的棘球蚴囊液仍然是囊型包虫病诊断用抗原的主要来源，是迄今为止使用最广泛的抗原之一。

【制备】

从屠宰场新鲜采集多个绵羊肝细粒棘球蚴，将囊液混合后，3000r离心15min，透析24～48h将其浓缩，取上清测蛋白含量后备用。亦可将其经正常人IgG结合的溴化氢活化的琼脂糖4B凝胶吸附以进一步纯化。

【应用】

用于各类免疫方法检测包虫病的筛查粗抗原之一。与其他寄生虫感染有交叉反应。

2.头节抗原（EgP）

【性质】

EgP是羊肝细粒棘球蚴含头节囊液的组织提取物。用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨出20个主要蛋白组分。其中分子量为27 000和28 000蛋白的免疫反应在一定程度上随病人的治疗效果而变化。

【制备】

羊肝细粒棘球蚴含头节囊液经离心后分离沉淀的包虫头节，以胃蛋白酶处理，滤纸过滤并弃滤液，再用0.15MpH7.2PBS洗涤3次，加抑肽酶制成悬液，经-80℃反复冻融，超声处理（45W10～15个循环，每循环10s开5s关），至显微镜下观察无完整头节为止，4℃稳定1h，10 000r离心30min，取上清即为制得的抗原。亦可将其经正常人IgG结合的溴化氢活化的琼脂糖4B凝胶吸附以进一步纯化。

【应用】

用于各类免疫方法检测包虫病的筛查抗原之一，敏感性优于EgCF，特异性同EgCF，EgP是囊型包虫病病人随访中的一个有用的候选抗原。

3.抗原B

【性质】

是从囊液抗原经纯化而制备的耐热性脂蛋白。抗原B加热后不变性，为一种分子量约为160 000的耐热脂蛋白。抗原B是一个具有高免疫原性的分子，其主要亚基的N末端具有B细胞抗原表位，这个特征决定了它在免疫诊断中的价值。

【制备】

将粗囊液抗原，对0.005mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液透析过夜，以15 000r离心1h，弃上清，沉淀物以0.2mol/L，pH8.0的PBS溶解，并用半饱和硫酸铵除去IgG，再取上清煮沸15min，15 000r离心1h，弃沉渣，除去囊液中的IgG成分及除去不耐热抗原；取上清超滤浓缩即为EgB抗原。

【应用】

过去被认为是“普遍”存在的抗原B，目前则认为是CE的特异性抗原（>90%），仅与其他绦虫病有交叉反应。经SDS-PAGE凝胶电泳纯化的绵羊棘球蚴囊液证实：B抗原是寄生虫对宿主嗜中性粒细胞的恢复有抑制性作用的蛋白酶，同时也是与包虫病临床状态有关的抗原指标。抗原B的敏感性在酶联免疫法中可达80%左右，免疫印迹法在8-24KDA亚单位检测中敏感性为70%左右。Meta分析认为自然抗原B及重组抗原B用ELISA法检测细粒棘球蚴病具有较大的诊断价值。

4.人工重组抗原B

【性质】

性质同抗原B。自然抗原存在抗原活性不稳定，以及不易标准化等问题，而重组抗原可以稳定地大量获得，易于标准化，甚至可以通过基因改造以提高重组蛋白检测的特异性。

【制备】

用基因工程的方法构建融合质粒，再转染宿主菌，得到重组体JM109-pMalAgB（rAgB.MBP）；采用亲和层析法纯化抗原，获得了人工合成的具有生物活性的蛋白质——rAgB-MBP。

【应用】

经血清学检测证实重组抗原诊断细粒棘球蚴具有和天然抗原相似的敏感性和特异性，并且可以区别病期和评价疗效。但目前实验室试用其抗原的敏感性仍低于自然抗原B的反应。

5.Em2及其重组抗原和Em2 plus

【性质和来源】

Em2是目前使用较广的泡球蚴特异性抗原，是由实验性感染泡状棘球蚴动物体内取得的泡球蚴组织提取并经亲和层析纯化而得的一种分子量约等于54kDa的糖蛋白，是泡状棘球蚴角质层的一种组分，可在病人体内长期存在，具有较高的敏感性和特异性，Em2-ELISA已被WHO确定为泡型包虫病（AE）免疫诊断的参照指标。

【制备】

①人工感染的长爪沙鼠腹腔泡球蚴组织剪碎，加等量PBS后制成匀浆，-80℃冻融，超声粉碎；3000r离心，上清用5μm微孔膜过滤后，对PBS透析制成Em粗抗原。②将羊包虫囊液4000r离心，上清用超滤法浓缩，制成Eg囊液粗抗原；将Eg囊液粗抗原免疫兔，获得兔抗Eg免疫血清，用饱和硫酸胺或DEAE柱离心交换层析提取抗体IgG；将提取的Eg囊液抗体IgG偶联CNBr活化的琼脂糖4B制成抗体吸附柱。③将Em粗抗原加入此抗体吸附柱进行免疫吸附，最后得到的不吸附部分为特异的泡球蚴抗原可被洗脱下来。④其后又将此抗原通过正常人类混合血清IgG偶联CNBr activated sepharose 4B的层析柱，从而可作为泡球蚴病的纯化诊断抗原Em2。

【应用】

Em2是泡状棘球蚴板状层成分，其抗体滴度的消长不能反映病灶的活动与否。在已被药物治疗的病灶或虫体钙化的病人中仍可以出现Em2-EILSA高滴度阳性的结果。Em2plus-ELISA具有一定的诊断价值，但由于Em2/3-10抗原基因在E.g（细粒棘球蚴）和E.m（泡状棘球蚴）中均存在，故与CE的交叉反应仍很难解决。国外已经有商品化的Em2plus-ELISA试剂盒用于泡型包虫病的免疫诊断，该试剂盒具有较高的敏感性，但与囊型包虫病具有较高的交叉反应，特异性较差。

6.Em18及重组抗原rEm18特异性泡型包虫病诊断抗原

【性质】

Em18抗原是泡球蚴种特异性抗原组分，分子量为18kD。

【制备】

应用免疫印迹分离出的Em18是自然抗原Em18的主要制备方式，但产出低，很难进行商品化，所以重组抗原rEm18目前普遍使用。其制备方法是：利用大肠杆菌BL21（DE3）表达重组质粒pET41a-Em18，将其转化至E.coli BL21（DE3）中，37℃恒温孵育过夜。次日，挑取单菌落接种到含60mg/L卡那霉素的LB液体（Lural Broth）培养基中振荡培养过夜。以1∶20的比例将过夜培养物扩大培养，37℃ 400r/min离心2h，至菌液吸光度值A600为0.8时，加终浓度为1mmol/L的IPTG继续培养。收集诱导了4h的培养物，室温12 000r/min离心5min，弃上清。用预冷的1×PBS（pH7.4）重悬菌体洗涤3次。将洗涤后的细菌重悬于预冷的1×PBS（pH7.4）中。加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰浴轻混10min，加入蛋白酶抑制剂（Pepstatin 1μg/ml，Benzamidine Hydrochloride 2μg/ml，Aprotinin 2μg/ml，Leupeption 2μg/ml，PMSF 10mmol/L），加入DTT至终浓度为5mmol/L，充分混匀后超声处理。其程序：工作1s，间歇3s，每个循环时程为10min。超声破碎后，加入1%的NONIDET P40，充分混匀，4℃12 000r/min离心20min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。利用His柱纯化rEm18 GST蛋白，SDS-PAGE电泳分析。

【应用】

泡状棘球蚴特异性抗原的鉴定是泡型包虫病早期诊断以及与囊型包虫病鉴别的前提。泡状棘球蚴免疫诊断抗原从早期的细粒棘球蚴诊断抗原如EgHF、抗原B到同种Em粗提物如EmC均存在属间和种间的交叉反应，特异性较差。尽管细粒棘球蚴绦虫和多房棘球蚴绦虫有许多共同抗原。但二者在流行病学和形态学方面明显不同，使用囊液粗抗原提取物及Em2作为抗原的大部分血清学试验，并不能鉴别AE和CE。

有学者提出应用免疫印迹分离出的Em18，或使用来自幼虫的重组抗原以及使用一种纯化抗原—碱性磷酸酶抗原有助于AE和CE的鉴别。近年来日本学者Ito等经过免疫印迹试验提出Em16/Em18抗原对泡型包虫病具有很高的特异性和敏感性，认为Em18可以与Em16具有种特异性，敏感性可以达到100%。江莉等用免疫印迹法对细粒棘球蚴和泡状棘球蚴的18kDa抗原在识别两型包虫病病人血清中抗体的特异性反应进行了比较研究，发现两种原头节的18kDa抗原对泡型包虫阳性检出率均为90.9%；对囊型包虫病血清的阳性检出率分别为10.1%和13%；对囊虫病的阳性反应率为13.3%和16.7%；与健康人血清不发生反应，可有效鉴别两型包虫病。但也有一些研究结果提示Em16和Em18亦存在于E.g中，李淑萍等用泡球蚴原头节蛋白抗原免疫印迹法检测，结果表明：Em16和Em18并没有表现出很好的诊断价值，泡型包虫病、囊型包虫病和健康人血清在Em18条带处均有很高的交叉反应。小分子量条带中只有25kDa表现出有较好的泡型包虫病诊断特异性。但其敏感性只有20%。近期以rEm18和辣根过氧化物酶标记的rEm18为检测试剂的双抗原夹心法ELISA试剂研究表明其与附录Ⅱ所描述的点免疫胶体金渗滤法（DIGFA）包虫病特异性抗体检测试剂盒相比，敏感性和特异性更优。

附录II：点免疫胶体金渗滤法（Dot Immuno-Gold Filtration Assay，DIGFA）的实际应用评价（Feng et al.，2010）

1.点免疫胶体金渗滤法（DIGFA）的检测功能的初步验证

通过对医院内手术确诊包虫病人及健康对照者血清样本（n=108）的初步评估，不同抗原金标免疫渗滤法检测人体CE的灵敏度分别为EgCF：92.6%，EgP：90.7%和AgB：89.8%；灵敏度最高的是抗原EgCF（CE 92.6%和AE 88.2%），而抗原Em2检测人体AE（n=43）的灵敏度为是91.1%。AgB检测CE的特异性是88.1%（82.0%～94.2%），Em2检测AE的特异性是93.6%（89.4%～97.8%）。DIGFA检测人体CE和AE时存在交叉反应，AgB对AE有35.3%的交叉反应，Em2对CE有7.4%的交叉反应。结果显示，利用金标免疫渗滤法与利用上述4个天然抗原的标准ELISA方法相比，没有统计学上的差异（p>0.05）。

2.点免疫胶体金渗滤法在临床上诊断应用的评价

使用1999年9月到2006年4月间在新医大一附院治疗的包虫病人和非包虫病人对照血清（n=899，CE=857，AE=42）来评价点免疫胶体金渗滤法（DIGFA）的诊断价值，其检测CE的灵敏度（80.7%）低于初步验证时（p<0.01），总体特异性为93.4%（695/744）；其中28/42的AE病例有交叉反应（表2）。Em2在该组实验中对AE的灵敏度（90.3%）与初步验证时（91.1%）之间没有统计学的差异（p>0.05）（表3）。但Em2显示对17%（146/857）的CE病例有交叉反应。DIGFA对不同器官CE的灵敏度为：多脏器94.4%，肝脏83.4%，肺80.7%，盆腔80%，腹腔70%，其他器官（包括心脏、肾、大脑、脊椎、骨骼、皮下）56.7%。ELISA法与DIGFA相比，对CE病人有较低的灵敏度（75.0%）和较高的特异性（97.6%）（p<0.01），对AE病人的灵敏度相近（97.6%、92.9%）（p>0.05）而特异性不同（80.1%、90.3%）（p<0.01）（表1和表3）。总的来说，非包虫病人的血清用DIGFA检测时有10.4%的假阳性率，DIGFA和ELISA法在非包虫病人血清中的特异性均为83.8%（588/702），其中AgB为94.2%（661/702），Em2为95.7%（672/702）。

3.点免疫胶体金渗滤法在中国西北地区流行病学社区调查中诊断应用的评价

在流行病学社区调查研究中，以B超检查结果为金标准，免疫胶体金渗滤法（DIGFA）显示了对AE的较高灵敏度（90.7%）和对CE的较低灵敏度（71.8%），特异性为CE：78.1%，AE：97.6%。DIGFA检测B超查出的CE病人（n=160）和AE病例（n=108）血清中，AgB对CE有较低的灵敏度（51.3%），而Em2对AE的灵敏度为77.8%（表4）。本研究中AgB对CE的特异性是94.6%，Em2对AE的特异性为97.1%（表5和表6）。AgB对AE的交叉反应高达68.6%（74/108），而Em2对CE的交叉反应为11.3%（18/160）。

4.假阳性和假阴性

临床检测确诊为包虫病病人的血清，用DIGFA和ELISA检测均为阴性的占14.6%（131/899）。假阴性CE病例的临床特征往往表现为：内囊塌陷、变性、坏死（CE4），实变或钙化型囊肿（CE5），或小的单纯囊肿（CE1），单个小型囊肿且位于器官较深的部位（WHO/OIE，2001）。新医大一附院非包虫病人中血清假阳性率为10.4%（73/702），这些非包虫病人包括影像学证实的单纯囊肿（非寄生虫）、肿瘤或结核，其中3例囊虫病例用DIGFA和ELISA法检查都显示阴性。

验证和应用

目前检测人体包虫病血清学实验室诊断标准，基本上是使用ELISA或免疫印迹方法，采用抗原B检测CE，Em2或Em18检测AE（Gottstein et al.，1983，1987；Zhang et al.，2000，2001；Rogan andCraig，2002；Ito，2002；Craig et al.，2003；Carmena et al.，2006）。检测人体包虫病的快速诊断方法，不仅在资源贫乏的地区中更为实用，而且可对影像学检测进行辅助验证。ELISA法的使用已经非常普遍，但由于酶标记物难以保存和实验方法不适宜在偏远地区运用等情况，受到了一定的限制。

当前研究对快速点免疫胶体金渗滤法诊断人体CE和AE的应用进行了最为全面的评估。发现点免疫胶体金渗滤法有以下特点：

（1）这项检测能够在2～3min内显示可信的诊断结果，仅需20μl血清或40μl全血，而且二者没有明显差异（陈新华等，2005）；

（2）这项检测不仅可以诊断大概80%～93%的人体包虫病病例，而且能够鉴别约80%的CE和AE；

（3）检测步骤简单，不需要特殊的培训，能够与B超检查结合用于社区流行病学调查，并且在医院临床诊断包虫病中具有实用价值。

在新疆医科大学第一附属医院通过影像、病理学和（或）手术验证了CE和AE病人及非包虫病人的1601个血清样本中，金标免疫渗滤法检测CE的灵敏度为80.7%（692/857），AE的灵敏度为92.9%（39/42）。临床检测比初步实验室验证的灵敏度低，可能是因为临床病例中包括术前CE病例，而既往研究认为术后CE血清的抗体阳性率高于术前血清。其总体特异性为89.6%（629/702），其中抗原B对CE的特异性为93.4%，Em2对AE的特异性为90.3%。

当点免疫胶体金渗滤法（DIGFA）应用于中国西北地区（例如新疆、宁夏、四川、西藏）的社区流行病学调查研究时，显示出比临床检测稍低的灵敏度（CE为71.8%，AE为90.7%）和特异性（总体为74.4%，抗原B对CE的特异性为94.6%，Em2对AE的特异性97.1%）。重组抗原B（rAgB）也可以用于DIGFA检测，而且更容易标准化，但是在最初的研究中显示较低稳定性和灵敏度（X.Feng，未发表的研究）。在偏远地区，DIGFA检测结合B超检查联合诊断包虫病仍然是非常有效的方法。在流行病学调查中，DIGFA可在1h之内（包括全血采集，血清析出和离心等）得出结果，每天最少能检测200个以上血清。普查时运用B超联合金标免疫渗滤法血清学检测，能够鉴别出来超过80%的CE和AE病例，从而可有效促进临床治疗和随访。

流行病学调查与临床病例检测相比较时，DIGFA敏感性较低的原因之一可能是因为存在非腹部的包虫病灶，尤其是无法进行超声检测的病灶（如肺包虫等）。在社区调查中，包虫病高流行区比低流行区和医院临床病例中，“假阳性”病例要更多见一些，这是由于高流行区存在较高比例的无症状病人，他们与寄生虫接触后可能不发病而自行痊愈（Craig et al.，2000；Yang et al.，2006a，b）。而敏感性在社区调查中较低的可能原因还有：超声影像不能完全证实的占位性病变（如需要CT或MRI来证实的肿瘤、脓肿、非寄生囊肿等），或者囊肿或病变很小、实变、钙化或坏死。常见的包虫病特异性抗体检测不出的原因还取决于数量、大小、位置和囊肿的状态（Gavidia et al.，2008）。DIGFA检测住院病人的CE病例的假阴性率为19.3%（165/857），AE为7.1%（3/42），CE假阳性率为6.6%（49/744），AE为9.7%（151/1559）。DIGFA检测能够鉴别出约80%CE和AE病例，而CE病例血清Em2呈现阳性反应的比率为17.1%（146/857）。DIGFA检测和ELISA法检测结果基本一致（假阴性率为CE：25.0%，AE：2.4%，假阳性率均为10.3%）。总的来说，ELISA比DIGFA有较低的灵敏度（p<0.01）但具有相近的特异性。AgB和Em2在DIGFA检测CE和AE时显示出较好的特异性（90.3%～97.1%），与其他使用传统ELISA法的研究结果一致。

近期有以rEm18研制双抗原夹心法ELISA检测试剂，认为就泡状棘球蚴病而言，其敏感性和特异性更佳。

综上所述，点免疫胶体金渗滤法（DIGFA），3分钟即可观察结果快速诊断人类CE和AE，它同时使用4个天然或半纯化抗原，即EgCF，EgP，AgB和Em2。其中细粒棘球蚴原头节抗原EgP和囊液抗原EgCF提高了检测的灵敏度，细粒棘球蚴部分纯化的抗原B（AgB）和多房棘球蚴抗原（Em2）则保证了检测的特异性。点免疫胶体金渗滤法结合超声检查，在中国西部流行病学社区调查中用于诊断和鉴别诊断CE和AE，并获得中外专家的充分认可。

5.包虫病特异性抗体检测试剂盒的转化成功后又积极地向新疆的包虫病高发区的医院和疾控部门进行了推广应用。新疆、四川、西藏、宁夏和青海共计流行病学调查中应用5万余人份，临床应用6千余例，得到各地州的一致认可，列入其指定筛查试剂盒。

（张朝霞、冯晓辉、齐新伟）