第二节 分枝杆菌液体培养
一、检验目的
分离培养临床标本中的分枝杆菌。
二、方法原理
液体培养基因能为结核杆菌提供充足的营养，利于结核杆菌的生长。自动化的分枝杆菌培养系统，配备相关的检测仪器，通过仪器检测分枝杆菌生长过程中产生的化学信号等变化，自动报告监测结果。
BACTECTM MGITTM960，是通过检测液体培养基中消耗氧气（O2）的量来确定是否有细菌生长。MGIT培养管底部的硅树脂中含有氧淬灭荧光剂，当细菌生长过程中吸收散布在培养管中的O2，排放出CO2。随着管中O2的逐渐损耗，荧光剂不再被抑制，当使用紫外光进行观察时，MGIT培养管便会发出荧光。并且，荧光的强度直接与O2的消耗成正相关。对于结核分枝杆菌来说，在阳性情况下，每毫升培养基中大约有105～106个菌落构成单元（CFU）。如果6周（42天）之后，该仪器仍为阴性，则表示培养管为阴性。
BacT／ALERT 3D微生物检测系统是通过检测液体培养基中释放CO2的量来确定是否有细菌生长的。如果培养管中有微生物存在，通过代谢产生CO2，这时培养瓶底部的透气传感器颜色发生变化使系统监测的反射率增加，发光二极管（LED）将光线投射到传感器上，由一个光电探测器测量反射光。产生的CO2越多，则被反射的光就越多。将产生CO2的量值与标本瓶中初始的CO2水平相比较，通过仪器报告阳性或阴性。
Versa TREK／ESP培养系统Ⅱ通过自动监视培养基瓶子顶部的氧气消耗量来查看结核菌的生长，并且通过报警方式反应出来。细菌生长时会产生或消耗气体，仪器通过压力感应器感应培养瓶内的压力变化，从而判断是否有细菌生长。
三、检测样本
痰标本、咽拭子、胃灌洗液、其他体液标本、组织等。
四、仪器设备
1.Ⅱ级生物安全柜。
2.恒温培养箱。
3.涡旋振荡器。
4.冷冻离心机（水平转子、具备防气溶胶的离心杯（桶）、相对离心力能达到3000xg）。
5.天平。
6.蒸气恒温箱。
7.高压蒸气灭菌器。
8.液体培养系统：如BACTECTM MGITTM960操作系统、BacT／ALERT 3D微生物检测系统、Versa TREK／ESP培养系统Ⅱ。
五、试剂耗材
1.6%氢氧化钠（NaOH）溶液。
2.2.9%柠檬酸钠（citrate－2H2O）溶液。
3.N－乙酰－L－半胱氨酸（N－acetyl－L－cysteine，NALC）。
4.磷酸盐缓冲液（pH6.8，0.067mol）。
1.50ml离心管。
2.2ml无菌吸管。
3.相应液体培养系统所需的液体培养管（瓶）及试剂：
（1）BACTECTM MGITTM960操作系统：MGIT 7ml培养管、生长添加剂、PANTA。
（2）BacT／ALERT3D微生物检测系统：BacT／ALERT MP处理瓶（红色瓶盖）、冻干的抗生素补充剂、MB／BACT复溶液。
（3）Versa TREK／ESP培养系统Ⅱ：VersaTREK分枝杆菌培养瓶、促生长剂、抑菌剂。
六、操作步骤
（1）拿出MGIT 7ml生长指示管、生长添加剂、PANTA，检查MGIT生长指示管有无破损及污染（管中液体出现浑浊）。
（2）将MGIT PANTA与15ml MGIT生长添加剂重新混合。
注意：该混合物在2～8℃可稳定保存7天。在保存前贴上标签，包括内容物、配制时间、有效期及配制人信息。若7天内不能用完，可当时分装，置于－20℃以下的温度，保存6个月。
（3）在生长指示管上标记标本编号。
（4）用移液枪在每个MGIT管内添加溶解后的0.8ml PANTA／生长添加剂混合物，注意操作不要污染管，盖紧MGIT管。
（1）拿出BacT／ALERT MP处理瓶及MB／BacT抗生素补充剂试剂盒，检查处理瓶有无破损及污染。不要使用传感器转为黄色或呈混浊的瓶子，这些都可能是受污染的表现。
（2）以无菌操作的形式向MB／BacT抗生素补充剂小瓶中加入10ml的MB／BacT复溶液，让这些块状固体溶解，轻轻混合内容物。
注意：一个小瓶的复溶后MPB／BacT抗生素补充剂可能足够用于20个BacT／ALERT MP处理瓶。一旦抗生素补充剂已进行了复溶，它放置在2～8℃时有7天的保存期。已复溶的补充剂的最后使用期限必须记录在小瓶的标签上面。若7天内不能用完，可当时分装，置于－20℃以下的温度，保存6个月。
（3）在每一个BacT／ALERT MP处理瓶上标记标本编号。
（4）从每个培养瓶上移走塑料弹性盖子并使用一块酒精垫或相同功用的方法进行消毒。在加入已复溶的抗生素或者加复溶液之前要保证隔膜是干的。使用无菌技术，对每个用于培养的BacT／ALERT MP处理瓶，加入0.5ml的MB／BacT抗生素补充试剂。
（1）用酒精消毒抑菌剂瓶盖，注射器取25ml无菌蒸馏水或离子水注入抑菌剂瓶中，混匀溶解。
（2）用酒精消毒培养瓶盖，吸取1ml的促生长剂注入培养瓶中。
（3）用注射器吸取0.5ml抑菌剂溶解液注入培养瓶中。
标本前处理方法为中和离心法，具体操作见本章第一节分枝杆菌固体培养。
注：同时可接种0.1ml样本到Middlebrook 7H10琼脂或其他固体培养基上。
将MGIT 7ml管放入仪器内进行孵育，等待仪器自动报告结果。
按照操作手册将接种的BacT／ALERT MP处理瓶放到BacT／ALERT 3D系统中进行孵育，等待仪器自动报告结果。
（1）打开VersaTREK连接器封膜，垂直把连接器的针头插入培养瓶。
注：当连接器插入瓶后不能再颠倒培养瓶，应为液体进入到连接器的针头内，会干扰仪器对压力的监测。
（2）把装有连接器的培养瓶放入VersaTREK血培养仪自动孵育监测（在仪器孔位放入分枝杆菌适配器），等待仪器自动报告结果。
七、阳性培养管的进一步处理及报告结果
一旦MGIT培养管、BacT／ALERT MP处理瓶、VersaTREK分枝杆菌培养瓶通过仪器报告或肉眼观察检查呈阳性，则应该准备涂片并使用萋－尼氏染色液进行染色、镜检观察确认。
1.涡旋震荡使阳性培养管中液体混合，对于MGIT 7ml培养管用2ml无菌移液管吸取1ml液体至2ml无菌离心管中。对于BacT／ALERT MP处理瓶或VersaTREK分枝杆菌培养瓶，先用酒精棉消毒瓶口，然后用1ml注射器吸取1ml液体至2ml无菌离心管中，吸出液体后，再次用酒精棉消毒瓶口。
2.对离心管进行离心（12 000rpm，5分钟）。
3.在生物安全柜中打开离心管，用移液管轻轻弃去上清，留下沉淀物及大约100μl液体。
4.轻轻涡旋离心管2～3秒。
5.用移液管吸取离心管中液体进行涂片。
6.在火焰上加热数次或使用载玻片加温器在65～70℃的温度下加热2小时。
7.以上1～6程序必须在生物安全柜内操作。
8.进行萋－尼氏染色。
9.在经过染色和完全风干的涂片上滴一滴镜油，在低倍物镜下观察染色细菌的位置。转至油浸物镜，仔细观察，确认是否是抗酸杆菌阳性，若为阳性则报告液体培养分枝杆菌阳性。
如果肉汤出现浑浊或污染，则不考虑抗酸杆菌涂片结果，使用血液琼脂，巧克力琼脂或TSI琼脂作为传代培养基，判断是否存在污染细菌（37℃培养，48小时后观察）。
如果涂片呈抗酸杆菌阴性，培养管未被污染（肉汤透明），在5小时内重新将MGIT培养管放回BACTECTM MGITTM960操作系统中培养。
如果涂片呈抗酸杆菌阴性，培养管未被污染（血琼脂平板上无杂菌生长），也可将培养管放入37℃培养箱中，7天后对涂片重新进行抗酸杆菌染色处理。若为阳性，则报告液体培养分枝杆菌阳性。若为阴性则报告液体培养阴性。
八、注意事项
1.阳性管应该立即进行快速抗酸染色。
2.培养6周的阴性管应该肉眼观察是否发生污染（严重的混浊）进一步确诊。在丢弃试验管前应用肉眼检查是否有混浊或小颗粒存在，阴性管不可重复使用。
九、质量控制
质量控制参照上一节固体培养室内质量控制、室间质量控制、质量提高。具体质量控制如下：
（1）请参考仪器操作说明，按照要求每天对仪器进行系统检测及维护。
（2）每月打印质量控制报告（由仪器打印产生）。
1）在接收培养管时，检查是否损坏或破裂，培养基未被污染也没有外观改变。
2）记录接收培养基及添加剂的批号和有效期及数量。
3）建议接收新一批培养基时进行常规质量控制检测。推荐使用结核分枝杆菌H37Rv。
菌液制备及接种操作过程：
①在磨菌瓶中加入1～2滴无菌10%吐温－80水溶液。
②用无菌接种环刮取在LJ培养基上生长1～2周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。
③注意：尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑取1、2个单独菌落进行试验，刮取菌落的量以半环或一环（5～10mg）为宜。
④旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒。
⑤静置5分钟，小心打开瓶盖，加入约2ml灭菌生理盐水，静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀。
⑥用无菌吸管吸取上清菌液，约0.5ml，转移到另一无菌试管中，与标准麦氏比浊管（MacFarland No.0.5）比浊。
⑦逐渐滴加灭菌生理盐水，直至菌液浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.0.5）一致。
⑧在标记好的MGIT培养管中添加0.8ml MGIT PANTA／Growth Supplement（杂菌抑制剂／生长添加剂）。
⑨将制备好的0.5McFarland菌液用无菌生理盐水做如下稀释，接种0.5ml于MGIT培养管中。
⑩将培养管放入BACTECTM MGITTM960操作系统或37℃培养箱中，若培养报阳时间符合上表时间，则培养基质量合格，可以用于实验。
1）在接收培养管时，检查是否损坏或破裂，培养基未被污染也没有外观改变。
2）记录接收培养基及添加剂的批号和有效期及数量。
3）建议接收新一批培养基时进行常规质量控制检测。推荐使用结核分枝杆菌H37Rv。
菌液制备及接种操作过程：
①菌液制备方法同MGIT培养管质量控制方法，最终制备成1McFarland菌液，将制备好的1McFarland菌液用无菌生理盐水做如下稀释，加0.5ml复溶的MP／BacT抗生素补充剂到每个需要进行测试的BacT／ALERT MP处理瓶中。
②将制备好的1McFarland菌液用无菌生理盐水做如下稀释，接种0.5ml于BacT／ALERT MP处理瓶中。
③将培养管放入BacT／ALERT3D微生物检测系统中，若培养报阳时间符合上表时间，则培养基质量合格，可以用于实验。
十、临床意义
液体培养阳性一般作为快速培养分枝杆菌的方法，为临床诊断结核病缩短了时间。