第三节　分子鉴定技术的发展趋势

随着基因组测序技术的不断进步，使DNA序列分析的成本大大下降。同时，由于测序项目的指数级增长、序列分析仪器自动化程度的空前提高，使基因序列数据量以及相关技术得到了极大的发展。由于可利用的基因序列和克隆数据库的大量增加，使某些重要中药进行高通量分子鉴定的开发研究成为可能。

中药DNA分子鉴定发展至此，多项技术已日趋成熟。现在已迈向高通量检测的目标，除了前述的DNA芯片技术外，还包括自动化仪器、PCR-ELISA、多重PCR以及全基因组测序。此外，正积极开拓恒温扩增技术，望能令技术更普及。

一、自动化仪器

DNA技术的每一个步骤，例如DNA提取、纯化、克隆或PCR扩增、PCR循环测序反应以及DNA测序等，现在均可实现自动化操作。自动化操作的优点包括缩短检测时间、增加样本数量、避免人为错误等（如有处理分析的机械人可进行自动加样等重复工序）。随着实验仪器的不断改良，市场上已推出多种自动机器。现在市面上已有样本粉碎机和自动核酸提取机，估计不久的将来，由提取DNA到测序，都可实现简约化及全自动化操作，有利于实现DNA鉴定成为一项常规检测手段。

二、PCR-ELISA技术

虽然有关中药DNA芯片鉴别的可行性研究报告已见发表，但暂时仍未有中药DNA芯片商品上市。制备芯片需要专门仪器进行点样，并非每个实验室都可负担，况且目前药材的特异性探针，远远低于芯片可容纳的数目。如果只为区分十几个品种而动用DNA芯片，有大材小用之嫌，未能完全发挥芯片的优势。

PCR-ELISA也是一种高通量的中药鉴别技术，原理跟DNA芯片相似，基于探针与核酸的杂交反应。由于PCR-ELISA跟ELISA一样，都是在96孔或384孔板上进行，所以一般实验室都可自行制备。该技术的操作步骤大致是先制备某一物种特异性的寡脱氧核糖核酸探针，并用生物素（biotin）标记。其次，该探针与从待测中药中得到地高辛（DIG）标记的PCR产物在覆盖链亲和素（streptavidin）的96或384孔板上进行杂交，洗脱后，用抗DIG的单克隆抗体检测杂交产物，并通过自动ELISA比色仪检测特异性PCR产物的数量（图4-1）。

图4-1　DIG标记PCR产物的ELISA检测示意图

①将样本以PCR扩增，扩增产物链上DIG标记；②变性后，加入含生物素（Biotin）的探针进行杂交。如果核酸和探针能互补，两者便会紧紧结合；③将反应物加入96或384孔板上，板壁布满链亲和素（Streptavidin），会与探针上的生物素结合。加入缓冲液冲走未能与探针杂交的核酸；④加入抗DIG抗体，并用ELISA进行检测

三、多重PCR技术

多重PCR（Multiplex PCR）分析技术在20世纪80年代第一次被开发是用于肌营养不良蛋白（dystropin）基因缺失测试（Camberlain等，1988），此后不断用于多种疾病的临床诊断（Nandi等，2000；Schroer等，2000）。1993年开始用于亲子鉴定（Fuentes等，1993），近来又用于基因快速分型检测（Anslinger等，2000；Choi等，2000；Hashiyada，2000）。目前正在建立一个国际人类基因分型数据库，因为绝大多数基因分型用的分子标记是遗传信息最丰富的微卫星区短串联重复单位。由于其等位基因长度较短，易PCR扩增，检测的灵敏度高，可以同时扩增15个或更多的基因位点。如与多维荧光染色技术和毛细管电泳技术结合，它将会成为最常用和高重现性的分子分析方法（Hayden等，2008）。

对于中药鉴定，多重PCR与常规PCR相比，特别适合于指纹图谱技术（如SCAR、ARMS）。通过设计多对特异性引物，便可同时分析物种间的多个特异性位点。同时，多重PCR可在每个反应管加入一个阳性对照（positive control），可避免样本由于PCR抑制物存在所导致的假阴性结果。因为在指纹图谱中如果没有扩增谱带，可能由于引物跟模板DNA不相配，即样本并非目标品种，但亦可能由于DNA模板或PCR试剂质量差。加入阳性对照引物，分析图谱时便可排除这个因素。此外，多重PCR所需试剂及样品量较少，因而减少大量人力资源，其难度在于探索出一个合适退火温度能让多条引物同时扩增。最近韩国学者利用此项技术成功鉴定韩药材藁本（细叶藁本）Ligusticum tenuissimum和知母Anemarrhena asphodeloides、何首乌Polygonum multiflorum（Fallopia multiflora）和白首乌Cynanchum wilfordii（Jigden等，2009，2010；Moon等，2010），就是一个良好的开端。

四、高通量基因组扩增与测序技术

DNA技术是凭物种间DNA序列相异处作鉴定依据，数据越多结果越可靠。在指纹图谱、DNA测序和DNA芯片这三大类技术之中，以DNA测序最为准确。现时受成本及时间所限，一般只会检测基因组中特定位置，亦即DNA条形码。但其实这是一种妥协技术，因为条形码只含1000个碱基左右的信息，较合适的应将所有基因序列解读比较，才可全面反映物种间的差异。随着基因组测序技术的快速发展，全基因组测序（whole genome sequencing）已踏入实用化阶段。如果时间以及资金充裕，可对一个生物全基因组进行测序。同理，基因组测序技术或叶绿体基因测序技术可应用于中药的鉴别。如采用变性寡核苷酸引物PCR（DOPPCR）技术进行全基因组扩增（Jordan等，2002；陈士林，2010），然后对一组扩增片段进行测序，所得基因序列用作DNA指纹鉴别的参照标记或特异引物设计。

五、恒温扩增技术

常规PCR过程中，作为模板的双链DNA要经过变性程序（加热至94℃），令双链结构分解成单链，才可让引物在退火过程中（通常40～ 60℃之间）和模板上的互补区结合，然后进行第三步骤伸延程序。因此，PCR必须在一个可反复加热和冷却的仪器下方可进行，但一般的PCR仪不利于室外操作。恒温扩增技术的特点，是可在恒温下进行DNA扩增，例子包括SDA（链置换扩增技术strand displacement amplification）（Walker等，1992）、LMAP（环介导等温扩增技术loop-mediated isothermal amplification）（Notomi等，2000）、HDA（依赖解旋酶扩增技术helicase-dependent amplification）（Vincent等，2004）等。恒温扩增技术近年主要应用于病理检测，由于约一个小时便可得出检测结果，如配合特别化学物实现可视化观察，特别适合缺乏医疗设备的落后地区。