第三章　肝豆状核变性的病因和发病机制

第一节　肝豆状核变性病因学的研究历程

回顾WD的相关研究历程可以看出，人们对WD的病因学认识经历了一个漫长的过程：在1902—1903年Kayser与Fleischer首次描述本病患者的角膜色素环（该环被后人称作Kayser-Fleischer环，即K-F环）以来，1934年Gerlach和Rohrschneider发现K-F环系过量铜的沉积所致；1948年，Cumings的研究最终证实了该病患者的肝脏和脑内有过量的铜沉积，并首先提出使用二巯丙醇（BAL）等重金属络合剂治疗可能有效；1952年，Scheinberg和Bearn等分别发现本病患者存在CP合成障碍，血清CP水平明显低于正常；自1993年WD基因被成功定位克隆后的三十余年以来，WD病因学的研究才不断深入。本节以WD基因的定位克隆为界限，简要地回顾近一个世纪以来的WD病因学研究历程。

一、肝豆状核变性基因定位前的病因学研究

WD与重金属的关系很早就受到人们的关注，其中最早的研究当首推Rümpel（1913），但他最初怀疑WD与银中毒有关。Galli（l968）发现WD患者尿中钼的含量显著减少，自正常健康人的平均值7～9μg/24h减少至1.9μg/24h，而钼在WD的肝脏内沉积却较正常人高2倍、脑内增高3倍（Butt，1958）。后来发现，这些重金属在WD体内的变化，都是铜代谢异常所引起的。

早在1922年Siemerling首先注意到WD患者存在的向日葵样白内障，推测可能与铜中毒有关。Fleischer（1913）在报道WD患者的角膜周围弹力层存在的异常色素环时曾推测此色素环是由于银和铜在角膜组织的沉着。Haurowitz（1930）证明WD患者肝脏内各小叶含铜浓度弥漫性增高，脑基底节的含铜量较正常人高100倍。Mandelbrote等（1948）发现本病患者的尿排铜量增加达31.48μmol/24h。关于引致本病患者体内铜过量贮积的机制，在WD基因克隆之前有如下几种学说。

1.铜吸收增加

20世纪30年代至60年代，人们臆测WD的铜正平衡状态可能系铜的吸收异常增加或排泄减少所致，Cartwright（1954）将这现象解释是由于WD患者缺乏CP而需要较多铜摄入的缘故。但静脉滴注CP使血浆CP升高时铜吸收并不改变，由此可推断铜的吸收并不依赖血浆CP的浓度高低（Sternlieb，1958）。不少学者对WD患者和健康对照组测定结果发现，WD患者的粪便排铜量显著减少，认为这可能是造成体内铜代谢呈正平衡状态的原因。如Tu（1962）测得WD患者粪铜量为0.52mg/d（正常人1.2mg/d），Zimdahl（1953）报告WD患者为1.3～2.9mg/d（正常人3.9～5.5mg/d）而认为是胃肠道吸收铜增加的缘故。但是，口服64Cu测定WD吸收放射性铜量约54%，正常人为52%；静注64Cu后第3天，WD粪便放射性铜量较正常人轻度增多（Bash，1955），5天后粪便铜检查含量较正常人减少15%，由此证明，WD患者粪便中含铜量的减少，可能是胆汁排铜量减少所致，而非铜吸收增加。

后来多项实验证明，于静注64Cu后1小时测定肝脏含铜量和血浆浓度，WD患者放射性铜迅速进入肝脏内，血浆铜浓度高于健康人；于数小时后再测定，健康人血浆中放射性铜显著增加，明显高于WD患者。因此认为这是CP从肝脏重新向血浆释放引起二次性升高的缘故；而WD患者缺乏CP，因此也缺乏血浆铜的二次升高现象。这些研究结果表明，WD对铜的吸收接近正常，铜代谢异常可能是肝脏排铜障碍所致（Terao，1968；Dekaban，l974）。

2.肝脏组织对铜的结合力异常增加

Loevy（1931）曾臆测WD患者的肝脏和脑对铜具有特殊的亲和力，以解释为什么肝、脑首先受损。Uzman（1956）则推测WD可能由于先天性羧肽酶缺乏，使肝细胞胞质中形成一种具有与铜有强力结合力的蛋白或多肽物质，从而造成血清铜大量地向肝脏内沉积。Evans等（1973）从本病患者的肝脏中分离出一种与铜结合能力比正常人高4倍的蛋白，认为WD患者肝脏的贮铜过多是由于患者脏器中存在这种异常蛋白所致。WD患者口服或静注64Cu测定，64Cu进入肝脏后，从肝向血液再转移的速度较慢，平均为56～76ml/min（正常对照组为98ml/min）（Osborn，1972）；放射性铜排出体外时间延缓更显著，平均为97天，而正常对照组为17天（Willvonseder，1973）。但是，WD患者脑内铜蛋白复合物浓度较正常人高5倍（Wender，1974）；并且口服或静注64Cu后，从肝脏切片发现WD患者吸收放射性铜量仅为健康人的1/2（Neuman，1966）。

后来的研究发现，肝脏中确实存在一种与铜结合力极高的蛋白——金属巯蛋白（metallothionein，MT）。Brewer（1983）研究指出，正常初生儿肝脏含铜量较健康成人高7倍，而血浆铜约是后者的1/4；出生后第4天，肝脏含铜迅速下降一半，血浆铜反升高；至出生后6～7个月，肝脏与血浆铜浓度基本与成人相接近。这是由于胎儿肝脏内MT的含量显著高于成人的缘故。但WD患者肝脏内MT含量与胎儿的几乎一样，因此提出MT代谢失控是WD的主要病因。

MT分子量约为6000～7000。MT分子中的金属通过硫酯键与20个半胱氨酸相结合。113Cd-MRI检测表明，它们分布在两条离生的多核簇中，A簇可与5～6个铜原子（或其他金属原子）结合，B簇可与6个铜原子（或其他金属原子）结合。MT属诱导性蛋白，它是在肝脏内合成的。MT的主要功能是：①储存锌、铜等微量元素。例如，当体内铜含量浓度增高时，可诱发MT合成，即将对于膜系统、多种酶有毒性作用的铜离子合成为无毒的MT储存于肝脏内。②在健康人，MT在肝脏的储存并非永久性的，当体内铜或锌储量降低时，MT可作为金属运输蛋白，直接向脱金属的金属酶供给铜或锌，以合成铜（锌）蛋白。③有人认为，MT还具有酶催化、免疫及解毒等多种功能。

Nartey等（1987）发现，WD患者的肝铜含量高于健康对照组50倍；MT含量较健康对照组高3倍，在肝内73%的铜位于细胞质，并主要以与MT结合的形式存在，其结合力为对照组的4倍。因此认为，WD患者存在着多量与铜具有高度亲和力的MT，使肝脏内的铜与其紧密结合，从而阻碍了铜与原铜蓝蛋白合成CP，引致CP显著缺乏。并且在正常健康人而言，与铜结合的MT单体在肝细胞的溶酶体中聚集成不溶性多聚体，通过胆汁经肠道排出体外，WD患者肝脏内合成的MT单体，不能形成不溶性多聚体，不易从胆汁中排出，而在肝脏内逐渐蓄积，产生肝细胞毒或当肝脏内贮积达饱和状态时，迅速涌入血液，造成溶血现象，或经血液循环分布至脑内，引起神经-精神症状和体征。

3.胆汁排铜障碍

胆道是正常成人排铜的主要途径，体内除生理需要外，过剩的铜大部分从胆汁中排出。一般胆汁排铜量约是吸收总量的50%，而且与小分子多肽结合的铜从胆汁排泄后，几乎不再吸收（Dwen，1964）。因此，纵然胆汁排铜稍微减少，也可能引起铜代谢的显著正平衡（VanBerge Henegoawen，1977）。早年有几个动物实验报告，人工阻塞狗的胆管后4小时，血液中证明有损伤脑组织的“神经毒素”（Crandall，1930）；用纯酒精灌注狗的胆管内引致肝脏损害，接着在显微镜下可见脑组织变性（Mahaim，1925）。任何胆道系统疾病引起胆汁排泄障碍，都将导致肝脏内铜含量增多（Glazebrook，1945）。

Gibbs（1980）用64Cu直接观察有胆道瘘管的WD患者和非WD者的胆汁铜排泄，证实WD患者胆汁中铜含量及每日排铜总量均显著低于非WD者。作者对20例WD和22例非WD对照组分别测定胆汁的微量元素含量，结果是WD组与对照组的胆汁内铜分别为（4.42±0.44）μmol/L、（41.70±9.22）μmol/L（P<0.01），证明WD患者胆汁内含铜量显著低于对照组。Sternlieb（1973）给一名健康妇女和一名WD妇女口服64Cu，于胆囊手术时采取标本以了解胆汁和肝脏的亚细胞成分中铜的总浓度及其特殊活性，结果发现WD患者的溶酶体活性及胆汁内积铜量均十分显著地低于健康人。Sternlieb据此认为WD胆汁排铜障碍与溶酶体功能缺陷有关，后者造成肝脏严重缺乏掌管金属分泌机制的能量，乃使胆汁排铜显著减少，其对WD的发病机制起着重要作用。

4.CP合成障碍

CP是一种具有氧化酶活性的α2-球蛋白，其参与铁代谢、氧化应激反应和组织血管生成等生理过程，对机体组织器官维持正常的生理功能不可或缺。由于人体血浆中95%以上的铜以与CP结合的形式存在，CP也是体内重要的铜代谢相关蛋白。由于大多数WD患者血清CP水平明显减低，曾有人提出WD可能为CP编码基因的突变所致。但后来的研究证实，CP基因突变可导致遗传性无铜蓝蛋白血症（hereditary aceruloplasminemia），患者肝、脑等组织主要出现铁的过量沉积而非铜的沉积。

20世纪50年代，Scheinberg和Bearn等分别发现WD患者存在CP合成障碍，血清CP水平明显低于正常。Garitskboki等（1955）对WD患者及健康对照组的肝脏进行体外实验研究发现，WD患者肝脏内CP的可转录mRNA大量减少，推断出WD患者实验性CP合成率异常减低。Neifakh（1982）以同样的实验方法，无联系的5次实验均表明，WD患者肝脏内CP合成障碍。Graul（1982）用免疫过氧化物酶染色检查WD、健康成人及新生儿的肝脏标本，发现这3组标本含CP量大致相等，因此认为WD患者血清CP缺乏的原因，可能是原铜蓝蛋白与铜结合的缺陷，或肝脏内CP转移到血清的功能缺陷。但Shaposhnikor等用荧光抗体法对肝活检组织进行研究，证明正常人肝组织中存在较丰富的CP，门脉性肝硬化患者的含量约为正常人的70%，而WD患者则不足正常人含量的5%，因而推测WD存在低铜蓝蛋白血症是由于肝脏内CP合成障碍所致。另一方面，Sternlieb等将正常的CP经静脉输给WD患者，测得其在WD患者体内的半衰期与健康人无区别，从而证明WD患者的CP缺乏并非分解代谢率增高所引起。Aspin、Osborn等以64Cu对WD先证者家族进行检查发现，纯合子患者与杂合子携带者均有CP合成障碍。虽然64Cu在纯合子患者的肝脏内蓄积，但其血清中仍不出现CP，杂合子携带者和健康人则64Cu在肝脏内蓄积后不久，血清即出现放射性铜标志的CP，其值分别为1%～3%和7%～8%，说明杂合子的CP合成率亦显著低于健康人。Scheinberg测定88例WD杂合子的血清CP，70例（79.6%）>1.48μmol/L，14例（15.9%）为0.74～1.10μmol/L；4例（5.5%）<0.74μmol/L，表明约20%的WD杂合子血清CP低于正常值，但显著减少者仅5%左右。

总之，WD的病理生理中心是肝细胞内活性型（holo型）铜蓝蛋白合成障碍及铜排泄障碍，造成进入肝细胞的铜蓄积于肝细胞内，开始铜与MT结合为无毒的MT-Cu贮藏，然而，随着铜蓄积渐渐不断增加，超过了贮藏阈值，便可产生过氧歧化酶（SOD）等自由基损伤肝细胞，乃至肝细胞坏死，同时从肝脏向血液中释放出非铜蓝蛋白结合铜，通过血流向脑、肾、角膜等全身脏器沉着。

值得注意的是，多数学者证明并非所有的WD患者都有低CP血症，约有5%的WD患者血清CP浓度正常。因此，CP合成障碍也并不能完全解释WD的病因与发病机制。根据约20%存在低血清CP的杂合子携带者，其肝铜含量并无增高亦无肝脏组织学的改变，故推测CP缺乏虽属WD的遗传基因控制，使纯合子患者和杂合子共同具有不同程度的低CP血症，而杂合子没有显著的胆汁排铜减少并不引起肝铜贮积。WD患者同时存在胆汁排铜减少，造成肝铜过量蓄积。故提出CP合成障碍与胆汁排铜障碍同为两种引起WD不可缺少的发病机制（Scheiberg，1984；Walshe，1976）。

二、肝豆状核变性的基因定位与病因学研究

虽然人们很早就根据家系调查认为WD的遗传形式属常染色体隐性遗传，迨至以色列学者Frydman等（1985）才率先将本病基因定位于13号染色体。1993年底，3个不同的实验室分别将本病基因精确定位于13q14.3，该基因为1465个氨基酸组成的P型铜转运ATP酶（copper-transporting P-type ATPase，ATP7Base），WD基因又称ATP7B基因。ATP7B基因全长约80kb，含有21个外显子和20个内含子，其cDNA编码的ATP7B蛋白分子量约165kD，由金属离子结合区、磷酸酶区、磷酸化区和ATP结合区组成（图3-1、图3-2）。ATP7B基因的定位克隆是本病研究的里程碑式事件，WD的研究从此进入分子生物学时代，与之相关的研究突飞猛进。

随着WD基因的定位和克隆以及多种金属伴侣蛋白（metallochaperones）的发现，人们对WD的病因和发病机制的研究取得了长足进步。现已明确，成人体内存在的铜总量为70～100mg，食物中的铜首先被胃、十二指肠及小肠上部的上皮细胞刷状缘吸收入肠黏膜，经口的铜每日摄取量1.0～2.5mg，经高亲和力铜转运体（high-affinity copper transporter Ctr1，hCTR1）等载体介导进入肠上皮细胞，然后在存在于肠管内黏膜细胞的铜转运ATP酶（ATP7A）作用下吸收至门静脉系统，被吸收的铜大部分被肝脏细胞摄取。在肝细胞内，位于反面高尔基复合体网状结构（trans Golgi network，TGN）的铜转运ATP酶（ATP7B）则将约10%的铜离子与前铜蓝蛋白结合形成CP释放入血并循环至全身，被其他组织和细胞摄取和利用，而其余90%的铜则在位于胆管膜侧的ATP7B作用下随胆汁排出。WD患者因ATP7B基因发生突变，出现CP合成障碍及铜在胆汁中的排泄障碍，并导致过量的铜在肝脏等脏器中沉积而发病。