第三节　细胞内铜转运和铜转运相关蛋白

铜（cuprum，Cu）是人类最早发现的金属元素之一，位于元素周期表第四周期ⅠB族，原子序数29，原子量63.546，在地壳和海洋中广泛存在（在地壳中的含量约为0.01%），是过渡金属元素的一种。铜是人体必需的微量元素，是体内铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）、CP、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶等关键代谢酶的辅助因子，参与生物氧化、神经递质合成、自由基清除、铁代谢等过程，对维持人体正常的生理功能不可或缺。各种原因导致的体内铜过量蓄积或缺乏与许多疾病的发生、发展有密切关系。WD是由于ATP7B基因突变引起的遗传性铜代谢障碍性疾病。近年来，随着对细胞内ATP7B酶及各种铜伴侣蛋白（copper chaperones）等铜转运蛋白功能研究的不断深入，人们认识到细胞内存在一个复杂的铜转运系统以及与之相关的信号转导通路来维持铜的稳态平衡，并对WD的发病机制有了更加深刻的了解。

一、细胞对铜的摄取

现已发现，人和哺乳动物细胞对铜的摄取是由多种金属转运蛋白介导的转运过程，其中包括铜离子转运体1（copper transporter 1，CTR1）、二价金属离子转运体1（divalent metal transporter，DMT1）等，而以CTR1的作用最为重要。目前认为，CTR1对一价铜离子具有高度的亲和力，可将细胞膜上由金属还原体酶（Fre1/Fer2以及Fre7、NADH等）还原的一价铜离子特异性地转运进入细胞内，是铜进入细胞内进行代谢的前提条件。

人Ctr1基因1997年被定位，该基因位于9q34，编码190个氨基酸残基，在各种组织细胞中均见表达，而以肝、肾的表达水平最高。Ctr1蛋白含有3个跨膜区，在N-末端有两个蛋氨酸富集的区域，这些蛋氨酸残基构成MXXM或MXM的特征序列，能够从细胞外的介质中结合铜离子。Ctr1的表达受细胞内的铜离子浓度的影响，低浓度下Ctr1的表达水平明显增高，在高浓度下其表达则受到抑制。Ctr1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞在铜摄取以及铜与铜酶的结合方面都存在障碍，器官和细胞发育中均存在缺陷，子代多在妊娠中期死亡，存活者则表现出脑组织中铜的缺乏，说明Ctr1是哺乳动物不可或缺的铜转运蛋白。

DMT1又称为自然抵抗相关巨噬蛋白2（natural resistance associated macrophage protein 2，Nramp2）或二价阳离子转运体1（divalent cation transporter 1，DCT1），属于可溶性载体家族成员（solute carrier family 11 member 2，SLC11A2），是哺乳动物体内质子偶联的跨膜金属离子转运体，也是迄今为止所克隆的第一个哺乳动物跨膜金属离子转运体。DMT1主要参与铁离子的摄取吸收并参与组织中铁的代谢。相关实验还显示，DMT1也参与铜的跨膜转运，将铜转运入细胞。但是以Cu+还是Cu2+的形式被转运现在尚未确定。

二、细胞内铜的转运与排出

铜被摄入细胞内，在胞质和GSH及MT等结合，并由各种铜伴侣蛋白转运给相应的靶蛋白：与超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白（copper chaperone of superoxide dismutase，CCS）结合转运至胞质的SOD1，与细胞色素氧化酶17（cytochrome-c oxidase17，COX17）结合转运至线粒体内膜上的细胞色素C氧化酶（COX），与抗氧化蛋白1（anti-oxidant1，ATOX1）结合转运至高尔基复合体外侧网络（trans-Golgi network，TGN）的ATP7A/ATP7B。其中，位于TGN的ATP7B将铜离子与内质网中的前CP前体蛋白（Apo-CP）结合形成全铜蓝蛋白（holo-CP）释放入血并循环至全身，被其他组织和细胞摄取和利用，而位于细胞膜的ATP7A和ATP7B均可感受胞内铜的浓度，将多余的铜以分泌囊泡形式排出胞外（图3-12）。

1.铜与CCS结合转运至胞质的SOD1

CCS由249个氨基酸组成，是进化过程中高度保守的蛋白。研究发现，CCS有3个功能区，分别结合、转运铜至SOD1：①Ⅰ区：在N端，有一段与ATOX1类似的MXCXXC结构区域，能结合铜并传递给SOD1；②Ⅱ区：与SOD1有50%相似度，有助于和目标蛋白形成二聚体，是与SOD1靠近并发生作用的关键部位；③Ⅲ区：位于C端，在物种间最为保守，其中的CXC重复序列是Cu+的传递位点。

CCS能特异性地与Cu+结合并转运至胞质的SOD1，使SOD1发挥其生物活性，保护细胞免遭过氧化损害。SOD1是一个含铜和锌的同源二聚酶，催化超氧阴离子的歧化反应分解为过氧化氢和氢离子。CCS的这种传递过程具有专一性，即不会把铜传递到线粒体、细胞核上的其他靶蛋白。SOD1在体外很容易和Cu+结合，而体内却需要一种铜伴侣蛋白来协助结合Cu+，其中的机制尚不明确。

CCS对维持细胞的铜稳态具有重要意义，细胞可以根据周围环境中铜的含量在转录和转录后水平调节CCS的表达。有研究发现，铜缺乏的小鼠和大鼠各器官组织细胞中CCS的表达水平均升高，在铜负荷条件下则下调CCS的表达。

2.铜与COX17结合转运至线粒体内膜上的COX

COX17基因编码含69个氨基酸的酸性蛋白，富含半胱氨酸，分子量为8.2kD。COX17位于胞质和线粒体膜间隙内，接受CTRl转运的Cu+后将胞质中的Cu+传递到线粒体膜间隙，经过线粒体膜蛋白Sco1/Sco2把Cu+分别传递给COX的两个亚单位COX2和COX1的铜结合区。

线粒体呼吸电子传递链的Ⅳ中心酶复合体-COX是一种铜依赖酶，需要铜作为辅助因子进行呼吸电子传递，COX17把铜传递给COX，保证了线粒体氧化磷酸化和保护氧化应激反应时所需的铜，对维持线粒体的铜稳态有重要的作用。COX17缺失可以导致小鼠胚胎时死亡，COX17基因敲除后的细胞增殖下降，COX2缺失，COX参与呼吸链的活动下降，COX2的成熟受到影响。

3.铜与ATOX1结合转运至TGN的ATP7A/ATP7B

ATOX1是第一个被发现具有铜依赖性的金属伴侣蛋白，其基因（Atxl）编码68个氨基酸残基，N末端含有一个保守MXCXXC铜离子结合区域（与ATP7A和ATP7B蛋白的CBDs区对应），从原核到灵长类动物的各种生物体内，具有高度同源性。ATOX1主要位于细胞质和细胞核内，与进入细胞内的铜离子结合，利用ATP水解提供能量，以剂量依赖和可饱和的方式将铜转运到ATP7A或ATP7B的氨基末端。

研究发现，Atxl基因敲除的小鼠细胞中铜含量增加，铜依赖酶活性明显减低，其子代小鼠中有45%在断乳前死亡，其余表现为生长迟缓、皮肤松弛、先天眼缺陷、低色素化、惊厥等。有学者利用同步辐射X射线荧光成像方法，检测了小鼠ATOX1缺陷成纤维细胞内铜的分布，发现ATOX1不仅作为铜伴侣蛋白转运铜离子，也在细胞水平上调节铜的合理分布起着关键作用。还有研究指出，ATOX1可能是哺乳动物一种新的铜应答转录因子，提示ATOX1可能以一种新的方式参与体内铜含量的调节。

4.ATP7A/ATP7B将多余的铜转运出细胞外

ATP7A和ATP7B均是P型ATP酶家族进化高度保守的跨膜蛋白，两者的氨基酸序列大约有54%～65%的同源性，在与铜离子结合后激发ATP水解并将铜离子转运出细胞膜。当细胞内铜离子浓度升高时，ATP7A和ATP7B接受激酶介导的磷酸化作用，分别从TGN重新定位至基底膜（basal membrane）和顶膜（apical membrane），以分泌小囊泡的形式将铜运出胞膜。因此，ATP7A和ATP7B处于细胞内铜转运、铜稳态调节的最核心环节。

除了亚细胞定位的极性不同，两者的表达部位也不相同：ATP7A主要在小肠表达，脑、肾、肺和肌肉等组织也可见表达，而在肝脏不表达；ATP7B则主要在肝脏表达，除脑、肾、胎盘、胃肠道等组织内有少量表达外，其余组织均未见表达。究其原因，有人认为由于ATP7A的CBDs Cu1～Cu6分别由3个外显子编码，而ATP7B则由其最大的第2外显子单独编码，正是这种编码结构的差异导致其表达部位和铜离子转运功能不尽相同。但近来有研究认为这种区别并不明显，在特定情况下两者在基底膜和顶膜均可出现表达，其具体原因尚有待进一步研究。ATP7A和ATP7B的功能活动除受到细胞内铜离子浓度的调节外，其在胎盘中的表达还受到妊娠激素水平的影响，在神经元细胞中受NMDA受体的调控。

由于ATP7A和ATP7B为体内多种铜依赖性代谢酶提供酶促反应所需的铜离子，其功能异常可导致严重后果。MNKD患者因ATP7A基因突变导致ATP7A酶功能障碍，从而阻断肠道对铜的吸收，引起各种铜依赖酶的功能障碍，临床以进行性神经系统变性和结缔组织异常为特点；WD患者则由于ATP7B基因突变导致ATP7B酶功能缺陷，肝细胞内CP合成和胆汁铜排泄障碍，引起血清CP水平减低和铜在肝脏、大脑基底节、角膜等组织脏器中的蓄积，患者表现为急慢性肝损伤、神经/精神症状、角膜K-F环等特征性临床表现。

5.COMMD1协助ATP7A/ATP7B将多余的铜转运出细胞外

近来研究发现，除了上述铜转运蛋白和铜伴侣蛋白外，还有一种蛋白COMMD1（前称为MURR1）参与细胞内铜的排出。对一种常染色体隐性遗传铜中毒模型犬——Bedlington terriers狗的研究发现，由于位于10q26的COMMD1基因突变，其胆汁铜排泄障碍导致铜在肝脏沉积。COMMD1是一组在各组织广泛表达的COMMD蛋白成员（COMMD2～10）之一，在C末端有一段高度保守的序列COMMD1区［copper metabolism（MURR1）domain-containing］。COMM区富含亮氨酸，约由85个氨基酸残基组成。COMMD1可和ATP7B的N末端铜离子结合区结合，协助ATP7B将铜分泌出细胞，促进细胞铜分泌。