第一篇　肝豆状核变性的基础研究

第一章　绪　　言

一、Wilson前时代对肝豆状核变性的文献报道

在Wilson于1912年发表论文Progressive lenticular degeneration a familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver之前，1761年Morgagni及1860年Frerichs先后分别描述肝脏疾病合并神经症状的病例各1例，后人认为，这两例有肝豆状核变性的可能。1888年Willian Gowers（1845—1915）记述一个家族中有4个同样临床表现的患者，其中，1名10岁男孩以震颤、舞蹈运动、手足徐动等不自主运动为临床主要表现，尸检却发现同时存在肝硬化，Gowers未作进一步研究。这个家族中的1位女孩，便是后来Wilson报道4例进行性肝豆状核变性中的1例。1898年Karl Friedreich Otto Westphal（1833—1890）和Ernst Adalf Gustar Gottfried Von Strümpll（1853—1925）报告他们的病例，在临床具有“典型多发性硬化三大主征”：眼球震颤、意向性震颤及吟诗状语言，但是未发现20世纪60年代前认为病理诊断多发性硬化“金标准”的：“多发性硬化斑”，因此命名为“假性多发性硬化（pseudosclerosis）”，这个错误的“肝豆状核变性”诊断名称一直沿用到1921年。

二、Wilson对肝豆状核变性的巨大贡献

Samuel Alexander Kinnier Wilson（1878—1937）于1878年12月6日出生于美国，其父为苏格兰籍，是一位长老会（presbyterian）的专职牧师，曾较长时期在中国从事宣传基督教的教义活动，传教活动结束后，未返回故乡苏格兰，而定居于美国。在其父病故后，其母又多病，因而Wilson返回故乡英格兰Edinburgh郡，并顺利考入Endinberg大学。大学毕业后以优秀的学习成绩被留在Edinburgh大学附属医院内科［当时神经内科（neurology）尚未从内科中独立出来］担任内科住院医师（resident）工作。不久，Wilson与著名医学家Alexander Ninian Bruce的妹妹Annie Louisa Bruce结婚。

其后，Wilson有幸又从Edinburgh大学附属医院调入著名神经病学家Pierru Mari（e1853—1940）创办的、当时在法国享有盛誉的巴黎Basedow医院，受到了如Joseph Babinski（1857—1932）、Charles Foix（1882—1927）、Jacques Jean’Lhermi He（1877—1959）等众多神经病学大师及著名神经病学家的亲授。1904年Wilson 26岁时与Robert Faster Kennedy（1884—1952）一同进入英国国立伦敦皇后广场医院工作，受即将退休的、著名神经病学名师John Hughlings Jackson的热情帮助和指导，并获得注册医师资格。在26～33岁的7年间，由住院医师先后晋升为住院总医师乃至主治医师。在此期间，他汇集了本人临床经验的4例病例以及Gowers（1865）、Ormerod（1890）及Homem（1890、1892）等报告的8例“进行性肝豆状核变性”的病例；这12例患者分别于6个月至5岁起病，共同具有四肢节律性/无节律的震颤和（或）构语障碍、吞咽困难等神经症状；并往往伴有痉挛性笑脸（被Wilson称为本病特有容貌）、情感障碍等精神症状为特征的一组具有家族性、进行性、致命性的疾病；并根据尸检发现双侧纹状体对称性损害，同时存在肝脏损害的病理特征，推断可能为中毒所致。此外，Wilson还回顾了Friedreich于1860年发表的《肝脏病论文》汇编中的1例10岁的男性患儿，其临床与病理所见与他本人观察的4例“进行性肝豆状核变性”患儿完全相同。乃于1912年时年34岁的Wilson在著名神经病学杂志Brain第34卷上发表了以Progressive lenticular degeneration a familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver为标题的、长达213页的巨著，对自验的4例患儿并通过文献回顾从历史的演变对“肝豆状核变性”这一疾病的病史与神经症状体征，以及尸检的病理所见均作了详细的描述。他率先提出具有家族性发病倾向的、进行性豆状核变性合并肝硬化的“奇妙病态”，初步揭开了本病的病理生理本质。由于这篇论文对当代医学的贡献，被Edinburgh大学授予金质奖状。

这篇长篇论文不仅指出了本病完全不出现包括巴宾斯基征和腹壁反射消失在内的锥体束征（但近代医学已证明WD可以出现锥体束征——编著者），而且以肌僵直、震颤及其他不自主运动构成的运动综合征为特征，提出了所谓锥体外系疾病（extrapyramidalen Erkrankunyen）的新概念。其次，Wilson首先指出本病合并肝脏疾病这一非常新的认识，而且也提出了本病属家族性疾病。当然，这篇论文也存在不足之处，由于当时科学技术水平的限制，未涉及常染色隐性遗传的遗传形式，无论临床或尸检均未发现角膜色素环（即Kayser-Fleischer环，K-F环——编著者）的存在，其原因可能是Wilson所尸检的患儿年龄较小，角膜弹力层的铜沉积较轻。当然，Wilson当年更未发现，本病的发病机制是由于铜代谢障碍引起铜沉积，也就未提出有效的治疗措施。迨至1940年，Bruce AN主编的《神经病学》一书中，Wilson的义弟才将Wilson生前遗著Kayser-Fleischer ring作为本病临床特征之一补写进本病的临床表现项中。

三、Wilson后时代的研究

在Wilson 1912年发表论文Progressive lenticular degeneration a familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver的9年后，迨至1921年，Hall才明确指出，进行性肝豆状核变性与Westphal-Strümpell假性硬化症属同一疾病。此后，Barkman（1927）、Sjovall（1929）等将病理过程以脑与肝脏受损为主的这类疾病概括地分为2型：神经系症状较早暴露的，称作Westphal-Strümpell假性硬化症；肝脏表现为初发症状的，叫做Wilson病。此后，不少学者认为这两型并无本质上的不同而无须区别（Kubitz，1915；Gossler，1921；Rystedt，1923；Greenfield，1924；Japelli，1928；Pines，1928；Chasanow，1928；Graf，1931；Loexy，1931；Ricker，1932；Walsh，1936）。

Wilson回顾文献发现，1860年Frerichs发表的《肝脏病论文》资料中，有1例10岁男孩的临床和病理所见，与他观察的4例进行性肝豆状核变性患儿完全相同。而Anton（1908）报告的2例7岁和8岁舞蹈-无力起病的患儿出现痴呆伴肝硬化和糖尿病等症状，虽然也同时存在脑及肝脏病变，但由于20年后进展为“完全性痴呆”，故怀疑可能属Wilson病的罕见类型，但Wilson怀疑其病因与梅毒有关。此后，各家根据病程、临床表现和（或）病理改变对Wilson病进行各种不同的分型，陆续散见于文献，例如“急性型”与“慢性型”之分（Pollock，1922；Curschmann，1924）；“少年型”与“迟发型”之分（Lafora，1925）；“假性硬化型”与“肝豆状核变性型”之分（Krasnov，1927；Wimmer，1921）等。Wilson（1961）观察认为，肝型多发生于6～14岁的少年，而神经型（neurological type）主要侵犯12～30岁的患者。尽管不少肝豆状核变性（Wilson disease，WD）患者临床缺乏肝脏受损的表现，但在尸检或肝活检时仍常可证明肝硬化存在。Barnes（1924）及Brandt（1972）等将临床无神经症状而出现急剧进展的肝功能损害，于短期内死亡的WD，称作“腹型肝豆状核变性（abdominal Wilson）”。此型具有常发生于较年轻的患者（Odievre，1974），伴或不伴脾脏肿大（Lhermitte，1929），病程进展较神经病学型迅速（Denny-Brown，1964；Paraf，1968）等特点。腹型肝豆状核变性患者不论其临床表现如何，往往给人以WD似乎是由于肝脏疾病而继发神经症状的印象（Kastan，1922；Barnes，1925；Laruelle，1929）。此外，根据部分WD的临床表现，Hunt（1917）提出“震颤型”，Thomalla（1918）提出“扭转痉挛型”（torsion spasm type），Tabet（1969）发现“纯肾型”，Manghani（1969）发现“骨肌型”（osteomuscular type）等各种临床类型。Miyakawa根据尸检所见，提出“脱髓鞘型”（demyelinating type）的名称。但Bonnes等认为，无论肝豆状核变性型、假性硬化型及早期Gowers描述的“破伤风样舞蹈病”、Thomalla提出的“扭转痉挛型”都属同一疾病的不同临床表现而已。

临床表现特殊的WD个案报道还有1例伴有严重血清钙降低（Baltzan，1936）；1例进行性视力障碍，伴青光眼及失明（Goldbach，1938）；10例并发铅中毒（von Hagen，1924）；2例并发肝癌（Girard，1968；镰仓，1975）；1例伴发黑尿症（杨任民等，1985）等。这些个案，可能是WD与其他疾病偶合并存在。

各个调查者对最先所观察到的不同临床类型，提出WD的各种同义词，如假性硬化症（Westphal，1883）；Westphal假性硬化（Cathala，1927）；Westphal-Strümpell假性硬化（Baumlin，1901）；Wilson假性硬化（Dimitri，1928）；进行性肝豆状核变性（Wilson，1912）；进行性豆状核肌张力障碍（Frigerio，1922）；进行性豆状核变性并肝硬化（Barnes，1925）；肝豆状核变性（Hall，1921）；肝脑变性（hepatocerebral degeneration）（Bickal，1957）；肝脑营养不良（hepatocerebral dystrophy）（Konovalov，1948）；Westphal-Strümpell-Wilson病（Cimpeanu，1971）；Wilson-Konovalov病（Shefer，1971）；Torsion spasm（Thomalla，1918）；铜蓝蛋白血缺乏症（aceruloplasminemia）（Chen，1957）；遗传性扭转肌张力障碍（hereditary torsion dystonia）（Regensburg，1930）；肝-脾-豆状核病（morbus hepato-splenico lenticularis）（Frank，1923）；破伤风样舞蹈病（tetanoid chorea）（Gowers，1925）等。

1902年Kayser首先发现1例被诊断为“多发性硬化症”的患者具有特征性的角膜色素环。1903年与1912年Fleischer对Westphal假性硬化患者的角膜色素环进行了进一步的详细描述。Rumpel（1913）首先发现假性硬化患者的肝脏组织内含铜量过高，但当时未引起人们注意。直到1929年Vogt再次推测WD存在银、铜等金属代谢障碍，始引起医学界重视。此后，1930年Haurowitz报告，WD患者的肝脏及脑内铜含量异常增高。随后，Glazebrook（1945）、Cumings（1948）进一步确定本病属体内尤其是肝脏与脑内铜沉积异常增高的事实。Gerlach等（1934）和Policard等（1936）证明，Kayser-Fleischer角膜色素环是由于铜沉着所致。Mandelbrote等（1948）报道WD患者血清铜显著降低和尿铜排泄增高。Cumings（1951）率先发现对WD患者试用BAL后，出现尿铜增加。Scheinberg和Gitlin首先证明WD患者血清铜蓝蛋白（CP）显著减少。Bearn（1952）、Gitltin（1952）也几乎同时证明这一事实。Holmberg于1947—1951年首先从血浆中提取出CP，对其化学特性进行阐述，并予以命名。虽然Laurell（1948）曾报告1例WD患者的血清CP正常，而提出对血清CP的浓度降低是WD患者特征这一事实表示怀疑。但此后的多数研究，均确定血清CP减少是WD诊断的主要依据。

20世纪50年代末与60年代初，Konovalov等（1960）、Pepin（1959）已明确地证明，Westphal、Strümpell及Wilson等描写的不同神经病学综合征，只不过是铜代谢障碍引起铜离子在不同部位的中枢神经系统沉着而产生的不同临床表现而已，并统一命名为肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD）或Wilson disease（WD）。

肝脏损害是WD的重要病理改变，而又是长期被忽视的问题，随着Menghini开展了操作简单而又安全的肝穿刺针吸技术后，开始认识到对肝脏光镜和超微结构的直接观察，常常有助于对临床表现与实验室指标不典型的WD患者的诊断外，也有利于临床医师进一步对WD病期的了解。

1912—1982年间发表的WD文献约1000多篇。西欧及美国有关WD的其他主要报道者，按发表时期汇集如下。1920年以前是：Henrici，1913；Sawyer，1913；Auer，1914；Herring，1914；Farnell，1916；Hamilton，1916；Bielschowsky，1918；Thomalla，1918。自1920—1925年有：Schmincke，1920；Borsari，1921；Frigerio，1922；Lowy，1922；Raviart，1923；Rystedt，1923；Barnes，1924；Brückner，1925；Dimitz，1925；Oltmans，1925；Schob，1925。1926—1930年有：Cenzov，1926；Babonneix，1927；Cathala，1927；Kellner，1927；Merguet-Bassow，1927；Dimitri，1928；Pollock，1928；Beretta，1929；Lhermitte，1929；Haurowitz，1930；Rauh，1930；Sikl，1930。20世纪30年代有：Paulian，1931；von Lehoczky，1931；Ricker，1932；Yakolev，1932；van Gehuchten，1933；Schwyn，1937。20世纪40年代有：von Hagen，1940；Brinton，1947。20世纪50年代有：Drabowaka，1956；Bickel，1957；Boadin，1957；Enger，1959。20世纪60年代：Maytum，1961；Monnet，196l；Arima，1963；Gebert，1965；Williams，1965；Gipson，1966；Yoshitoshi，1966；Fernandez-Nogues，1967；Cooperberg，1968；Okhrimenko，1968；Sicilia，1968；Jochmus，1969；Singh，1969。20世纪70年代：Klink，1970；Aronson，1971；Gharib，1971；Mancosu，1972；Rosenberger，1973；Walker-Smith，1973；Bernier，1974；Matu san，1974；Roschlau，1974；Montfort，1978；Dobyns，1979；Poulche，1979。

WD的大样本临床资料报道主要有：Hall（1921）收集文献63例；Luthy（1931）累积病例及汇集文献共120例，其中79例经尸检证实；Konovalov（1948）分析了199例。此后尚有1952（Matthews，Spillane）；1954（Tyler，Wintrobe）；1955（Schreier）；1956（Bearn，Matthews）；1957（Bearn，Prickel，Walshe），1959（Boudin，Scheinberg，Walshe）；1960（Anonymous，Bearn）；1961（German，Seven，Walshe，Warnock）；1962（Giagheddu）；1963（Matthews，Mukai）；1965（Scheinberg）；1966（Bearn，Sternlieb，Walshe）；1968（Cooperberg，Goldstein，Martin）；1969（Biesold，Kunath，Modigliani，O’Reilly，Walshe）；1970（Agnoli，Klawans）；1971（Armbrust-Figueiredo，Curcio，D’iachkova，Slovis，Trelles，Wilkins）；1972（Bearn，Walshe）；1973（Vulovic，Wilvonseder）；1974（Cartwright，Drozdz，Sternlieb）；1975（Sass-Kortsak，Seheinberg，Strickland）；1976（Sternlieb）；1978（Sass-Kortsak，Williams）；1979—1980（Sternlieb）。

其他国家、地区的报道主要有：阿根廷（Poch，1966；Leite，1986）；澳大利亚（Danks，1969）；奥地利（Zappert，1914；v Economo，1918；Pollak，1922；Tschabitscher，1962）；比利时（Bozo’ti，1970）；保加利亚（Mavlov，1971）；新加坡（Vella，1959）；捷克斯洛伐克（Kubik，1922；Pelnor，1925；Prochazka，1965；Kuncova，1971；Marecek，1975）；丹麦（Wimmer，1922；Hansen，1969；Jensen，1972；Brink，1974）；东德（Bachmann，1976）；爱沙尼亚（Willemi，1924）；芬兰（Karma，1973）；希腊（Walshe，1969）；夏威夷（Halford，1933）；匈牙利（Kornyey，1929；Brand，1951；Gallyas，1968）；冰岛（Gudmundsson，1969）；印度（Dastur，1967；Manghani，1968；Bharucha，1970；Jain，1972；Joshua，1973）；以色列（Mera，1969；Passwell，1970；Bekin，1976）；意大利（de Lisi，1914，1929；Rossi，1925；Rasore-Quartino，1967；Ceccarelli，1969；Berio，1970；Campanella，1971）；日本（Uchimura，1930；Yono，1953；Okinaka，1954；Arima，1962，1968；Onmura，1963；Fukuda，1965；Terao，1966；Oyake，1969；Ohta，1969）；前南斯拉夫（Matus an，1974）；马来西亚（Vella，1957）；墨西哥（Gonzalez-Angnlo，1965）；荷兰（Bouman，1922；Bolton，1924；Meyjes，1930；Manschot，1956）；尼日利亚（Osumtokun，1971）；北爱尔兰（Waunock，1952）；挪威（Enger，1959；Lygren，1959）；波兰（v Dziembrowski，1971；Melanowski，1929；Opalski，1930；Wald，1959；Tarnowska-Dziduszko，1970；Czlonkowska，1972；Malolepszy，1973）；罗马尼亚（Grecu，1970）；撒丁（Giagheddu，1962）；苏格兰（Glazebrook，1954；Walsne，1969；Mac Sween，1974；Lee，1974）；塞内加尔（Dumas，1970）；南非（vander Merwe，1978）；西班牙（Rodriguez-Arias，1929；Gilsanz，1960；Guardia，1973）；瑞典（Sjovall，1921；Soderbergh，1922；Hood，1951）；瑞士（Mahaim，1925；Lürth，1931；Stillhart，1961；Klein，1964；Tschumi，1973）；突尼斯（Hamza，1974）；土耳其（Gharib，1971；Ozsoytu，1971；Aksoy，1972，1975回顾61例）；乌克兰（Lescht-Schenko，1925）；前苏联（Tschugunoff，1923；Cenzov，1926；Seletsky，1926；Fillimonoff，1928；Konovalov，1948；Patrunova，1964；Bogolepov，1970；Skudarnova，1973；Vakharlovski，1974）；越南（Huong，1970）。

四、国内对肝豆状核变性的研究

（一）早期的文献报道

程玉麟（1932）首先报道中国人WD的临床表现；林文秉（1932）对Kayser-Fleischer角膜色素环进行了描述。此后25年国内医学期刊未见文献报道，直至1957年后才开始有较多报道，至1986年止，国内文献发表近100篇，约1200余例。1957年：冯应琨、张沅昌、陈培恩、马国钧。1958年：吴冠华、徐谦、张端、秦芝九。1962年：Tu（中国台湾地区）。1965年：张湖、吕再生。20世纪70年代：杨任民、高之旭、于庆波、Leu（中国台湾地区）、Strickland（中国台湾地区）等。1986年后有较多临床研究及病理报道。

（二）国内关于中国人WD的分子生物学研究

1.中国人WD的分子遗传学研究

国内有关中国人WD的分子遗传学研究最早始于20世纪80年代末至20世纪90年代初期。1990年，李雪林等首次构建了WD患者的EMBL3 DNA基因组文库。1992年，方炳良等首次报道应用13ql4～q22区域的D13S26位点对WD家系进行连锁分析，证实D13S26/HphI可用于WD的症状前诊断。1994年，徐评议等应用RB1基因3’端第17号内含子中p68RS2.0等位片段对WD家系进行RFLP连锁分析，证实p68RS2.0标记可用于WD的症状前诊断及杂合子筛选。其后，国内乐俊河（1995）、王柠（1995）、吴志英（1996）、许国英（1996）、邹宇（1996）和王丽娟（1998）等先后应用微卫星DNA（short tandem repeat，STR）等标记对WD家系进行连锁分析，用于诊断WD及检出症状前患者和杂合子。

随着WD基因的克隆，Thomas等（1995）首先报道在3例中国香港WD患者检出ATP7B基因第8号外显子的Arg778Leu错义突变。其后，中国台湾地区学者Chuang等（1996）也发现了中国台湾地区的WD患者有相同的突变。1997年，杨任民等在国内首先报道了WD患者ATP7B基因突变的检测结果。1998年，马少春、梁秀龄等发现中国人WD患者ATP7B基因第8号外显子Arg778Leu的突变率为28.8%，并认为该突变位点是中国人WD患者的高频突变点。同年，许月芳等检测到Arg778Leu的突变率为30%。

为进一步明确中国人WD基因的突变特征，吴志英等（2001）对ATP7B基因的21个外显子进行了突变检测，认为第8号外显子和第12号外显子是中国人ATP7B基因的突变热区。此外，Gu等（2003）对汉族和回族WD患者的研究结果发现57.5%的突变位于第8、12、13外显子上，其中55%的患者可检出Arg778Leu突变，而13外显子突变率达到了17.5%。Li等（2011）在62例中国人WD患者中发现了14种新的突变，并认为中国人WD患者第8、12、13和16号外显子应予以优先检测。

近年来，有学者采用一些新出现的高特异性和灵敏度的基因突变筛查方法结合DNA测序进行了较大样本的中国人WD基因突变的研究。杨静芳等（2006）采用DHPLC在74例中国人WD患者中发现22种突变和11种多态。Mak等（2008）采用相同方法在65例中国香港WD患者检出42种突变。此外，Mak等（2008）还建立了基于等位基因特异性扩增法（allele-specific amplification，ASA）的荧光PCR检测WD基因突变的基因诊断技术，该方法可在3小时内一次性检出WD患者的28种突变。此外，中国台湾地区学者Lin等（2010）利用高分辨率熔解曲线法（high resolution melting，HRM）在中国台湾地区WD患者中的突变检出率达96.43%。国内Wei等（2011）采用二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）检测了WD患者的基因突变。

综上所述，自从WD基因克隆以来，中国人WD的分子遗传学研究进展迅速。目前认为，我国WD患者的基因突变以少数几个热点突变和广泛存在的罕见突变为特征，且其突变热点与欧美人群存在较大的差异，而WD的基因诊断已逐渐在临床诊疗中推广应用。

2.中国人WD相关蛋白的研究

1988年，李采娟等通过对WD成纤维细胞模型的研究发现，WD患者过量蓄积的铜主要与小分子蛋白结合。1995—1996年，陈嵘等发现高浓度铜孵育后的WD患者成纤维细胞的胞质内铜含量、金属硫蛋白（MT）及其铜结合量均明显增高，而锌孵育后的WD患者成纤维细胞的胞质内铜含量增高，同时MT上的铜结合量也增高，但MT含量无明显变化。

2000—2001年，侯国庆、梁秀龄等从人肝细胞内分离出WD蛋白特异性条带，其主要存在于肝细胞质膜、内质网和高尔基复合体等亚细胞结构，且P型ATP酶的阻滞剂及激动剂对肝细胞铜转运有显著影响，对WD肝细胞模型的研究证实，WD患者肝细胞内ATP7B蛋白的表达水平减低。

2002—2003年，丰岩清和王莹等分别通过谷胱甘肽（GST）融合蛋白表达系统成功制备了WD蛋白以及WD蛋白N端的多克隆抗体。在此基础上，黄帆（2003）、丰岩清（2005）等建立了WD基因突变酵母分析系统，发现在该系统表达的野生型ATP7B可以弥补酵母内CCC2蛋白的铜转运功能，而Arg778Leu突变的ATP7B突变体只能部分代偿CCC2蛋白的铜转运功能，证明了Arg778Leu是一种影响ATP7B功能的致病性突变。

此外，任廷文等（2003）构建了ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体，研究其在TX小鼠肝细胞中的表达及功能，认为ATP7B基因6个铜离子结合区的功能不同，其中1～4结合区主要根据铜浓度诱导ATP7B蛋白细胞内定向移动，而5～6结合区则直接参与铜离子细胞外转运。吴志英等（2003）则构建了含健康人全长WD cDNA片段的真核细胞表达质粒ATP7B cDNA/pcDNA3，定点诱变了Arg778Leu/pcDNA3、Gln914Ter/pcDNA3和Thr935Met/pcDNA3等3种突变体表达质粒，质粒瞬时转染实验的研究结果显示错义突变未改变ATP7B蛋白表达量，提示错义突变引起铜代谢障碍的机制与蛋白表达量无关。2013年，吴志英等将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的ATP7B突变体转染进CHO和SH-SY5Y细胞系，观察了不同的突变体在细胞内的定位改变。

五、安徽中医药大学神经病学研究所团队关于中国人肝豆状核变性的分子生物学研究

（一）中国人WD的分子遗传学研究

自20世纪80年代以来，安徽中医药大学神经病学研究所开始对WD进行了较为系统的遗传学研究。1984年，杨任民等对167个WD家系总共615人进行的家系调查结果显示，本病的大部分家系成员符合常染色体隐性遗传的遗传特征，但也观察到有的家系存在累代遗传现象。

随着WD基因的克隆，作者团队在国内较早地进行了中国人WD患者的分子遗传学研究。1997年，杨任民等在国内首先采用PCR-SSCP检测了141例WD患者的ATP7B基因第7、9、14外显子的基因突变，结果在第7号外显子检出过去文献尚未见报道的Ser662Cys错义突变。1998年，与许月芳同时，杨任民等应用PCR直接测序法对30例WD患者ATP7B基因第8外显子进行了突变筛查，Arg778Leu的突变率为30%，是中国人WD患者的基因突变热点。在1997～2005年间，作者还先后对中国人WD患者的ATP7B基因第7、8、9、12、14、18号外显子的突变进行了研究，在第14号外显子发现了一种未见报道的1046insA移码突变，在第12号外显子发现Thr935Met有较高的突变率，并证实了第14号外显子非中国人的突变热点。

在此基础上，作者于2009—2010年检测了来自华中和华东地区WD患者第13号外显子的基因突变，结果共检出6种突变和1种多态，其总检出率为29.49%，Pro992Leu纯合/杂合突变的检出率为23.02%。该研究证实，第13号外显子是中国人WD患者的一个突变热区，Pro992Leu突变是其另一个高频突变位点。基于此，作者采用限制性酶谱分析技术检测了WD患者ATP7B基因第8、12、13外显子的突变，其总检出率为69.01%，建立了可用于临床疑诊WD患者的基因诊断快速筛选方法。此外，作者还对晚发性WD患者（发病年龄>40岁）和血清CP水平正常的WD患者（血清CP>200mg/L）的基因突变进行了检测，为这两类特殊类型的WD患者的基因诊断奠定基础。2013年，作者对双（多）胞胎WD家系的基因突变研究中，发现1个双胞胎家系的患者发生了杂合丢失现象（loss of heterozygosity，LOH）。

2008—2013年，作者应用PCR-MassARRAY高通量基因突变筛查方法对大样本的WD患者及其家系成员进行了ATP7B基因的突变检测，结果在1216例患者中检出62种突变，其中Arg778Leu和Pro992Leu的等位基因突变频率分别为31.80%和17.54%，第8、12、13、16和18外显子的等位基因突变频率为60.51%。此外，作者还对这些基因突变的类型及其分布规律进行了研究，获得了大样本的中国人WD患者的基因突变谱。

（二）中国人WD相关蛋白的研究

1997—2005年，安徽中医药大学神经病学研究所团队通过WD患者皮肤成纤维细胞及肝细胞培养建立了WD的细胞模型，发现WD细胞模型内金属巯蛋白（MT）的代谢异常，采用Western blot研究发现WD细胞模型内ATP7B蛋白表达的质和量均明显异常。2009年，安徽中医药大学神经病学研究所团队在WD的铜负荷大鼠模型研究中发现其海马CA1区存在Aβ1～42蛋白和Tau蛋白的异常表达，而Aβ1～42的异常沉积和Tau蛋白的过度磷酸化是导致中枢神经系统变性疾病的重要发病机制。2010年，该团队检测了WD患者血清中原铜蓝蛋白（Apo-CP）和全铜蓝蛋白（holo-CP）的表达水平，发现WD患者存在Apo-CP向holo-CP的转化障碍。2013年，该团队以WD模型TX小鼠为研究对象，发现其肝、脑细胞中ATP7B蛋白及MT、铜转运体1（CTR1）、抗氧化蛋白1（ATOX1）、超氧化剂物歧化酶铜伴侣蛋白（CCS）等铜伴侣蛋白的表达水平异常，中药肝豆汤通过调节这些铜代谢相关蛋白的表达水平达到减轻肝、脑细胞的铜负荷、维护肝、脑细胞内铜稳态平衡的疗效。2014年，该团队还通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）双荧光标记观察TX小鼠离体培养的肝细胞中ATP7B蛋白的亚细胞定位表达，结果发现突变的ATP7B蛋白不能正常定位于TGN，而以肝豆汤含药血清孵育的TX小鼠肝细胞能在一定程度上纠正ATP7B蛋白异常的亚细胞定位表达。

六、安徽中医药大学神经病学研究所团队对肝豆状核变性临床研究的概况

于1974—2013年间，安徽中医药大学神经病学研究所在杨任民教授带领的WD医疗科研团队发表有关WD的医学论文共257篇。WD基础研究：分子生物学23篇，铜代谢21篇，铁钙等元素代谢6篇，肝肾心脏及免疫机制等研究17篇，情绪认知及电生理20篇，WD临床及诊断93篇，治疗77篇。在国内首次报道WD骨-肌型，首次进行了WD家系调查研究，首次在国内报道硫酸锌治疗WD 60例的临床研究，首次以葡萄糖酸锌代替硫酸锌治疗WD，首次在国内、外开创并确立二巯基丙磺酸钠（DMPS）良好的临床疗效和较少的副作用，并进行近万例WD的治疗，首次开创性使用二巯基丁二酸胶囊治疗WD，在国内、外拓宽了WD的治疗用药。

总结上述该团队公开发表的WD科研论文，从WD的基础、诊断、治疗等各方面从事了大量的临床和基础研究，使我国WD的治疗水平居于国际领先地位。

自1974年开始探讨采用中西医结合治疗WD，通过近40年的不断探索取得了一系列重大的、创造性的成果，杨任民教授首创的治疗和诊断方法均已通过医学论文形式公开发表在全国各个级别的医学期刊上，其中部分内容还被收入2008年中国《肝豆状核变性的诊断与治疗指南》。现根据所公开发表的论文对安徽中医药大学神经病学研究所所做的结果总结如下。

1.在国内首先对167例WD患者进行了家系调查，进一步证明该病属常染色体隐性遗传性疾病，但还存在累代遗传或散发病例。

2.Hall将本病分为腹型、肝豆状核变性型及假性硬化型，国内外都沿袭此分类法。但WD的临床表现复杂多样，除上述3型外，尚有以舞蹈手足徐动、精神障碍、肾病、慢性肝病、脾功能亢进、内分泌紊乱等症状起病，因而常易被误诊。杨任民教授根据484例WD病例资料（1983）对该病进行了更为详细的分型，共分为9型。新的分型更为切合实际，明显提高WD的鉴别诊断和早期确诊率，并先后发现了我国首例骨-肌型WD及脊髓型WD，与近年美国Brewer的分类相似。

3.WD病情的严重程度及疗效的判断 国内、外均依据Goldstein分级标准，但该标准只有对脑症状严重程度的判断，而缺乏对肝脏损害程度的判断。杨任民教授提出了改良分级标准，为临床医师对该病脑型、肝型及脑内脏型的严重程度、疗效及预后提供了更为全面的客观判断依据。

4.发掘祖国医学宝库，改变了“平肝熄风”对本病的传统治疗方法，创用清热解毒、通腑利尿之法，重用大黄、黄连、泽泻等组成肝豆汤，不仅临床症状明显改善，且有较显著的尿排铜和胆汁排铜作用，现该方剂中的诸药已证明均属高锌、低铜之品，并已制成片剂广泛应用于临床，为WD提供了一条有效、低毒、使用方便、依从性高的治疗途径。

5.创用我国自主开发的二巯基丁二酸钠、二巯基丁二酸胶囊治疗WD，拓宽了该病的治疗方法。这两种药排铜作用显著，副作用明显少于青霉胺和二巯丙醇，尤其不存在青霉胺长期服用的免疫性疾病等严重不良反应，并已证实除具良好的尿排铜外尚有显著促进胆道排铜的功能。

6.国外早年已发现DMPS确有排铜作用，但临床疗效不明显，而久已弃之不用。安徽中医药大学神经病学研究所附属医院（下文简称为我院）分析研究过去使用DMPS是由于用量过小及用药途径为肌内注射等因素造成排铜效果差，因此，在药理学研究的基础上，提出更适合的剂量进行静滴以及大剂量静脉冲击疗法，通过DMPS与青霉胺临床对照研究，结果显示DMPS排铜效果及临床缓解作用远较青霉胺强。

7.杨任民教授于1986年在国内首先在《中华医学杂志》报道了硫酸锌（ZnSO4）对60例WD患者尿及血微量元素的影响，肯定了硫酸锌的疗效。此后，又发现硫酸锌对胃黏膜刺激大，胃肠道反应较严重，因此，率先提倡用葡萄糖酸锌替代硫酸锌治疗本病，实验与临床研究证明葡萄糖酸锌不仅疗效与硫酸锌相仿，而且极少有胃肠道的不良反应，目前已为国内WD患者普遍应用。

8.WD患者往往在青少年期即有肝脏硬化、脾脏大，且不少患者以脾功能亢进（脾亢）为主征，造成白细胞、血小板显著减少，而不能接受青霉胺和二巯基丁二酸胶囊等药物的治疗。脾脏切除虽为治疗脾亢的主要方法，但大多数患者往往由于手术引起病情迅速恶化，故国内外均将脾脏切除术列为WD的禁忌证。为解决这一难题，杨任民对切脾的WD患者分析后认为病情恶化是由于手术创伤加速了肝脏内蓄积铜的转移所致，提出在术前术后强力驱铜的观点，从而解决了绝大多数患者成功手术后病情不再加重的难题。

9.我院的分子生物学研究室建立了国际上最多的WD DNA基因库（2000余例），已观察到中国人多个ATP7B基因突变的新位点。现在研究该病的基因诊断技术已成雏形，对将来WD的早期诊断和治疗具有重要意义。

10.1995年杨任民教授带领团队总结了我院多年的临床经验和研究成果，并结合国内外有关文献，编著了我国首部WD专著《肝豆状核变性》，填补了国内空白。该书集WD临床表现、检查、诊断、治疗之大成，已成为神经内科、精神科、内科、儿科及基层医院等临床工作者治疗WD的重要参考书。

随着我院影响力的不断扩大，该院WD患者住院人数呈逐年递增趋向，2013年最高日WD患者住院人数达到500余例。他们视WD患者如亲人，所以随着他们40余年来对WD的认识日益更深、更广，从发病机制、临床表现、诊断和治疗手段等的更新，使我院团队WD诊治水平也不断提高。该院近几年WD科研论文较前有明显上升趋势，会有越来越多的作者的科研成果和临床心得将在国内外医学期刊上公开发表，与国内外研究WD的同道共享，为更好地促进国内和国际的WD研究共同努力。

（杨任民　周志华　程楠）