龙血树的繁殖方式一般为种子繁殖、压条繁殖和扦插繁殖，但繁殖率低，且龙血树的生长周期较长、结实率低，常规的播种繁殖和扦插繁殖远远不能满足市场的需求。组织培养和快速繁殖体系不仅能使组培苗保持其母本的特性，还能大大缩短培养周期、提高繁殖速度，为龙血树的规模化繁殖和利用打下了坚实的基础。

华南热带农业大学农学院细胞与组培实验室在莫饶教授的带领下开始了对龙血树试管苗培育的研究，并于2004年12月试验成功。目前已掌握了对龙血树的试管苗到大田培育的全部技术，解决了大面积繁殖龙血树的难题。使用快繁技术培育出的龙血树苗在试验田里生长良好、枝叶繁茂、体态优美，移植在花盆里的龙血树具有较好的观赏性。

植物材料的采集要根据培养目的来选取，如体外快速无性繁殖或微繁殖多采用顶芽、腋芽、带芽茎段、原球茎或茎尖（分生组织）作起始培养材料；生产单倍体植株多采用花粉（药）或未受精的胚珠培养；生产植物的次生代谢产物常用活体中该天然物质含量最丰富的部位作起始培养材料等。取材时的一般选择原则是易于诱导、带菌少。选取龙血树组织内部无菌的材料要注意这两个方面：一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料；另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，绝不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。

第一步，将采来的龙血树材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，小心剥去叶片；再把材料切割成适当大小，以能放入灭菌容器为宜；然后用洗涤剂（洗衣粉、吐温）浸泡10分钟，置自来水龙头下流水冲洗15分钟，晾干水分。在采集前对外植体进行水分控制和淋杀菌剂的预处理可降低材料的污染率，提高诱导的成功率。

第二步，对材料的表面灭菌。在无菌条件下，将龙血树用70%乙醇消毒10秒后，再用0.1%升汞溶液浸泡10分钟或者用0.1%升汞溶液先浸泡5分钟，无菌水涮洗2～3次，再用0.1%升汞溶液浸泡5分钟。

第三步是用无菌水涮洗5～6次，每次涮洗3分钟左右。无菌水涮洗的作用是免除消毒剂对植物细胞杀伤的副作用。

近年来，随着科学技术的发展与进步，罗冠勇等发现了一种基于愈伤组织诱导途径的组培快繁技术体系优化，具体途径如下：①将采集的侧芽和顶芽小心剥去叶片，去掉多余部分，用20%的消杀威消毒1分钟，无菌水清洗4遍，然后用1.5g/L升汞消毒12分钟，用无菌水清洗4遍，最后用1.5g/L升汞消毒2分钟，用无菌水清洗4遍后，切成2cm左右的茎段接种于培养基中，30天后观察外植体诱导情况（表3-1）；②将愈伤组织分化得到的小芽或丛芽去除变褐部分并切去顶部，接种于培养基中，45天后观察芽的继代增殖情况（表3-2）；③生根不经过壮苗阶段，直接把增殖芽切成单株苗，分成大芽（3cm以上）和小芽（3cm以下）用于生根，接种于培养基中，每种培养基接种50袋，45天后统计生根情况（表3-3）。

在侧芽和顶芽诱导愈伤时，切块过大或过小都不利于诱导，以2～3cm最好；芽继代增殖中，改良MS培养基苗的长势比MS培养基好；2～3个芽/丛的接种方法其增殖系数高，而单芽的增殖系数很低，有的甚至只长苗不增殖，据此可得出在继代增殖接种时，丛芽的增殖和生长明显比单芽的有利。

组织培养能否取得成功，主要取决于对培养基的选择。不同的培养基具有不同的特点，适合于不同的植物种类和接种材料。在进行龙血树组织培养时，首先要对各种培养基进行了解和分析，从中选择合适的培养基配方。常用的基础培养基有MS培养基、B5培养基、N6培养基、White培养基等。

MS培养基是目前使用最普遍的培养基，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时有显著成效。MS培养基中无机养分的数量和比例比较合适，一般情况下不用再添加氨基酸、酵母提取物、酪蛋白水解物及椰子汁等有机附加成分。

White培养基中的无机盐浓度较低，适于生根培养。B5培养基的主要特点是铵盐的含量较低，硝酸盐和盐酸硫胺素的含量较高，适宜双子叶植物特别是木本植物的培养。杨晓虹等的实验表明，作为木本植物的龙血树适宜在低铵盐、较高硝酸盐和盐酸硫铵素的B5培养基上生长，不太适宜在高无机盐的MS培养基上生长。N6培养基中KNO ₃和（NH ₄） ₂ SO ₄的含量高，不含钼，广泛应用于禾谷类植物的花粉和花药培养。KM-8P培养基是为原生质体培养而设计的，其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。

目前，龙血树主要用茎段、茎尖作为外植体来进行组织培养。海南龙血树幼嫩茎段的诱导和不定芽增殖的最适培养基为MS+6-BA 6.0mg/L+NAA 0.5mg/L，增殖系数达10以上。剑叶龙血树茎段、茎尖在 MS+3.0mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA的培养基中比较容易直接产生不定芽。

龙血树外植体诱导产生不定芽的过程中，6-BA的浓度对不定芽的分化、增殖、伸长和生长影响比较明显，对芽的增殖影响尤为明显。当6-BA的用量在0～3mg/L范围内时，增殖倍数表现为随浓度升高而升高，芽长度则表现为随浓度升高而降低。6-BA的用量高于3mg/L后，不定芽的生长开始缓慢，玻璃化现象逐渐加重。何旭君等以海南龙血树优株顶芽和茎段为外植体，通过不同的细胞分裂素、生长素以及培养基不同浓度的组合，对诱导芽的分化、增殖、伸长及生根的对比实验及试管苗移栽管理，筛选出MS+蔗糖30g/L+2.0mg/L 6-BA+0.01mg/L的NAA培养基用于芽的增殖，MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L 6-BA的培养基用于壮芽生长。龙血树的生根培养基一般为MS+0.3mg/L NAA。

同时，培养基的pH对外植体的存活相当关键，一般龙血树外植体在pH 5.4～5.8的条件下生长良好。当培养基的pH>6.2时，外植体不生长甚至死亡；当培养基的pH<4.8时，琼脂水解导致培养基不凝固，外植体慢慢变白或褐化直至死亡。

配制植物组织培养固体培养基，琼脂粉的用量一般为6～7g/L；若用琼脂条则要事先浸泡至琼脂条变白，用量一般为6.5～7.5g/L。

龙血树组织培养（图3-2）的成功与否和培养条件密切相关。培养条件主要是培养温度、光照强度、光照时间、透气性、植物生长调节物质、消毒时间等。

龙血树的外植体培养条件一般为培养温度为25～28℃，光照强度为1500 lx，光照周期为每天12小时。龙血树的组织培养过程中要注意透气性问题，最好使用透气性较好的封口材料。剑叶龙血树的茎段诱导形成不定芽的时间较长，一般要经过30～40天培养才产生不定芽。

以MS为基础培养基、6-BA和NAA 2种植物生长调节物为例，不同浓度的6-BA和NAA对剑叶龙血树组织培养中芽的分化和愈伤组织的产生有不同的影响。尤其是6-BA，对芽的分化影响很明显，表现为随着浓度的升高，芽的诱导率也逐渐升高。6-BA的浓度过低，外植体会逐渐变白或者褐化，并最终死亡；浓度过高外植体会逐渐玻璃化。NAA主要对愈伤组织的产生有影响，随着浓度的升高愈伤组织出现得也越多。NAA浓度低时不出现愈伤组织，浓度过高抑制芽的分化。

黄莉雅等的实验表明，延长0.1%HgCl ₂消毒处理的时间可以有效降低剑叶龙血树组织培养的污染率，特别是处理8分钟和处理9分钟的差异最明显，污染率下降14%。但是当0.1%HgCl ₂处理时间超过9分钟后，死亡率升高，处理10分钟比处理9分钟的死亡率升高19%。由此可见，要严格控制0.1%HgCl ₂消毒处理的时间，保证存活率。所以在剑叶龙血树的组织培养中，0.1%HgCl ₂消毒处理的时间为9分钟效果较好，存活率达到42%。

此外，吸附剂、消毒剂、组织培养的部位等都会影响组织培养的成功与否。

移栽前，先在50%的荫蔽度的大棚里炼苗2周；移栽时，将附着在根系上的培养基清洗干净，用0.3%多菌灵浸泡小苗20分钟后栽植于以椰糠∶河沙（1∶3）为基质的培养杯中，置于50%的荫蔽度的大棚内。浇足定根水后的2周内不需要再浇水。1个月后按常规育苗方法管理，成活率达85%以上。

在龙血树的组织培养过程中常见的主要问题是褐化、污染、玻璃化，其中以褐化最为常见。

　褐化是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至于培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化在龙血树的组织培养中经常会发生，严重的褐化导致外植体坏死。

褐化可分为酶促褐化和非酶促褐化。非酶促褐化是指由于细胞受胁迫条件或其他不利条件影响所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而导致的褐化，其中未涉及酚类物质的产生；酶促褐化是指因为酚类物质的参与而引起的褐化现象。目前认为植物组织培养中的褐化主要是酶促褐化。

引起组织培养过程中外植体褐变的因素包括两个方面：一是外植体自身的原因，包括植物种类及基因型、外植体部位、生理状态、取材时期、外植体的大小及受伤程度、遗传特性等；二是外植体所处的培养环境，包括培养基的成分、培养条件及培养方式等。

在龙血树组织培养的过程中，外植体会分泌类似于褐化的分泌物，使得培养基变红，该分泌物经杨本鹏、张树珍等人认为类似于血竭。这个现象为从分子水平进一步阐述血竭形成的机制提供了研究手段。

在切取外植体时，应尽可能减少伤口面积，伤口剪切尽可能平整。切取外植体时还应考虑其粗细程度，细的可切短些，粗的可切长些。

预处理包括流水冲洗、低温消毒、预培养等。对龙血树这种易褐变的材料采用经流水冲洗后放在2～5℃的低温下处理12～24小时，经消毒处理后接种到只含有蔗糖和琼脂的培养基上培养5～7天做预处理。预培养一方面使培养基中的酚类物质部分渗入培养基，另一方面使外植体伤口愈合，这样可使外植体的褐化程度减轻；也可以热击处理，采用45℃以上的短时间高温处理能够使多酚氧化酶失去活性，从而达到抗褐变的目的。

组培中外植体的褐化是植物在一种逆境下的适应性反应，故在最适宜的培养条件下，外植体处于旺盛的生长状态，有较强的分生能力，便可大大减轻褐化。试验证明适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化。

利用抗氧化剂、多酚氧化酶（PPO）抑制剂、吸附剂。目前常用的抗氧化剂和PPO抑制剂有有机酸、维生素C、半胱氨酸、枸橼酸、苹果酸和α-酮戊二酸、水解乳蛋白、植酸（PA）、SO ₂和亚硫酸盐、脂肪氧化酶、维生素C氧化酶、硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等。吸附剂有活性炭（AC）和PVP（聚乙烯吡咯烷酮），能吸附培养基中的有害物质。但是，活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附褐变物质的同时，也会吸附培养基中的生长调节物质，而使其失去作用；PVP是酚类物质的专一性吸附剂，不会吸附培养基中的生长调节物质，抗褐能力明显优于活性炭。抗氧化剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，减少褐变。抗氧化剂要注意分次使用，应注意有些抗氧化剂会对培养物产生毒害作用，要避免长期在含这些抗氧化剂的培养基中培养。如果先期褐变得到了控制，就应该从培养基中除去抗氧化剂。

将外植体很快转移到新鲜培养基上2～3次，在某些情况下可以缓解褐化，可能是在这段时间内外植体的切口逐渐愈合、外渗停止的原因。

使用的消毒剂的种类不当、灭菌时间过长和消毒剂残留会在一定程度上导致细胞死亡，进而导致褐化。龙血树外植体比较容易褐化，消毒可用1g/L HgCl ₂溶液浸4分钟，无菌水冲洗2次；再用1g/L HgCl ₂溶液浸3分钟，无菌水冲洗5次。

龙血树的组织培养过程中污染来源分为三大类：第一类为材料带菌；第二类为接种污染；第三类为培养过程感染。

　材料带菌是指原始材料本身带菌，或者继代培养的材料本身带有病菌。常用的预防措施有：

（1）选择合理的外植体种类、取材的季节和时间，初代接种选取大小适宜的外植体

外植体的种类：在龙血树的组织培养中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。一般来说，龙血树的根尖、茎尖、腋芽这些部位和龙血树的成熟种子比较适宜用于组织培养。

外植体的大小：大的材料有较大的表面积，带菌相对较多；小的材料相应地带菌较少，因而污染率较少。

（2）采取适宜的预处理方法、改善灭菌方法或加入抑菌剂，减少材料菌类感染

预处理方法有对母株的预处理、改善植株栽培环境、对母株喷布杀菌剂或抗生素。对母株或外植体的预处理有促发新枝、黄化处理、热击处理、用抗生素进行预培养。

改善灭菌方法。采用真空减压灭菌；灭菌室用磁力搅拌、超声波振动增加消毒剂与外植体的接触；采用多次消毒；使用混合消毒液；灼烧。

在培养基中加入其他抑菌剂。带有内生菌的植物，由于细菌潜伏较深，表面消毒方法无法将其消除，初次培养无污染现象出现，但随着继代次数的增加，菌量逐渐累积，污染现象也会随之而出现。通过连续添加青霉素、利福平、氯霉素能有效减少内生菌污染。

（3）其他操作注意

切分潜在的带菌材料时，要保证所用的接种工具经过彻底的消毒再去切割其他的健康材料。继代培养时，每次继代之前都要对继代的材料进行仔细的检查，污染的材料应给予丢弃。

　接种污染指接种过程将病菌带入培养材料，可能的原因有无菌室消毒不彻底或超净工作台滤出的空气中带菌超标；交叉污染；操作人员呼吸或身体、衣物上带有杂菌。接种污染的主要防范措施有：

（1）紫外线灯接种室消毒，清洗超净工作台。

（2）接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触。

（3）接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75%的乙醇喷洒双手，接种时避免说话，接种的材料、工具不能超出工作台面，接种人员身体应尽量远离台面，接种时应穿上无菌的白大衣、戴上帽子和口罩。

（4）避免高温高湿天气接种，平时注意无菌室的除湿和熏蒸消毒，必要时用浓度为70%的乙醇溶液喷雾消毒。

　培养过程中环境中的病菌多、湿度大、温度高也会引起培养材料或培养基的污染。可采用以下方法减少培养过程中的污染：

（1）经常进行清洁卫生，对培养室定期进行消毒处理。

（2）及时清除污染材料、转移继代材料。

（3）污染的材料及瓶子要用药液消毒并处理干净，必要时须经过高温高压灭菌后方可使用。

　内源激素失调，能量代谢受阻，蛋白质的正常合成受抑，使分化难以顺利启动，细胞发育异常而致。

　导致玻璃化现象的可能因素有以下几个方面：外植体材料、琼脂、糖、NH ₄ ⁺、封口材料、温度、光照、培养基的pH及培养基中激素的种类、浓度等。

（1）选择适宜的外植体：一般而言，龙血树顶芽的玻璃化概率较低，茎段中部较容易出现玻璃化。分析这种差异性主要是由顶芽到茎基在内源激素含量和比例上的差异而致。

（2）调节培养基的硬度：调节培养基的pH，提高琼脂浓度，玻璃化的比例明显下降。

（3）调节培养基的成分：提高培养基的碳氮比，降低NH ₄ ⁺浓度或及时转移培养基，在其中加入适量的活性炭、青霉素、聚乙烯醇（PVA）、Ca ²⁺、赤霉素（GA）及多效唑（PP333）等添加物。

（4）选择合适的培养环境：适当提高光照强度，保持适宜温度在25℃左右（19.5～30℃）利于控制玻璃化；降低湿度（瓶内的空气湿度和培养基的含水量），改善氧气供应状况利于减少玻璃化苗的出现。

（5）适当降低细胞分裂素的浓度和细胞分裂素与生长素的比例：许多报道指出，培养基中的外源细胞分裂素供应过多容易导致组培苗玻璃化。如在沾化冬枣的快繁中，培养基中的6-BA浓度在3～5mg/L时，能显著促进外植体发生褐化；在重瓣丝石竹的组培中发现，培养基中高浓度的细胞分裂素，尤其在6-BA为5.0mg/L时，是影响玻璃苗发生的主要原因。

　以高于40℃的温度对外植体进行热击处理可消除玻璃化。