南药研究系列丛书:龙血竭
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第三节 理化鉴别

取剑叶龙血树粉末5g,加石油醚20ml,振摇10分钟,滤过,取滤液置水浴中蒸干加香草醛液10滴,振荡,显紫红色。若用该品5g,加乙醚20m l,密塞振摇10分钟,滤过取滤液加氨试液5滴,振摇,下层显紫红色,再滴加盐酸3滴则紫红色转变为橙黄色。取龙血竭粉末少许,置白纸上,用火隔纸烘烤即熔化,但无扩散的油迹,对光照视呈鲜艳的红色;用直火燃烧则冒白烟,发出呛鼻的苯甲酸的气味。若取该品粉末1g,加乙醚20ml,密塞振摇,滤液浓缩至3m l,取3ml的浓缩液1ml加乙醇及水放置1小时后产生白色沉淀,若取该浓缩液2ml,加无水乙醇5ml放置1小时不发生白色沉淀。水试:取龙血竭粉末,置具塞试管中加水振摇,不溶于水,水溶液无色。醇溶法:国产血竭应全部溶解。取国产血竭样品用95%乙醇热溶,其溶液呈透明的暗红色,再滴加浓盐酸10滴,加入蒸馏水10~15滴,此时有棕黄色树脂析出。
一、薄层色谱鉴别
(一)血竭、龙血竭和伪血竭的薄层色谱鉴别
龙血竭无血竭素和伪品血竭的斑点。分别称取血竭、龙血竭、伪血竭样品粉末各0.1g,加乙醚10ml,振摇10分钟,滤过,滤液编号,作为供试品溶液。再取血竭素高氯酸盐对照品2mg,加甲醇4m l使溶解,溶液作为对照品溶液。吸取上述溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(30∶1)为展开剂,展开。龙血竭对比真品血竭和伪血竭来说没有斑点。
此外,王倬晅等也做过类似的试验:取伪品血竭粉末0.1g,加乙醚10ml,滤过,滤液作为样品溶液。取血竭及龙血竭对照药材,按同法制成对照药材溶液。另取血竭素高氯酸盐对照品加乙醚制成每1m l含1mg的溶液作为对照品溶液。用三氯甲烷-甲醇(19∶1)为展开剂,在同一硅胶G薄层板上展开。结果:日光下,龙血竭不显斑点(图4-2);紫外灯(365nm)下,龙血竭显2个蓝色斑点(图4-3)。
(二)麒麟竭、剑叶龙血竭和柬埔寨龙血竭的薄层色谱鉴别
分取样品各0.5g,加石油醚15m l振摇,滤过,滤液挥干,残渣加乙酸乙酯溶解为供试液。将供试液点于硅胶H薄层板上,以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)展开后喷以6%香草醛乙醇溶液与硫酸混合液(18∶1)后烘干。剑叶龙血树呈现7个斑点,柬埔寨龙血树呈现2个斑点(图4-4)。
图4-2 日光下的薄层色谱图
1.血竭素高氯酸盐 2.伪品血竭3.血竭 4.龙血竭
图4-3 紫外灯下的薄层色谱图
1.血竭素高氯酸盐 2.伪品血竭3.血竭 4.龙血竭
(三)剑叶龙血竭生药鉴别时的薄层层析
使用剑叶龙血树提取物5g加石油醚30m l振摇,滤过,滤液挥干,残渣加乙酸乙酯溶解作为供试液。另取广西血竭粉末5g按供试品溶液的制备方法制备,作为对照品。点样于硅胶板上,以石油醚(30~60℃)-醋酸乙酯(5∶1)为展开剂展开。在紫外灯(356nm)下观察后,喷香草乙醛与硫酸混合液(18∶1)显色烘干后,在可见光下观察(图4-5)。
(四)剑叶龙血树含树脂木材中其脂溶性成分的薄层色谱分析
取本品粉末1g,加石油醚(30~60℃)-三氯甲烷(1∶1)30ml,密塞放置,振摇,滤过,滤液浓缩至1ml,作为供试溶液。并将供试液点于薄层板上,用石油醚-醋酸乙酯展开剂展开。先置于紫外线灯(245nm)下观察,再喷以香草醛乙醇与硫酸混合液。色谱中显10~11个斑点(图4-6)。
(五)剑叶龙血树及其加工品(国产血竭,龙血竭)进行生药学鉴定时的薄层层析
取龙血竭粉末0.1g,加乙醚10ml振摇后,取滤液作为供试液。另取国产血竭对照品粉末0.1g,按供试品的制备方法制备,作为对照品。在薄层板上点样并用三氯甲烷-甲醇展开。置紫外灯(365nm)下观察,供试品与对照品在相应的位置上有3个相同颜色的明显斑点。
图4-4 薄层层析图
甲.麒麟竭 乙.剑叶龙血树丙.柬埔寨龙血树
图4-5 薄层层析图
1.剑叶龙血树提取物
2.广西龙血树提取物
(六)进口血竭与国产血竭(龙血竭)进行鉴别
其中进行薄层色谱分析时,分别取样品与对照品各0.1g,加乙醚后滤过,使用滤液点于硅胶板上,并以三氯甲烷-甲醇展开。血竭(丹阳市医药公司)、AA牌血竭、云南血竭、广西血竭对照品在可见光下看不到斑点,而在365nm的紫外灯下观察,于相同位置上可见颜色相同的两个斑点,分别为淡黄绿色和亮蓝色荧光斑点(图4-7)。此外王锦亮等用薄层层析法对云南、广西、海南三地的血竭及进口皇冠牌血竭的化学成分进行比较,结果表明国产3种血竭的化学成分极相似,而与进口血竭不同。
(七)龙血竭、血竭及伪品的鉴别
以血竭和龙血竭作为对照,对4种不同批次的龙血竭进行薄层色谱分析,结果见表4-1。取“柬龙牌”血竭正品和伪品各10mg,加甲醇1ml溶解,制成每1m l含10mg的溶液,作为供试品溶液,对照品亦同法,并对在紫外灯(365nm)下与龙血竭对照药材在相同位置显相同亮蓝色荧光的斑点进行光谱扫描,结果两者均在286nm下有最大吸收,可以说明样品中含有与龙血竭对照药材相同的成分,即样品中掺有龙血竭,血竭对照药材无此斑点,故可鉴别区分血竭与龙血竭(表4-1)。
图4-6 剑叶龙血树含树脂木材中其脂溶性成分的薄层色谱图
图4-7 进口血竭与国产血竭薄层色谱图
1.血竭对照品 2.血竭(镇江市医药店)3.广西血竭对照品 4.AA牌血竭 5.云南血竭6.血竭(丹阳市医药公司)
表4-1 薄层色谱实验结果
(八)国产血竭进行薄层色谱分析
国产血竭在可见光下看不到斑点,而在365nm的紫外线灯下观察可见淡黄绿色和亮蓝色两个荧光斑点。
(九)两种“柬龙牌”国产龙血竭的真伪鉴别
进行薄层色谱分析,正品“柬龙牌”血竭含黄酮、黄烷、二氢查耳酮和芪类等化合物,薄层色谱上具有明显的斑点,而伪品在与对照品色谱的相应位置上却无荧光斑点,故伪品不含黄酮、黄烷、二氢查耳酮和芪类等化合物。
(十)6种血竭样品的荧光色谱鉴别
为了对非洲一、二号血竭,南也门一、二号血竭样品(均系龙血树属植物所产的树脂)及“皇冠牌”血竭(系黄藤属)进行薄层层析,将6种样品分别用乙醚-甲醇(1∶1)溶解,用硅胶G薄层,以乙酸乙酯-三氯甲烷(4∶6)50ml加冰醋酸50滴为展开剂。国产样品有顺序为蓝紫、浅蓝、浅褐、浅黄色(2个)和黄绿色等6个荧光点;南也门样品在国产样品的荧光点相应位置上有蓝紫、翠绿、浅褐色(3个)和黄绿色6个点。
二、紫外吸收
(一)剑叶龙血竭粉末的紫外吸收鉴定
为了对剑叶龙血竭粉末进行紫外吸收鉴定,将200mg其粉末加乙醇溶解后稀释,之后将其滤液用紫外分光光度法进行检测,在285.4nm波长处有最大吸收,其吸光度为0.469。
(二)剑叶龙血树的醇浸出物的紫外光谱定性分析
同样,为了对剑叶龙血树的醇浸出物做紫外光谱定性分析,将浸出物用乙醇稀释后取滤液,置紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描,在波长284nm±2nm处有吸收。
(三)剑叶龙血树的乙醇提取物的紫外吸收测定
通过对剑叶龙血树的乙醇提取物进行紫外吸收测定,结果在284nm±2nm处有最大吸收;葛美厅等的试验表明在282nm±2nm处有最大吸收。若用乙醚提取物,紫外吸收在283nm±2nm处有最大吸收(图4-8)。
图4-8 紫外吸收曲线
1.乙醇提取物 2.乙醚提取物
(四)麒麟竭、剑叶龙血树、柬埔寨龙血树的紫外吸收测定
通过对麒麟竭、剑叶龙血树、柬埔寨龙血树都进行紫外吸收测定,在240~400nm范围内扫描其零阶导数吸收曲线。麒麟竭在270nm处有一吸收峰;剑叶龙血树在284nm有最大吸收,258nm有最小吸收;柬埔寨龙血树在282nm有最大吸收,254nm有最小吸收。其一阶导数吸收曲线三者有区别(图4-9)。
(五)不同血竭样品的紫外吸收光谱测定
通过对不同血竭样品的紫外吸收光谱进行测定,血竭样品和血竭对照品在271nm处有最大吸收峰,血竭(丹阳市医药公司)、AA牌血竭、云南血竭和广西血竭对照品在284nm波长处有最大吸收峰(图4-10)。
图4-9 零阶导数紫外吸收光谱图
甲.麒麟竭 乙.剑叶龙血树丙.柬埔寨龙血树
图4-10 不同血竭的紫外吸收光谱图
……为血竭对照品、血竭(镇江市医药站)┈┈为广西血竭对照品、AA牌血竭、云南血竭(丹阳市医药公司)
(六)血竭、国产血竭(龙血竭)和其伪品的紫外吸收光谱测定
通过对血竭、龙血竭和其伪品的紫外吸收光谱在200~400nm波长范围内进行光谱扫描,结果说明龙血竭在206nm处有最大吸收(图4-11和表4-2)。
表4-2 紫外光谱鉴别结果比较
注: +表示有最大吸收,-表示无最大吸收
图4-11 紫外吸收光谱图
1.血竭 2.龙血竭 3.伪品血竭
(七)两种“柬龙牌”国产龙血竭的真伪
分别对两种“柬龙牌”国产龙血竭的真伪进行紫外吸收光谱测定,发现正品“柬龙牌”血竭在284nm有最大吸收,并在330nm处有一肩峰,280和330nm左右为黄酮、黄烷、二氢查耳酮的特征吸收,伪品血竭中不含这几类化合物。
三、血竭与龙血竭的HPLC鉴别
虽然血竭和龙血竭拥有类似的颜色和形状,甚至同样的疗效,但这两种植物属于不同的科属,它们的化学成分是绝对不一样的,在相同的高效液相色谱条件下得到的色谱图可以很容易地观察到两图一点都不相似。刘薇等为寻找血竭和龙血竭药材的专属性成分,形成以特征离子为目标的鉴别方法,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间-质谱(UPLC-QTOF/MS)进行测定,采用Markerlynx软件对血竭和龙血竭药材的质谱数据进行主成分分析,找出对区分药材有贡献的色谱峰,并采用软件对差异性成分进行鉴定。根据主成分分析,血竭和龙血竭分别聚在不同的区域,显示血竭和龙血竭的化学成分有差异,可作为血竭和龙血竭的定性鉴别方法。此方法可以用于区分血竭和龙血竭的定性鉴别。