microRNAs（miRNAs）是一类进化上高度保守的非编码小分子单链RNA（约22nt），在转录水平负性调控靶基因表达，参与调控动脉粥样硬化形成与发展的全过程。miRNAs不仅存在于细胞质内，还稳定存在于细胞外，如血液循环。因此，miRNAs被认为是多种疾病的潜在生物标志物。冠心病（coronary heart disease，CHD）高危类型——急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS），包括ST段抬高型心肌梗死（ST elevated myocardial infarction，STEMI）、非ST段抬高型心肌梗死（non-ST elevated myocardial infarction，NSTEMI）和不稳定型心绞痛（unstable angina，UA），其早期发现与快速诊断是患者及时获得最佳治疗方案的有力保障，但是现有标志物并不能完全满足这一条件。心脏肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）或超敏肌钙蛋白（hs-cTn）作为诊断急性心肌梗死（acute myocardiol infarction，AMI）的金标准具有时间延迟性，通常在心肌坏死后3小时才可在血液中检测到。而对于UA患者目前尚缺乏有效的诊断标志物，也缺乏鉴别稳定性冠心病（stable CHD）和UA的标志物。如今，miRNAs的出现为冠心病诊断标志物的研发带来了新的机遇与挑战。本文重点围绕miRNAs生成过程、循环中miRNAs特点和miRNAs在冠心病诊断中的潜在价值进行阐述。

编码miRNAs的基因序列位于基因间区或内含子区域。基因间miRNAs通常位于两个基因编码区之间，有其独立于宿主基因的转录启动子。相反，内含子miRNAs位于蛋白编码基因的内含子序列内，常与该宿主基因有共同的启动子及转录调节子 ^[1，2]。miRNAs多由RNA聚合酶Ⅱ（极少为RNA聚合酶Ⅲ）转录出长约数千个碱基的初级miRNAs转录本，即“pri-miRNAs”，包含一个茎环结构、一个5'端帽子和3'端多聚A尾结构 ^[3]。pri-miRNAs在Drosha（属于核酸内切酶Ⅲ家族）/DGCR8（di georgegyndromecritical region gene 8）酶复合物作用下，被剪切成具有茎环结构的长约70个核苷酸的miRNAs前体，即“pre-miRNAs” ^[4]。随后，pre-miRNAs在Exportin-5运输下由细胞核进入细胞质 ^[5]，并在核酸内切酶Ⅲ家族的另一成员Dicer酶剪切下，去除茎环结构，形成长约22个核苷酸的miRNA双链结构（miRNA guide strand/passenger strand，既往称miRNA和miRNA*），通常是guide strand进入RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），该复合体内含Argonaute 2，后者可促进miRNA与靶mRNA 3'端非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）以碱基互补配对方式结合，导致mRNA降解（完全互补结合，哺乳动物为此方式）或抑制mRNA翻译（不完全互补结合） ^[6]。根据miRNAs序列来自pre-miRNAs的3'臂或5'臂，成熟miRNA被命名为miRNA-3p和miRNA-5p（图1）。据估计约60%以上的蛋白编码基因受到miRNAs的直接调控 ^[7]。一个miRNA可以调控多个靶基因，一个靶基因也可以受多个miRNAs的调控，同一个miRNA还可在不同细胞组织内发挥调控作用，因而在人体病理生理学改变中形成复杂的网络调控模式。

最初研究人员认为miRNAs只存在于细胞内，但2007年Valadi等发现外泌体内有miRNAs存在，外泌体可携带miRNAs进入其他细胞，在细胞间发挥生物学信号交流、介导miRNAs的基因调控作用 ^[8]。随后研究者发现miRNAs其实存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液和尿液等 ^[9]。凋亡、坏死、氧化应激或炎症等病理性刺激均可促使细胞释放miRNAs至血液循环。血液循环中的miRNAs以凋亡小体（＞1000nm）、微颗粒（100～1000nm）、外泌体（＜100nm）囊泡形式或与脂蛋白（如HDL） ^[10]、RNA结合蛋白（如Argonaute 2） ^[11]形成复合物存在。人工合成的miRNAs在血浆内会被RNA酶快速降解 ^[12]，而人体血浆中分离出的miRNAs由于有上述囊泡或脂蛋白的保护，不易被RNA酶降解，非常稳定。循环miRNAs耐沸水煮、耐酸碱、耐反复冻融，可在室温下长时间放置 ^[13]，这些特性为其作为疾病相关标志物奠定了基础。

miR-1、miR-133、miR-208a、miR-208b和miR-499等miRNA是肌细胞特异表达的miRNAs ^[14]，心肌梗死后它们会被快速释放进入血液，导致其在血液循环中的水平特异性增高。目前，有关AMI诊断的临床研究均围绕这些miRNAs展开（表1），其中一些miRNA可能是比cTn更早的AMI诊断标志物。

Wang等 ^[14]发现AMI患者在发病12小时内（平均时间4.8小时），血浆中miR-1、miR-133、miR-208a和miR-499较对照组均显著增高。受试者工作曲线（receiver-operating-characteristic curves，ROC）分析显示，4个miRNAs均具有AMI诊断价值，曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.847～0.965，其中miR-208a敏感性和特异性最高，分别为90.9%和100%（cTnI AUC=0.987）。他们还发现，发病4小时内采集到的20例AMI患者血浆中，均可检测到升高的miR-208a，而仅在17个标本中检测到cTnI，提示miR-208a可能是优于cTnI的AMI早期（特别是发病4小时内）诊断标志物（注：AUC代表标志物的准确性）。

一项较大规模的临床研究也证实 ^[15]，AMI患者血浆中miR-208b和miR-499水平均明显高于健康对照者，且STEMI患者高于NSTEMI患者，提示血浆中miRNAs升高水平可能与心肌坏死程度有关。值得注意的是，他们还发现患者发病1小时内，miR-208b和miR-499水平已经高于对照组。在发病3小时内，miR-499诊断AMI阳性率为93%，略高于hs-cTnT（阳性率为88%）。遗憾的是，miR-499未能提高hs-TnT对AMI的诊断正确率。然而，另一项以疑似ACS患者为分析对象的研究却发现 ^[16]，miR-1和miR-499可以增加hs-TNT的ACS诊断正确率，AUC由0.86增至0.90。

由于NSTEMI患者常缺乏典型症状和明显的心电图改变，而一些特殊人群，如老年人合并心力衰竭和慢性肾脏病等疾病时，也可出现cTn升高，导致cTn假阳性，使两者不易鉴别，最终延误诊治。Olivieri等 ^[17]的研究提示miRNAs在上述疾病鉴别诊断中有潜在优势。他们检测了伴有心力衰竭的老年NSTEMI患者（平均82.6岁）、无AMI的心力衰竭患者（平均81.3岁）和健康对照者（平均79.5岁）循环中miR-1、miR-21、miR-133a、miR-208a、miR-423-5p（在心衰患者循环中升高 ^[18]）和miR-499-5p的水平。发现与健康对照组相比，NSTEMI患者循环中miR-499-5p和miR-21水平不仅高于健康对照者，还高于心力衰竭者。在NSTEMI和急性心力衰竭患者的鉴别诊断中，miR-499-5p的诊断正确率高于cTnT或hs-cTnT（miR-499-5p AUC=0.86，cTnT AUC=0.68，hs-cTnT AUC=0.70）。

上述研究表明，相比于cTnT或hs-cTnT，miRNAs在AMI早期诊断及鉴别诊断中有重要价值。但在AMI诊断正确率上，miRNAs可能并不优于cTn。

Li等 ^[19]检测AMI患者发病12小时内的血浆miR-1、miR-133a、miR-208b和miR-499，发现4个miRNAs水平均明显高于健康对照者，且具有AMI诊断潜能，AUC为0.8265～0.9468，但敏感性和特异性均低于cTnT（AUC 0.9820）。

2014年Cheng等 ^[20]对miRNAs作为心肌梗死诊断标志物的研究进行了荟萃分析。在纳入的19项研究中，研究排前4位的miRNAs依次是miR-499、miR-1、miR-208b和miR-133a。其中，miR-499的敏感性为0.88，特异性为0.87，AUC为0.9584；miR-1的敏感性为0.63，特异性为0.76，AUC为0.8519；miR-208b的敏感性为0.78，特异性为0.88，AUC为0.8965；miR-133a的敏感性为0.89，特异性为0.87，AUC为0.9434。这4个miRNAs均与现有AMI诊断标志物具有相关性。作者认为，miR-133a和miR-499最具有心肌梗死诊断价值，miR-208b在心肌梗死中的诊断作用有待进一步证实。2015年一项前瞻性、国际多中心的大规模研究证实 ^[21]，虽然miR-208b在AMI中具有诊断价值（AUC 0.76），但其诊断正确率低于cTnT（AUC=0.84）或hs-cTnT（AUC 0.94），即使miR-208b联合cTnT或hs-cTnT诊断时，也不能提高AMI诊断正确率。

此外，miRNAs能否作为AMI诊断标志物，还需要了解其在心肌梗死后随时间变化的特点。Liebetrau等 ^[22]通过行室间隔心肌消融术的患者，模仿急性心肌细胞坏死病变，巧妙地回答了这一问题。他们在肥厚型梗阻性心肌病患者行室间隔心肌消融术前，及术后15分钟～24小时的多个时间点收集血液样本，检测血清中miR-21、miR-208a、miR-1和miR-133a的释放动力学。发现在术后15分钟，miR-1已升高3倍，75min达到峰值（66.8倍）；miR-21始终未升高；miR-133a在术后15分钟即明显增高（2.9倍），75～480分钟持续处于高值（＞50倍）；miR-208a仅在术后105分钟升高2.8倍，之后未再继续升高，并逐步降至正常。总之，miR-1、miR-133a和miR-208a在诱导性心肌梗死4小时内均持续升高，特别是miR-1和miR-133a升高时间更早，并与hs-cTnT水平呈线性相关。该研究为miRNA作为心梗标志物研究提供了重要的时间参考依据。

UA患者是发生AMI的高危人群，既往有许多研究者致力于寻找诊断或预警UA的生物标志物，可惜结果并不理想。而miRNAs的出现为获得UA相关标志物带来了新希望。

我们课题组通过高通量手段筛查发现 ^[32]，UA患者循环miRNAs表达谱与非心源性胸痛患者相比有明显差别，UA患者血浆中miR-106b/25、miR-17/92a簇、miR-21/590-5p家族、miR-126*和miR-451显著增高，它们均具有诊断UA的潜能，AUC为0.720～0.799。此外，这些miRNAs在稳定型心绞痛患者中并未升高。

Zeller等 ^[33]发现，与非冠心病胸痛患者相比，UA患者血清中miR-132、miR-150和miR-186显著升高，虽然3个miRNAs无单独诊断UA的能力，但联合后可提高其对UA的诊断价值（AUC 0.91）。Hoekstra等 ^[34]发现，UA患者单个核细胞内miR-134、miR-198和miR-370水平明显高于稳定性冠心病患者。

虽然上述研究中标本类型不同，但结果均显示UA患者循环中miRNAs水平与正常人明显不同，提示miRNAs有成为UA诊断标志物的潜在价值。需要注意的是，目前有关UA的miRNAs标志物研究尚处于起步阶段，样本量均较小（仅数十人），标本类型不统一、患者入选标准不亦统一等，是今后研究中需要解决的问题。

Fichtlscherer等 ^[35]通过高通量技术，检测了稳定冠心病患者（至少1支血管狭窄＞50%）和健康对照者血浆中miRNAs表达谱，发现miR-133和miR-208a（心肌细胞富含）在患者组明显增高，而miR-126、miR-17和miR-92a（内皮细胞富含）、miR-145（血管平滑肌细胞富含）、miR-155（炎性细胞富含）均显著下调。

D'Alessandra等 ^[36]发现，miR-337-5p、miR-433和miR-485-3p水平（均增高）与冠心病（至少一支冠脉血管狭窄＞70%）呈正相关。特别是与健康者相比，miR-1、miR-122、miR-126、miR-133a/miR-133b、miR-199a、miR-485-3p和miR-377-5p在UA和稳定性冠心病患者血浆中均明显增高。ROC曲线分析显示，仅miR-1、miR-126和miR-485-3p具有稳定性冠心病诊断潜能，AUC分别为0.918、0.929和0.851；仅miR-1、miR-126和miR-133a具有诊断UA的潜能，AUC分别为0.920、0.906和0.867。miR-1、miR-126和miR-485-3p组合在鉴别稳定性冠心病患者与健康对照者时，诊断正确率＞87%。但是，未发现可用于鉴别稳定性冠心病和UA的miRNAs。

多个研究提示，外周血单个核细胞内miRNAs与稳定性冠心病明显相关。Hulsmans等 ^[37]发现肥胖患者外周血单核细胞内miR-181a表达减少，与冠心病的发生具有相关性。Hoeckstra等 ^[34]则发现，冠心病患者外周血单个核细胞内miR-135a和miR-147明显高于健康对照者。Zhu等还发现，与非心源性胸痛患者相比（ n=31），稳定型心绞痛患者、UA患者、AMI患者外周血单个核细胞中miR-155水平，随着冠心病严重程度逐渐降低，此外，2或3支血管发生病变（狭窄程度＞50%）的患者，其外周血单个核细胞内miR-155水平明显低于无或仅一支血管病变患者 ^[38]。

近年来，也有人开始关注miRNAs基因多态性对冠心病的影响。Xiong等 ^[39]通过对中国汉族人群中295例CHD患者和283例正常对照者研究发现，pre-miR-146a rs2910164位点多态性，可能通过促进miR-146a表达，增加患CHD风险。日本一项纳入66例CHD患者和33例非CHD患者的队列研究发现，miR-146水平在CHD组明显增高 ^[40]。

需要注意的是，常用心血管药物可以影响循环miRNAs的表达谱 ^[40，41]。如，稳定冠心病患者血液中内皮祖细胞来源的miR-221、miR-222水平及外周血单核细胞来源的miR-146a、miR-146b水平明显升高，在经过阿托伐他汀与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗12个月后，miR-221、miR-222、miR-146a、miR-146b的表达水平较前明显降低。因此，miRNAs标志物的筛选需要考虑到药物因素的影响。

目前用于miRNAs检测的常用方法主要有生物芯片技术、二代测序技术和实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。生物芯片技术可在短时间内快速获得miRNAs表达谱，即高通量筛查。但是当前各商业性生物芯片平台（主要包括Agilent、Ambion、Exiqon和Toray公司）之间的检测结果，在一致性方面并不理想 ^[42]。目前最常用的筛选循环miRNA的高通量技术是Ambion公司的TaqMan低密度芯片（TaqManlow density Array，TLDA），该方法基于PCR原理，有外置内参做校正，检测结果相对稳定可靠。采用二代测序技术检测血浆或血清中的miRNAs表达谱，首要问题是样本量消耗大，至少需要数毫升血浆或血清，而生物芯片只需要几百微升血浆或血清。实时荧光定量PCR是目前应用最普遍的miRNAs检测技术，但该方法也有一定的问题 ^[43]，如血浆和血清哪个更适宜做miRNA的标本来源尚无一致意见，样本发生溶血对循环miRNA检测会产生影响 ^[44]。此外，实时荧光定量PCR技术从RNA提取到得到PCR结果，至少需要3小时，如此低的检测效率用于临床ACS诊断也是非常困难的。正在研发中的生物传感器技术，其响应时间可快至数秒，灵敏度在pg级以下，有望在提高miRNAs检测效率上带来突破性进展。

虽然循环miRNAs在冠心病诊断中的研究尚处于起步阶段，但大量研究已经证实，miRNAs是一类具有潜在诊断价值的新型生物标志物。目前各项研究的结果出现不一致情况，主要与样本量偏小（仅数十例），标本来源（血浆、血清、全血、单个核细胞）、入选标准、检测方法、校正内参等多方面因素不同有关。所以今后需要进行标本类型、检测方法等一致的、较大规模的临床研究，以实现对miRNAs诊断效能的有效评估。由于目前大部分研究发现miRNAs在AMI诊断正确率上低于或等同于现有的传统标志物，仅极少数研究显示miRNAs优于传诊断标志物，故miRNAs暂被认为是现有标志物的补充或辅助诊断标志物，尚不能成为独立诊断标志物。但是，在AMI早期阶段，血液循环中心肌坏死标志物浓度非常低或尚无法检测到时，miRNAs可能会提供非常重要的辅助诊断信息。

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