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第三节 酶免疫检验
172.为什么酶免疫分析技术广泛应用于临床免疫检验
答：酶免疫分析技术是经典标记免疫技术之一，20世纪60年代Engvall和Perlmann等在酶免疫组织化学的基础上发展了酶标记固相免疫测定技术，应用于临床各种标记物检测。1972年Rubenstein等建立了一种无需分离洗涤步骤的均相酶免疫测定技术，此技术广泛应用于小分子微量物质的测定。随着免疫学技术的发展，如单克隆抗体技术的问世和生物素-亲和素放大系统的应用，酶免疫分析技术逐步取代了放射免疫分析技术。利用酶标记的抗原或抗体与待检样品中的抗体或抗原发生特异性结合，然后加入相应标记酶的底物，之后酶催化底物，底物发生氧化、还原及水解等反应，形成有色免疫复合物，用酶标仪检测吸光度后对待检样品中相应的抗体或抗原做定性或定量分析，具有高度的灵敏度和特异性。酶免疫分析技术包括酶免疫组化（enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）和酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）。前者可实现定位检测，后者广泛用于体内各种可溶性蛋白的检测。
173.为什么均相酶免疫测定时间较短
答：酶免疫测定技术根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物分为均相和异相免疫测定两种类型。均相酶免疫测定：在酶标抗原与抗体反应后，标记酶的活性会发生改变，可以在不将酶标抗原-抗体复合物与酶标抗原分离的情况下，通过直接测定反应体系中总标记酶活性的改变，即可确定酶标抗原-抗体复合物的形成量，进而推算出样品中待测抗原的含量。均相免疫测定的优势为抗原或抗体没有经过固相化过程，分布于液相中可保持其天然结构，蛋白质原有的生物学活性没有发生改变，液相中的反应可使抗原、抗体分子有较高的碰撞概率，反应达到平衡的时间较短，因此检测时间也较短。
174.为什么固相酶免疫测定较液相酶免疫测定更广泛用于临床检测
答：异相酶免疫测定是指在酶标抗体与抗原反应后，先把酶标抗体-抗原复合物与酶标抗体分离，然后测定酶标抗体-抗原复合物或酶标抗体中酶的量，进而推算标本中待测抗原含量；异相法又分为固相异相酶免疫测定和液相异相酶免疫测定。固相酶免疫测定是利用固相载体预先吸附抗体将其制成固相制剂，然后与酶标抗体反应，再对固相进行洗涤去除未结合的游离酶标抗体，通过测定固相载体上的酶标抗体-抗原复合物中酶催化底物生成的有色产物，确定样品中待测抗原的含量。固相异相酶免疫测定的特点为只需经过固相洗涤，就可以达到抗原-抗体复合物与其他物质分离的目的，极大地简化了操作步骤，作为常用的酶免疫测定方法广泛应用于临床检测中；而液相异相酶免疫测定是抗原抗体反应在液相中进行，反应达平衡后加入分离剂，经离心沉淀后，弃上清液，通过测定酶标抗体-抗原复合物沉淀中酶催化底物生成的有色产物，来推算标本中待测抗原的含量。此法由于存在液相分离、沉淀等步骤，操作相对较为繁琐，在临床检测中的应用相对受限。
175.为什么酶免疫测定中最常用酶联免疫吸附试验
答：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种固相的非均相酶免疫测定法，系1971年荷兰学者van Weeman和瑞典学者Engvall最先报道。由于该法具有操作简便，灵敏度高，特异性好，试剂稳定，结果容易判断等许多优点，使其成为免疫测定中应用最广泛的一项技术。ELISA的基本原理是：①抗原和抗体能与固相载体表面结合并保持其免疫活性；②抗原或抗体与酶结合的标记物，既能保持抗原或抗体的免疫活性，又能保持酶的活性；③待检物中的抗原或抗体与固相表面的抗体或抗原发生免疫反应并结合在固相表面，此抗原抗体复合物又能结合相应的酶标记物，用洗涤方法除去未结合而游离的酶标记物，继而加酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，显色的程度与待检物中的抗原或抗体的量直接相关，由此可根据显色的深浅进行定性和（或）定量测定。其方法类型包括：双抗体夹心法、间接法、竞争法和捕获法等。
176.为什么ELISA中的包被抗原或抗体可以直接吸附于固相载体
答：包被是指将抗原或抗体固定到固相载体表面的过程；该过程可通过被动吸附、间接非共价吸附或共价吸附的方式进行。被动吸附：蛋白通过疏水性相互作用吸附于聚苯乙烯表面，是ELISA试剂盒常用的方法。被动吸附方法简单，但因为蛋白的吸附过程存在随意性，蛋白质结构可能出现折叠，其功能性结合部位可能朝向固相载体而不利于反应的进行。另外，被动吸附的蛋白与固相载体的结合紧密度不一，结合疏松的蛋白则容易脱落。影响被动吸附的因素最重要的是温度、时间和浓度。间接非共价吸附：是将欲包被蛋白通过金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）、抗IgG或链霉亲和素作为中介吸附到固相载体上；SPA能与IgG分子中的Fc片段结合且不影响抗体的活性，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子。共价吸附：抗原或抗体与固相载体上的活性基团-COOH、-NH 2等在戊二醛的作用下通过缩合反应以化学交联的方式结合。一些小分子多肽、DNA、糖脂或聚核苷酸多采用这种方式固相化。这些小分子物质的疏水性区域较少而不易通过疏水性相互作用而吸附，共价吸附的方式有助于其和固相载体稳定结合。
177.为什么ELISA中常用的固相载体为聚苯乙烯
答：固相载体的选择是酶免疫分析技术中的重要环节。理想的固相载体应具备以下特点：①在检测过程中固相载体作为吸附剂和反应的容器不参与反应；②与抗体（抗原）以非共价或物理吸附方式结合到载体上，结合稳定不易脱落；③与之结合的抗体（抗原）等免疫反应物固相化后其免疫活性不发生改变，且有利于反应进行，其活性基团朝向反应溶液；④固相化方法简便易行、价格低廉。可作为固相载体的物质很多，有聚苯乙烯、聚氯乙烯、硝酸纤维素膜、尼龙膜磁性微粒等。聚苯乙烯具有很好的透光性和蛋白吸附能力，聚苯乙烯碳链主链结构是碳链，侧链带有非极性基团，因此表面具有疏水性；蛋白质分子含有多种带非极性侧链的氨基酸残基，其疏水性侧链间及侧链与蛋白质骨架的α-CH间可形成疏水键，通过疏水键的作用可将包被抗体或抗原吸附于固相表面。为此，在ELISA试验中常用聚苯乙烯作为固相载体。
178.为什么ELISA中标记酶的质量是检测的关键因素
答：酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，选择合适的酶对抗体或抗原进行标记，是酶免疫测定中的重要环节。一个酶蛋白分子每分钟可催化10 3～10 4个底物分子转变成有色产物。因而用酶标记抗体（或抗原）建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度；为此，用于标记的酶应符合下列要求：①酶活性高，能对低浓度底物产生较高的催化反应率；②具有可与抗原、抗体共价结合的基团，标记后酶活性保持稳定，而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性；③酶催化底物后产生的信号产物易于判定或测量，且方法简单、灵敏和重复性好；④酶活性不受样品中其他成分（内源性酶、抑制物）的影响，用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活；⑤酶、辅助因子及其底物均对人体无危害，理化性质稳定，且价廉易得。
179.为什么ELISA测定中常使用辣根过氧化物酶作为酶标记物
答：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）来源于植物辣根中，分子质量为40ku，是由无色酶蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）组成的一种复合物。辅基是酶的活性基团，为深棕色的含铁卟啉环，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。HRP的纯度用RZ（纯度数）表示，它是以HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值来表示。RZ值与酶活性无关，后者以单位（U）表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变活性降低，因此，使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更重要。HRP易获得高纯制品，稳定性及酶标记物的收率较高，且价格较低，故易应用普及。HRP对热和有机溶剂比较稳定，氰化物或硫化物在10 -6～10 -5mol/L时能可逆性抑制HRP作用，氟化物、叠氮化合物在高于10 -3mol/L浓度时可以抑制HRP作用，强酸也可有效抑制HRP。因此，酶免疫测定时可用叠氮钠及硫酸等终止其酶促反应。
180.为什么ELISA中常使用四甲基联苯胺作为辣根过氧化酶的底物
答：辣根过氧化物酶（HRP）常用的底物有邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）和苯酚偶联底物等。其中，TMB氧化后其产物联苯醌在波长450nm处有最大吸收峰。H 2O 2和TMB反应时形成蓝色的阳离子根，当pH降低时，蓝色的阳离子根则转变为黄色的联苯醌。可使用硫酸终止催化反应，产物稳定的时间一般为90分钟。又因TMB相对于OPD没有致突变作用，因此在酶免疫测定中使用广泛。在成品的试剂盒中，TMB底物通常为配好的A液和B液，其中一种为H 2O 2溶液，另一种为TMB溶液。由于TMB在溶液中不稳定，实际工作中如发现A液和B液单独显色或两者混合后显色，说明该试剂已经变质，不应使用，以免导致假阳性结果。
181.为什么酶标记物需采用高纯度的抗原或抗体
答：抗原一般有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原来自动物组织或体液、微生物培养物等，往往含有多种抗原成分，需经纯化后提取其特定抗原成分方能应用，重组抗原和多肽抗原为人工合成，使用安全且纯度高，干扰物质少。制备合成多肽抗原有较高的技术难度且需昂贵仪器设备和试剂，适用于制备不易天然得到的抗原。用于酶免疫分析的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体两大类。多克隆抗体即通常所说的抗血清，其成分复杂，如采用多克隆抗体包被，应提取其中的IgG后方可包被。富含单克隆抗体的小鼠腹水适当稀释后可直接进行包被。酶标记抗原或抗体形成的酶结合物是酶免疫技术的核心试剂，其质量直接影响酶免疫技术检测的效果。酶结合物通常通过化学交联得到。理想的化学交联方法要求得到的产物分子组成明确、酶及抗原或抗体在反应前后不失活，酶与蛋白的链接稳定并且操作方法简便、费用低廉。
182.为什么双抗体夹心法不用于检测药物和激素等小分子半抗原
答：双抗体夹心法是ELISA检测抗原最常用的方法，但要求检测的抗原分子中至少具有两个抗原决定簇，因此该方法不能用于药物、激素等小分子半抗原的检测。原理是先将特异性抗体包被于固相载体，加入待测样品使固相载体上的抗体与样品中待检抗原的抗原决定簇结合而形成固相抗体-抗原复合物，洗涤除去游离成分，加入酶标抗体，固相化的免疫复合物中的抗原与酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。小分子半抗原物质分子质量小不能形成该免疫复合物，故无法采用双抗体夹心法予以检测。
183.为什么双抗体夹心法测定时应注意避免待测标本中类风湿因子的干扰
答：类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是针对自身变性IgG的抗体，主要是IgM型，能和多种动物变性IgG的Fc段结合。在双抗体夹心法检测抗原时，包被抗体需经洗涤除去未结合的抗体和杂质，然后加待检标本，反应后洗涤去除未结合物质，再加酶标抗体反应后，洗涤除去未结合的酶标抗体，最后加底物显色。此时，如血清标本含有RF则会同时结合固相抗体和酶标抗体，即通过RF的桥联作用将酶标抗体结合到固相表面，使之显色而出现假阳性结果。如将酶标记抗体先经胃蛋白酶处理，去除Fc片段，则可避免假阳性结果。
184.为什么双抗体夹心法检测时人抗鼠抗体会引起假阳性
答：在双抗体夹心法测定抗原时，常使用一对鼠单克隆抗体与检测抗原反应，如患者因影像学检查和治疗使用过鼠单克隆抗体或与动物有密切接触史，则体内会产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA），血清中HAMA可在种属单克隆抗体间起桥梁作用，导致在无抗原情况下也能出现免疫反应阳性结果，即假阳性现象。此时的测定模式：标本中的HAMA分别与固相HBsAb和标记HBsAb（一对鼠单克隆抗体）结合，形成固相HBsAb-HAMA-标记HBsAb复合物（也是一种双抗体夹心）；该反应并不是针对待测抗原，故为假阳性。
185.为什么间接法检测的抗体类别多为IgG
答：间接法常用于血清中抗体的检测。原理是将抗原包被到固相载体上，再与样品中待检抗体结合成包被抗原-待检抗体复合物，再用酶标记的抗抗体（针对待检抗体的二抗，如兔抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，从而使酶标二抗复合物固相化，然后测定加底物后的显色程度来确定待检抗体含量。由于间接法采用的酶标二抗针对一类免疫球蛋白分子，且通常用的是抗人IgG，因此检测的抗体类别为IgG，不涉及IgA或IgM。并且，此法只需变换包被抗原，即可用一种酶标二抗检测多种针对不同抗原的抗体，具有更好的通用性。需要注意的是，高浓度的非特异性IgG抗体有可能吸附于固相从而产生假阳性反应，所以在应用此方法进行测定时常需先将样本作一定的稀释来避免非特异性IgG抗体对检测的干扰。
186.为什么通常采用捕获法来检测IgM类抗体
答：捕获法常用于病原体急性感染中特异性IgM类抗体的检测。受到特异性抗原刺激后一定时间，人体血清内可同时存在针对此抗原的特异性IgM类抗体和特异性IgG类抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM类抗体，IgG类抗体将竞争结合固相抗原而使一部分IgM类抗体不能结合到固相上而影响检测结果。因此如果采用间接法测定IgM类抗体，必须先用A蛋白或抗IgG抗体处理标本以除去IgG类抗体的干扰，反应操作稍显繁琐。故在临床检验中多采用捕获法测定IgM类抗体。其原理是先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获标本中的IgM类抗体（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性IgM抗体），然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM类抗体结合，继而加入针对抗原的酶标记特异性抗体，形成固相抗人IgM抗体-特异性IgM类抗体-抗原-酶标抗体复合物，再加入底物，显色程度与标本中的特异性IgM类抗体的量呈正相关。
187.为什么竞争法常用于测定抗体含量较高的标本
答：竞争法是将待检样品和酶标记抗体或酶标记抗原同时加入反应孔中温育，使之与包被抗原或包被抗体竞争性地结合，因此，本法既可以包被抗体检测抗原，也可以包被抗原检测抗体。用竞争法检测抗体有其一定的优点，它仅需制备酶标记抗体，成本较低，在操作步骤中同时加待检物和酶标记物使实验省时快速，与一步夹心法相比，它无钩状效应的影响，避免了假阴性现象。此外，竞争法的无色背景较好，但竞争法的灵敏度不及夹心法和间接法，故仅适用于检测抗体含量高的待检标本。
188.为什么ELISA检测标本时要设定合适的对照
答：ELISA检测需要设置阳性对照孔和阴性对照孔以保证实验的准确性，如：用夹心法和间接法ELISA测定时，阳性对照孔应该显色，阴性对照孔应该无色；竞争和竞争抑制法ELISA中阳性对照孔应该无色，阴性对照孔应该显色，若两种对照均显色或均不显色，提示实验存在差错，该次检测结果无效。另外，对照孔也是确定cut-off值的依据，夹心法中待检物A值大于阴性对照A值的2.1倍为阳性；竞争法中待检物A值小于阴性对照A值的1/2为阳性。对照物中除了有或无待检的抗原（或抗体）之外，其余成分应该与待检物相同，例如检测人血清中抗原或抗体，对照物最好也用原倍的人血清配制，若用含10%小牛血清PBS替代，则对照孔的酶标记物非特异性吸附会比待检孔高。
189.为什么ELISA检测前必须对包被的微量反应板进行质量鉴定
答：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖酐、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样，用0.2μg/ml纯化的正常人IgG进行包被，经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度（OD值）。一般认为全板中每两孔间OD值的误差不超过10%为合格。如果中间孔与四周孔OD值相差太大，或者反应板四周凹孔之间的OD值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清OD值是否有明显差别。一般要求有10倍左右的差异为合格，微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理，用蒸馏水冲洗即可应用。
190.为什么ELISA操作中必须洗涤充分
答：洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但一定程度上影响检测结果的准确性。通过充分洗涤才能达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤的方法除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种。
（1）流水冲洗式最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水、自来水，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。
（2）浸泡式是微量滴定板洗涤最常采用的方式，洗涤液为非离子型的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含有疏水基团，也含有亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。
在ELISA操作中，洗涤是非常关键的步骤。它可以清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，所以必须充分洗涤才可以把这种非特异性吸附的干扰物质有效洗涤下来，从而防止产生假阳性。
191.为什么ELISA操作均需有封闭的步骤
答：固相载体在抗原或抗体包被后，吸附的蛋白仅占固相载体表面的一小部分，而留有许多空余位置，这些空余位置是造成酶标记物非特异性黏附，导致检测背景增高的主要原因。因此，在包被后需用封闭剂封闭酶联板上未结合抗原或抗体的微孔，则结合抗体或抗原时就不会出现非特异性结合，不会影响检测的准确度。常用的封闭剂有酪蛋白、脱脂奶粉、山羊血清、BSA及明胶等；其中酪蛋白形成单层分子膜，与固相载体的吸附率极强，几乎可以阻断所有酶标记抗体的非特异性吸附，1μg/ml浓度可达到94%的封闭效果，山羊血清使用浓度为5%～10%，BSA为10mg/m l，加封闭剂后置37℃2小时，均能封闭90%以上的空余位点。
192.为什么ELISA测定时需特别注意检测的重复性
答：ELISA作为临床常用的免疫检测方法之一，可批量化操作，通常情况下不需特殊大型自动化仪器；因此检测成本较低。正因为其手工操作程序多，与全自动的发光测定系统，测定重复性稍逊，较难获得很满意的结果；可能性原因有：样品数量较多，加样时间过长，加样量不一致，孵育时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不同。其解决方法：重复测定标本时，尽可能使用同一移液器，装紧吸嘴，实验条件、操作人员应尽量与上次保持一致，以排除这些因素造成的重复性不佳。目前已有全自动酶免疫测定分析仪，可以全自动完成ELISA试验，包括样本稀释、加样、试剂分配、孵育、洗板、酶标判读、结果打印等步骤，其检测重复性得到了很大的提高。
193.为什么ELISA测定易受到时间、温度和pH的影响
答：由于反应条件会影响ELISA方法的灵敏度和准确性，因而建立一个最佳反应体系是测定的一个重要环节。其中，常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液等；抗原抗体复合物在偏酸或偏碱的环境下易于解离，故一般要求缓冲液的pH在7.0～8.5左右。离子强度过高，不利于抗原抗体结合反应，而离子强度过低，则缓冲能力不足，一般以0.01～0.1mol/L为宜。抗原抗体反应达到平衡，要求适宜的温度和温育时间，它又与抗体本身的亲和力直接相关，不同批次的抗体所需的时间和温度会有所差异；有的在室温下15分钟即可达到平衡，有的则在4℃下数天才能达到平衡。因此，在建立ELISA方法时须选择不同的温度和温育时间加以比较，以选取最适宜的检测条件。
194.为什么ELISA反应需要一定时间的孵育
答：ELISA反应的实质是抗原-抗体特异性结合。抗原抗体完成结合反应的保温过程称为孵育；每次孵育是为了使特异性的抗原抗体彻底结合，以避免在洗脱时把还没来得及与特异性抗原结合的抗体洗掉，这需要时间。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面发生。以抗体包被的夹心法为例，加入反应孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，两次抗原抗体反应一般在37℃经1～2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应在4℃更为彻底，放射免疫测定多在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀；但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。
195.为什么生物素-链霉亲和素系统能提高ELISA检测的灵敏度
答：生物素-链霉亲和素（biotin-streptavidin，BSA）酶免疫测定分析是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素与链霉亲和素间的高度放大作用建立的一种检测系统。1分子SA可与4分子B相结合，生物素易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合，结合了酶的链霉亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时催化作用而呈色，从而在实现检测未知抗原（或抗体）分子的同时达到了提高分析灵敏度的目的。由于链霉亲和素与生物素间的亲和力极强、反应迅速且稳定、生物素标记抗体和酶的标记率高，且不影响蛋白的活性，使该检测法比普通酶标法有更高的灵敏度；BSA ELISA已广泛用于微量抗原、抗体的定性、定量检测及定位观察。从而该技术在免疫学和DNA分子生物学领域中应用日益广泛。
196.为什么ELISA技术可延伸和发展为酶联免疫斑点检测
答：酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT assay）源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测由细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，他们最大的不同在于：①ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或细胞因子的细胞频率；②ELISPOT为单细胞水平检测，比ELISA和有限稀释法等更灵敏，20万～30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。因此ELISPOT最显著的优势是高灵敏度，细胞的分泌在其周围被直接捕获防止了被稀释、降解及被周边细胞受体结合的影响，并且通过测量单个细胞频率和细胞因子的分泌情况可确定免疫反应克隆增殖的程度和特异性T细胞的效应类别。
（卢仁泉 郑岚 郑慧）