第二节　蛋白酪氨酸激酶抑制剂

免疫细胞的活化是一系列信号蛋白相继磷酸化的结果，蛋白质分子上能够发生磷酸化的位点有两种，即酪氨酸和丝/苏氨酸。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是一类专一性催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶，在淋巴细胞活化的信号转导过程中发挥关键作用，分为受体型PTK和非受体型PTK。参与淋巴细胞激活的PTK有Src家族、Syk家族、Tec家族和JAK家族等，用特异性或非特异性阻断剂抑制上述PTK的活性，能够抑制淋巴细胞的活化和增殖，抑制机体免疫应答和炎性反应。目前已有多种PTK抑制剂用于免疫相关性疾病和淋巴细胞白血病的治疗。

一、Src家族激酶抑制剂

（一）Lck和Fyn抑制剂

哺乳动物细胞Src家族有8个成员：Src、Fyn、Yes、Lyn、Hck、Fgr、Lck和Blk，其激酶活性结构域为位于C端的SH1结构，在SH1的N侧依次有SH2、SH3和SH4结构域。Src家族中，除Src和Yes外，其余成员都参与淋巴细胞、单核细胞或粒细胞的信号转导。

在免疫应答过程中，T细胞的活化最初是由TCR/CD3介导的第一信号引发的，TCR发生交联聚集后，最先活化的PTK是Src激酶家族中的成员Lck和Fyn。作为T细胞活化信号传导通路顶端的成员，Lck和Fyn无疑对于免疫应答的启动是至关重要的，同时也为免疫调节药物及免疫系统肿瘤的治疗提供了很好的靶点。

糖皮质激素是一种广泛应用的免疫抑制剂，在自身免疫性疾病的治疗中发挥重要作用。它可显著抑制T细胞活化，抑制促炎性细胞因子如IL-2的分泌，但是其作用与抑制机制尚未完全阐明。Harr MW等最近研究发现，地塞米松能够抑制Lck Tyr-349位点的自身磷酸化，抑制Lck的激酶活性。此外，地塞米松还可下调Fyn的mRNA和蛋白表达水平。一般情况下，T细胞受到TCR信号刺激后，Lck和Fyn发生自身磷酸化，并活化下游的信号分子，激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）-γ。PLC-γ催化产生IP3，IP3与内质网上相应受体结合，促进钙库中钙的释放。地塞米松可通过抑制Lck的自身磷酸化，抑制T细胞活化过程中的钙信号，从而发挥免疫抑制活性。IP3触发T细胞内的钙信号，是通过Ⅰ型IP3受体（IP3 receptorⅠ，IP3RI）实现的，Src家族激酶Lck和Fyn均可与IP3RI相互作用，促进IP3RI的活化。研究证实，Lck与IP3RI的1932～2216氨基酸残基的片段相互作用，而Fyn可促进IP3RI的Tyr353磷酸化。地塞米松可通过抑制Lck活性，降低IP3RI的表达水平，同时通过下调Fyn的表达，抑制IP3RI的Tyr353磷酸化，从而减弱活化T细胞的钙信号，抑制IL-2的产生。

Takayama T等最近报道的一个小分子抑制剂TKM0150（图1-1A），可特异性抑制Src家族激酶的活性，其中对Lck的抑制活性最强（IC50=0.7nM），对Csk激酶抑制活性稍差（IC50=1.7nM），对Fyn和Lyn的抑制作用较弱，对非Src家族的激酶无抑制功能。体外药效学实验显示，TKM0150可显著抑制小鼠混合淋巴细胞反应，低剂量的TKM0150药效低于他克莫司（tacrolimus，FK506），其IC50约为他克莫司的10倍，但是在10nM剂量下，TKM0150与他克莫司的免疫抑制活性相当。体内试验表明，TKM0150可明显抑制2，4，6-三硝基氯苯引起的小鼠接触性超敏反应。

除小分子化合物外，有些肽类化合物也可发挥Src家族激酶抑制活性。Harr MW等研究证实，Lck激酶与IP3RI的作用位点位于IP3RI第5结构域的1932～2216氨基酸残基片段内，通过二级结构预测软件GORIV的计算及预测，Harr MW等锁定了一个包含21个氨基酸残基的片段（2078～2098），氨基酸序列为：KKRMDLVLELKNNASKLLLAI。该片段可形成一个α螺旋，起始的两个赖氨酸可能是与Lck蛋白相互作用的关键位点（图1-1B）。实验证实，该多肽可抑制Lck和IP3RI的结合，阻断T细胞经TCR途径活化时的钙信号。

（二）Lyn抑制剂

B细胞经BCR途径激活的过程与TCR相似，BCR聚集后最先活化的PTK也是Src的家族成员，包括Lck、Fyn、Blk和Lyn，其中最重要的是Lyn。Lyn活化后可通过下游的Syk及Btk等激酶激活多条信号转导通路如PLCγ途径、PI3K途径及MAPK途径。此外，Lyn在多种肿瘤，尤其是血液系统肿瘤的发生发展过程中也发挥重要作用。寻找Lyn激酶抑制剂，应首先了解Lyn激酶的晶体结构。Williams NK等研究发现，Lyn由501个氨基酸构成，其中239～501区域具有典型的Src激酶的结构特征。N末端（239～326）包括5条反向折叠的β片层和一个α螺旋，命名为αC螺旋。C末端（327～501）主要由螺旋构成，也包括两条反向折叠的β片层。N末端和C末端的两个裂片之间是一个凹陷区，该区域包括Lyn的激活位点和催化结构域以及铰链结构（图1-2A）。Lyn可与传统的Src激酶抑制剂结合，两者结合部位就在凹陷区内，如Lyn和dasatinib的结合（图1-2B、C）。上述研究揭示了Lyn与Src激酶抑制剂结合的结构特征，为特异性Lyn抑制剂的开发提供了重要的参考。

二、Syk家族激酶抑制剂

（一）ZAP-70抑制剂

Syk家族有Syk和ZAP-70两个成员，两者结构相似，在N端有两个SH2结构域，C端有一个SH1激酶结构域。两个SH2结构域可以与多种胞浆内免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM）结合，介导多种细胞内活化信号。在参与T细胞TCR信号转导的Syk家族成员中ZAP-70起着关键作用。当TCR/CD3胞浆区的ITAM被Src家族激酶磷酸化后，ZAP-70分子通过N端两个串联的SH2结构域与ITAM中的两个磷酸化酪氨酸残基结合。随后ZAP-70多个部位发生酪氨酸磷酸化，并使自身活化。ZAP-70活化是T细胞经TCR途径活化的重要环节，ZAP-70分子缺陷的小鼠T细胞发育受到影响，外周T淋巴细胞数量减少，细胞免疫严重缺陷。2008—2009年，日本Kissei Pharmaceutical公司的Hirabayashi A等报道了多种ZAP-70特异性抑制剂，其中化合物10d和11能够在体外抑制外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和全血的IL-2分泌（图1-3A、B）。

尽管这两种化合物的Syk抑制活性均很强，但因其水溶性差使口服给药的治疗效果不理想，在小鼠体内实验研究证实其抑制IL-2的分泌效果不佳，究其原因可能是化合物10d和11极性表面积过高有关。随后该公司将药物核心的1，2，4-三唑[4，3-c]嘧啶换为咪唑并[1，2-c]嘧啶，合成的化合物9f，具有很好的口服利用度，能够抑制小鼠被动皮肤过敏反应及ConA引起的IL-12分泌（图1-3C）。在此基础上，该公司又合成了一系列咪唑并[1，2-c]嘧啶-8-氨基甲酰衍生物，并得到了能够显著抑制ZAP-70激酶的化合物26和27（图1-3D）。

（二）Syk抑制剂

Sanam R等通过对110个已知具有ZAP-70抑制活性的化合物研究发现，最佳的ZAP-70抑制剂具有4个明显的结构特征：①具有一个氢键受体；②具有一个氢键供体；③具有一个疏水的脂肪族结构；④具有一个疏水的芳香族结构。利用该特征，Sanam R等从数据库中筛选出了358个可能与ZAP-70具有高亲和活性的分子，目前正在进行分子结合分析和进一步的筛选。在Syk家族成员中参与B细胞BCR信号转导的是Syk激酶，Syk激酶与磷酸化的BCR胞浆区ITAM基序结合，在BCR信号转导过程中发挥重要作用。此外，Syk对于免疫球蛋白Fc受体介导的信号传导及肥大细胞激活也具有重要意义。自身免疫性疾病的发生与体内抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）对自身抗原的识别与递呈密切相关。在体内，自身抗原可被B细胞通过BCR识别，也可与自身抗体生成免疫复合物，通过抗体Fc段与FcR的作用被APC识别。Syk在两种识别方式中均发挥重要作用，因此Syk家族激酶抑制剂是目前免疫抑制剂开发的热点，其中美国Regil公司的小分子嘧啶-5-咪唑羧酰胺衍生物类Syk激酶抑制剂R788是该领域内的代表产品（图1-4A）。

R788又称Fostamatinib或OSKIRA（Oral Syk Inhibition in Rheumatoid Arthritis），是其活性分子R406的前体化合物（图1-4B），即在R406吡啶并嗪酮异二环的一个N原子上面引入磷酸根，提高了其口服生物利用度。R406能够和ATP竞争Syk激酶位于激酶结构域（356～635氨基酸残基）的结合位点，其氨基嘧啶环上的N1和连接处的N2可与Syk铰链区的Ala451残基形成氢键，部分氨基嘧啶环还可与Glu449残基的羰基形成芳香环—CH—O键，这样确保了R406于Syk激酶的连接，三甲氧化苯环可与铰链区的Gly454和Pro455及甘氨酸富集环中的Leu377结合形成吡啶并嗪酮异二环（heterobicyclic ring），通过氢键与疏水力与甘氨酸富集环中的Phe382、Asp512和Asn499发生作用，加强了R406与Syk激酶之间的联系，从而抑制Syk激酶的活性（图1-4C）。

近年来，多项研究已经证实了R788和R406的免疫抑制活性。Colonna L等发现R406在体外可显著抑制BCR和FcγR介导的B细胞和DC细胞的活化及抗原呈递，R788在体内可改善自身免疫性糖尿病小鼠的病情。对DC而言，R788可降低小鼠DC的数量，抑制DC对胰岛素特异性CD8+T细胞的激活作用。对B细胞而言，R788可降低小鼠体内B细胞的数量，降低免疫球蛋白浓度，并可增加小鼠体内分泌IL-10的B细胞数量，产生一群具有免疫调节活性的致耐受B细胞。Smith J等证实R788可明显改善自身免疫性肾小球肾炎大鼠模型的症状，抑制肾小球内巨噬细胞和CD8+T细胞浸润，降低肾脏MCP-1和IL-1β水平。在体外R406可抑制系膜细胞和巨噬细胞分泌MCP-1。另有研究表明R788可显著抑制系统性红斑狼疮模型小鼠的病情进展，减轻其皮肤和肾脏损伤。一项为期三个月的随机对照Ⅱ期临床试验发现，R788与安慰剂对照对改善类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的症状无明显差别。另外一项为期6个月的457例患者入组的Ⅱ期临床试验证实R788对改善RA患者病情具有显著作用。目前该药已进入治疗RA的Ⅲ期临床研究阶段。

三、JAK3激酶抑制剂

JAK-STAT途径是常见的细胞因子受体信号传导途径之一。JAK激酶家族有4个成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，其中JAK1、JAK2和TYK2分布广泛，JAK3只表达于淋巴样和髓样细胞中。JAK激酶在细胞因子受体介导的信号传导中起着重要的作用，大多数细胞因子受体主要通过JAK激酶向细胞内传递细胞因子携带的信息。每种JAK可被多种细胞因子受体激活，一种细胞因子受体也可以激活多种JAK激酶，但是JAK3与众不同，它主要存在于白细胞中，只能被含有IL-2受体γ链（γc）的一类细胞因子受体激活，如IL-2、IL-4、IL-7等，而这类细胞因子对于T、B细胞的发育及活化是至关重要的。JAK3基因缺陷的人和小鼠表现为T、B淋巴细胞发育严重受损，TCR信号传导阻滞，T细胞不能产生IL-2等，可见JAK3是一个免疫抑制剂开发的潜在靶点。目前已有多种JAK3抑制剂被开发出来，它们多用于移植排斥反应和自身免疫性炎症（如银屑病、溃疡性结肠炎、RA、糖尿病等）的治疗性研究，有的已经进入Ⅲ期临床试验阶段。

美国辉瑞公司意识到，JAK3抑制剂作为免疫抑制剂的应用前景广阔，利用JAK3催化结构域与GST的融合蛋白，对其公司的化合物库中近40万种化合物进行了初步筛选，得到了具有一定JAK3抑制活性的化合物2a，又称CP-352664，结构如图1-5A。接下来该公司利用IL-2刺激的T细胞增殖为研究平台，在细胞水平筛选能够抑制该反应的JAK3抑制剂。化合物2a抑制JAK3的IC50为210nM，但是该化合物细胞水平的活性很低（IC50=3200nM），同时稳定性差，人肝脏微粒体（human liver microsome，HLM）半衰期仅为14分钟。因此，该公司以化合物2a为基础，利用高速模拟的方法，对2a的类似物进行了构效研究，并得到了化合物6的一系列衍生物（图1-5B）。构效关系研究显示，环己烷环上2’C上的取代基不宜过大，甲基或乙基为宜，其中化合物6c的2’和5’的取代基均为甲基，其JAK3抑制活性最佳（IC50=20nM）。该系列化合物的HLM半衰期都低于20分钟，预示其代谢稳定性差。公司根据化合物6c的结构，以香芹酮为前体，合成了化合物11和12（图1-5C、D），其中12为11的顺反异构体。化合物11和12具有非常高的JAK抑制活性（IC50分别为4nM和2nM）和细胞增殖抑制活性（IC50分别为90nM和50nM），但是由于较强的疏水性，两者的HLM半衰期很短。接下来，公司又将目光锁定了与化合物12相似的哌啶衍生物，并合成了化合物18m（图1-5E）。18m的生物活性与化合物11及12相当（JAK3 IC50=3.3nM，IL-2 blast IC50=40），但其极性侧链增加了它的代谢稳定性（HLM半衰期>100分钟）。最终，该公司在18m的基础上合成了化合物1和1a，其中1a是1的对映体，如图1-5F、G。化合物1的出现将抑制JAK3和T细胞增殖的IC50提高到1nM和11nM，是所有化合物中活性最高的一个，同时具有较高的代谢稳定性，猴的肝脏微粒体半衰期大于100分钟。作为化合物1的对映体1a的JAK抑制活性却很低（JAK3 IC50=43nM，IL-2 blast IC50=580），且不具备开发价值。

化合物1已成为辉瑞公司重点研发的JAK抑制剂，命名为CP-690550（图1-6A）。经过多种自身免疫性疾病和抑制排斥反应动物模型检测，证实了该化合物的免疫抑制活性。Chrencik JE等研究发现，CP-690550与JAK3的ATP结合槽形态互补并能与之结合。CP-690550的哌啶环位于JAK3结合槽的疏水环境中，通过疏水作用与Met902、Val836、Cys909、Leu956和Ala966发生联系。哌啶环上的C7甲基基团位于JAK3结合槽底部的口袋中。末端的氰基基团被富含甘氨酸的环包裹，并与该环主链原子（Gly831、Gly834、Ser835和Val836）产生极性作用（图1-6B）。CP-690550能够抑制IL-2引起的人T淋巴细胞增殖，抑制CD4+CD25-效应T细胞活化及其IFN-γ的分泌，同时CP-690550还能保存调节性T细胞的免疫抑制活性。近年来CP-690550已经用于多种疾病模型的治疗，包括大鼠AA模型，小鼠急性移植物抗宿主反应（acute graft-versus-host disease GVHD）、移植排斥反应等，均取得乐观的疗效。Ⅱ期临床试验结果显示，CP-690550对RA的疗效显著，目前该药已经进入治疗RA的Ⅲ期临床研究。

Kim BH等通过给予细胞的高通量筛选和基于结构预测的虚拟筛选，分别得到两个JAK3抑制剂：MS1020（图1-5H）和NSC114792（图1-5I），两者均可与JAK3特异性结合，抑制JAK3的激酶活性，抑制IL-2介导的JAK3/STAT5信号传导通路。

四、Tec家族激酶抑制剂

（一）Btk抑制剂

Tec激酶家族是近年来研究广泛的胞浆内蛋白酪氨酸激酶分子，有5个家族成员：Btk、Tec、Itk、Bmx和Txk，其结构具有高度同源性，都有一个富含脯氨酸的Tec同源（Tec homology，TH）结构域和一个PH结构域（Txk除外），在TH结构域内，从C端依次有SH3、SH2和SH1结构域。Tec家族成员中，与免疫细胞关系最密切的为Btk激酶和Itk激酶。

Bruton tyrosine kinase（Btk）主要表达于浆细胞以前各个发育阶段的B细胞，也见于髓样细胞、肥大细胞等。Btk参与多种细胞膜分子的信号转导，包括BCR、FcεR1、IL-5R、IL-6R等，与B细胞的成熟与活化密切相关。Btk基因突变可导致性关联无丙球蛋白血症，表现为B细胞发育缺陷和严重的体液免疫障碍。B细胞经BCR途径活化过程中，Btk被上游的Src家族激酶如Lyn和Fyn激活，Tyr-551发生磷酸化，同时SH3结构域内Tyr-223自身磷酸化，进而激活Btk下有的信号分子，如PLC-γ和MAPK可导致胞浆内钙浓度升高和转录因子激活。此外，Btk还可通过激活vav和WASp（Wiskott-Aldrich syndrome protein）调节B细胞肌动蛋白细胞骨架的运动，促进抗原在B细胞内的转运。因此，Btk特异性抑制剂将有助于抑制B细胞活化，抑制机体的体液免疫应答，对自身免疫性疾病可能具有疗效。

Pan Z等筛选得到了具有Btk抑制活性的化合物1（图1-7A），但该化合物的特异性较差，对Src家族的激酶也具有抑制活性。经过对化合物1的修饰，Pan Z最终得到了化合物4（图1-7B）。该化合物能显著抑制Btk活性，降低Btk底物PLC-γ的磷酸化。不仅如此，化合物4（后被命名为PCI-32765）对Lyn和Syk依赖的Btk Tyr-551磷酸化仅有微弱的抑制作用，相当于Btk抑制活性的1/500，对于JuekatT细胞的Lck和Itk抑制活性也很弱，说明该化合物对Btk的抑制具有高度特异性。利用免疫共沉淀和荧光探针标记法，进一步证实了PCI-32765的上述特性。PCI-32765标记荧光集团后形成化合物PCI-33380，PCI-33380与表达Btk高的B细胞作用后可与Btk共沉淀。不表达Btk的JuekatT细胞与PCI-33380作用后，提取总蛋白进行电泳后，检测不到PCI-33380的荧光信号。体内试验研究表明，PCI-32765能够抑制CIA小鼠和SLE小鼠的病情进展，降低SLE小鼠自身抗体水平，改善组织损伤程度。PCI-32765还能抑制狗自发性B细胞非霍奇金淋巴瘤。

Di Paolo JA等最近也合成了Btk的小分子抑制剂CGI1746（图1-7C），CGI1746可与Btk结合，使Btk构象发生改变，造成Tyr-551不能被Lyn等上游激酶磷酸化，从而抑制Btk的活性。CGI1746能够抑制BCR介导的B细胞增殖，降低CIA小鼠体内自身抗体水平，抑制FcγRⅢ介导的巨噬细胞活化，抑制促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的产生，表明CGI1746有可能成为自身免疫性疾病治疗的新方法。

（二）Itk抑制剂

Itk（IL-2-inducible T cell kinase）也称Tsk或Emt，主要表达与T细胞和NK细胞。与其他Tec家族成员一样，Itk也包含一个PH结构域和一个TH结构域，其中TH结构域中存在SH3、SH2和SH1结构域。当T细胞活化时，PI3K催化产生的PI3P可与Itk的PH结构域结合，将Itk募集到TCR周围，Src家族的激酶Lck催化Itk SH1结构域（活化结构域）中Tyr-512磷酸化，这对于Itk的活化是至关重要的。活化的Itk可进一步促进肌动蛋白的组装和运动、PLC-γ的活化、钙离子的释放及转录因子NFAT的活化，最终导致Th2型细胞因子的分泌，促进体液免疫应答。

Lin TA等合成的Itk特异性抑制剂BMS-509744（图1-8A），可与Itk特异性结合，抑制Itk的活化。BMS-509744的氨噻唑基团可与Itk铰链区M438的NH及羰基生成氢键连接，与M438相邻的苯甲酰胺基团与氨噻唑基团处于相同的平面上，可以推测极性的噻唑基团硫原子与带阴性电荷的苯甲酰胺氧原子相互吸引，进一步稳定了BMS-509744与Itk的结合构象。BMS-509744的三甲基丙胺基基团暴露于BMS-509744与Itk的结合部位之外，与BMS-509744的核心区域垂直，指向Itk的N端。BMS-509744苯磺酰基团深埋于Itk激酶之中，处于侧链氨基酸K391和L489之间。通过羰基与苯磺酰基团连接的乙酰哌嗪与BMS-509744的苯甲酰胺噻唑平行，连接处的羰基和乙酰哌嗪上的羰基均可与Itk形成氢键连接，前者与K319上的碱性氨基相连，后者与Itk主链上的C422及侧链上的D455连接。BMS-509744的哌嗪环还可通过范德华力与C442的硫原子及S371的羰基相连（图1-8B）。BMS-509744可显著降低TCR介导的PLC-γ活化及钙动员，抑制IL-2的分泌，抑制T细胞的增殖。对卵白蛋白引起的小鼠哮喘模型具有治疗作用。

von Bonin A等最近利用高通量技术，化合物库中筛选得到了新的Itk抑制剂：化合物44。该化合物对Itk活性抑制的IC50为65nM，但对Btk及其他激酶的抑制活性较弱，具有较强的特异性。化合物44能够抑制T细胞的活化增殖，抑制IL-2和IFN-γ的分泌。在偏苯三酸2、4二硝基-1-氟苯和2，6-二硝基-1-氯苯诱导的小鼠皮肤炎症模型中，化合物44能抑制小鼠皮肤炎症反应，减轻皮肤损伤，表明该化合物在炎症的治疗方面具有一定的发展前景。

HIV对T细胞的感染及在T细胞内的复制，有赖于T细胞的活化状态。HIV外膜蛋白gp120能够介导T细胞Rac活化及肌动蛋白组装极化，这对于HIV进入T细胞是至关重要的。抑制T细胞活化虽然可抑制HIV的感染和复制，但是由此带来的免疫力低下同样不可忽视。找到一个既能影响T细胞活化，又不至于造成严重免疫力低下的作用靶点无疑会对HIV的治疗产生积极作用。尽管Itk在T细胞活化过程中发挥重要作用，但Itk缺陷的小鼠仍然能够启动对病毒延迟的免疫应答，而且Itk缺陷的小鼠与正常小鼠寿命相当，表明抑制Itk可能成为HIV治疗的靶点。Readinger JA等研究发现，Itk抑制剂BMS-509744通过抑制T细胞活化信号，抑制gp120引起的肌动蛋白极化，从而阻断HIV的感染，表明该药有可能应用于HIV的辅助治疗。

在T细胞信号转导通路中，Itk的激活除需要上游Src家族激酶之外，还需要接头蛋白LAT和SLP-76的辅助。LAT通过Itk的SH2结构域与Itk发生相互作用，而SLP-76与Itk的结合则需要SH2和SH3结构域。有研究表明，Itk的SH3结构域与SLP-76中富含脯氨酸的PR（proline-rich）结构域的结合，对于Itk活化是至关重要的。Grasis JA等根据SLP-76的PR结构域合成了竞争性多肽抑制剂，该多肽可与Itk的SH3区域结合，干扰Itk与SLP-76的相互作用。为了增加多肽的跨膜通透性，Grasis JA又在其N末端增加了9个精氨酸，最终得到了R9-QQP：RRRRRRRRRQQPPVPPQRPMA。实验证实，R9-QQP可阻断Itk与SLP-76的结合，抑制TCR信号介导的Itk活化，抑制肌动蛋白极化及免疫突触的形成，抑制Th2型细胞因子的分泌。