第四章　干细胞和肿瘤干细胞的微环境

第一节　干细胞的概念与功能

一、干细胞微环境的概念

干细胞是一类具有广泛增殖能力和多向分化潜能的细胞，其重要特征之一是能够进行不对称分裂。即一个干细胞分裂为两个子代细胞，其中一个保持了母细胞的特性仍为干细胞，而另一个开始向成熟的细胞分化。

干细胞进行不对称分裂有两种方式，一种是相同的环境中，在有丝分裂的起始，细胞质进行不对称分布。分裂面是有方向的，两个子代细胞中只有一个能够接受到母细胞的决定簇，从而保持了干细胞的特性，而另一个则开始分化。结果产生两个不同的子代细胞；另一种方式是干细胞起初进行对称分裂，产生两个相同的子代细胞。其中一个仍处于原来的微环境中，而另一个则处于不同的微环境中。在不同的微环境中的不同细胞和外部信号的影响下，最终形成两个不同的子代细胞（图4-1）。因此，周围环境中的细胞和信号对于干细胞特征的维持、自我更新和分化起着重要的调控作用。

1978年科学家Schofield R.提出了干细胞微环境（stem cell niche）的概念。干细胞微环境是指干细胞周围的细胞和外部信号构成的特定的外部环境，这个环境维持着干细胞的特征、为干细胞的自我更新提供了合适的外部条件，并且抑制干细胞向成熟细胞分化。

二、干细胞微环境的结构和功能

人们最早进行系统的研究，并认识较为清楚的是果蝇卵巢和睾丸中的生殖系干细胞的微环境。随着研究的深入，人们开始逐步了解哺乳动物的干细胞微环境，包括哺乳动物造血干细胞微环境、肠上皮干细胞微环境、表皮干细胞微环境和神经干细胞微环境。下面分别介绍这几种干细胞的微环境。

在果蝇的卵巢或睾丸中，生殖干细胞周围的支持细胞共同构成了干细胞的微环境，为生殖干细胞提供了维持干细胞状态的微环境和自我更新的信号。当生殖干细胞分裂为两个子代细胞后，一个在干细胞微环境所提供的信号的影响下成为与母细胞完全相同的生殖干细胞，另一个则离开了干细胞微环境开始分化。

雌性果蝇的卵巢由大约15个卵巢管组成，每个卵巢管中有一个生发区，大多数生殖干细胞就存在于生发区的前端。在生殖干细胞周围是末端丝细胞、帽子细胞和内生发鞘细胞。生殖干细胞进行分裂，靠近末端丝细胞和帽子细胞的子代细胞保持了干细胞的特性，而远离帽子细胞的子代细胞开始分化为一个包囊母细胞。一个包囊母细胞经过4次不完全分裂，形成一个16个细胞的包囊，这16个细胞中只有位于包囊后端的一个细胞形成卵母细胞，其余15个细胞则形成滋养细胞，为卵母细胞的生长提供支持。生殖干细胞周围的末端丝细胞、帽子细胞和内生发鞘细胞决定着生殖干细胞的生物学行为，它们共同构成了果蝇卵巢中的生殖干细胞微环境（图4-2）。

帽子细胞是果蝇卵巢干细胞微环境中主要的支持细胞，它直接与生殖干细胞接触。生殖干细胞纺锤丝的一极必须准确地锚定在帽子细胞上，否则干细胞的不对称分裂无法正常进行。帽子细胞和内生发鞘细胞表达信号蛋白decapentaplegic（Dpp），Dpp信号可以抑制Bam基因的转录，使干细胞留在干细胞微环境中保持干细胞特性。Dpp的过量表达将导致生殖干细胞的数量增多。若Dpp表达降低导致Bam基因的转录增强，干细胞就会离开其微环境开始分化。Bam的表达是干细胞产生的两个子代细胞中分化细胞开始分化所必需的。此外，帽子细胞和末端丝细胞表达的Piwi蛋白对干细胞的维持也有重要的作用。

大约9个生殖干细胞位于雄性果蝇睾丸的顶端，形成一个圆环，每个生殖干细胞被两个囊组细胞包绕着，周围是一簇分裂后体细胞称为hub细胞（图4-3）。囊组细胞和生殖干细胞一样进行不对称分裂，产生一个新的囊组细胞和一个囊细胞。当生殖干细胞分裂时，一个子代细胞保持了干细胞特性，另一个离开了hub细胞成为成精原细胞开始分化。两个囊细胞包围一个成精原细胞，形成一个生殖系囊（germ line cyst）。两个囊细胞不再分裂，继续包围着生殖系克隆。成精原细胞经过4次分裂增殖成为16个相互连接的精原细胞。

Hub细胞是果蝇睾丸中生殖干细胞微环境的主要细胞成分，它分泌配体Unpaired（Upd），该配体通过激活JAK-STAT信号转导通路，诱导生殖干细胞进行自我更新。研究发现，在缺乏Upd的状态下生殖干细胞无法正常进行自我更新。JAK-STAT信号是雄性果蝇生殖干细胞进行自我更新所必需的。JAK由hopscotch基因编码，STAT由stat92E基因编码，丢失两者中任何一个均会导致生殖干细胞和早期分化细胞快速消失。

在雌性果蝇生殖干细胞和帽子细胞之间以及雄性果蝇生殖干细胞和Hub细胞之间存在黏附连接，免疫荧光分析揭示在雌性生殖干细胞和帽子细胞之间以及雄性生殖干细胞和Hub细胞之间高度集中着DE-钙粘蛋白以及和β-联环蛋白同源的Arm蛋白。这种黏附连接是干细胞保留在小境中维持干细胞特性所必需的。细胞外基质除了通过影响信号的聚集外，也可通过影响上述黏附机制调控干细胞的行为。

造血干细胞最早发源于胚胎发育中的卵黄囊，在卵黄囊中原位造血，继而经血流种植到肝脏和脾脏，引起肝脾造血。胎儿出生后，造血干细胞全部转移至骨髓，引起骨髓造血，并维持终生。造血干细胞和其他干细胞一样可以通过不对称分裂进行自我更新，并具有分化为各种血细胞的潜能。

造血干细胞大多位于长骨小梁区骨髓腔的骨内膜内侧，而分化的造血细胞主要位于骨髓的中心地区。位于骨内膜内侧的造血干细胞周围的细胞之间的相互作用共同构成了造血干细胞的微环境。

研究发现，在体外培养小鼠和人的成骨细胞，这些成骨细胞分泌大量的能够促进造血细胞增殖的细胞因子；而在体外对骨髓、成骨细胞和一些基质细胞进行培养，骨髓表现出骨形成活性。此外还有大量研究证实，成骨细胞数量增加将导致局部造血干细胞数量随之增加。以上研究和发现都说明成骨细胞与造血干细胞有着紧密的联系。随着对造血干细胞微环境研究的不断深入，人们对于造血干细胞微环境的成分，结构和功能有了初步的认识。

成骨细胞是造血干细胞微环境中最重要的组成成分，它不仅调节着造血干细胞的功能、空间和活性，还参与造血干细胞的维持以及自我更新和分化的调控。其他细胞如破骨细胞、间质成纤维细胞和内皮细胞也是微环境的细胞成分，它们与成骨细胞一起构成了造血干细胞的微环境。

在稳态状态下，造血干细胞并不是频繁地进行分裂，它能够维持数周甚至数月的静止期。大量的处于G₀期的静止造血干细胞储存在骨内膜附近的造血干细胞微环境中。稳态下骨髓造血干细胞微环境可以看做是干细胞的储存池，它为静止的造血干细胞提供了维持干细胞未分化状态，抑制干细胞分化的微环境；也为长期造血干细胞提供了自我更新的微环境。由于这种模式在骨内膜附近，因此就称为骨内膜造血干细胞微环境。

稳态状态下，大部分造血干细胞在骨内膜造血干细胞微环境中，但也有一部分造血干细胞位于骨髓窦状内皮细胞附近。这些造血干细胞通常表达CD150（即CD150⁺ HSC）。骨髓窦状内皮细胞和其他组织内的血管内皮细胞是不同的。组织内的血管内皮细胞不具备维持干细胞的能力，但骨髓内的窦状内皮细胞具有维护造血干细胞的功能，为造血干细胞的自我更新提供了合适的微环境，这样骨髓内的窦状内皮细胞构成了骨髓造血干细胞微环境的另一种模式——骨髓血管造血干细胞微环境。

骨内膜造血干细胞微环境和骨髓血管造血干细胞微环境是骨髓内造血干细胞微环境的两种不同模式。目前认为，骨内膜造血干细胞微环境中主要是静止的造血干细胞，也有进行自我更新的造血干细胞。血管造血干细胞微环境中主要是长期进行自我更新的造血干细胞，而没有静止状态的造血干细胞。因此，可以认为骨内膜造血干细胞微环境的主要作用是作为干细胞的储存池，而血管造血干细胞微环境的主要作用是干细胞进行自我更新即造血。

CD150⁺ HSC贴附于骨髓血窦内皮细胞，这使它们随时可以检测到血液系统的变化。当组织受到损伤或患者接受化疗等引起骨髓抑制时，CD150⁺HSC感受到血液系统的变化。骨内膜微环境中的静止状态的造血干细胞在内皮细胞表达的趋化因子CXCL12和一些黏附分子的影响下离开骨内膜微环境向骨髓中心的血窦迁移，进入血管造血干细胞微环境。静止状态的造血干细胞结束静止状态，离开骨内膜微环境向血管造血干细胞微环境迁移的过程称为造血干细胞的动员（mobilization）。

经过动员进入血管干细胞微环境的造血干细胞不再处于静止状态，而开始自我更新，通过不对称分裂产生多能造血祖细胞（multipotential progenitors，MPP）。多能造血干细胞（MPP）可以进一步分化，并最终分化为各种血细胞如红细胞、白细胞、淋巴细胞、巨核细胞及粒细胞等。

当遇到严重的损伤或骨髓抑制时，血管干细胞微环境中的造血干细胞也可以进行对称分裂，产生两个相同的造血干细胞，使造血干细胞数量迅速增加。被动员的造血干细胞可以从骨髓束中溢出进入微血管，经过血液循环抵达脾和肝。在脾和肝中造血干细胞进行自我更新产生血细胞，这就是脾和肝能够进行骨髓外造血的机制。造血干细胞寄宿在脾和肝的窦管内皮附近，经免疫组织化学分析，2/3经动员的CD150⁺造血干细胞与脾窦管内皮细胞相接触。这说明在脾和肝中也存在血管造血干细胞微环境。但肝脏与脾内的血管造血干细胞微环境与骨髓内的血管造血干细胞细微环境是否在结构和功能上完全相同，还尚不清楚（图 4-5）。

趋化因子CXCL12对于造血干细胞的维持、动员和迁移都非常重要。成骨细胞和血管内皮细胞表达CXCL12，当由于射线、化疗药物或缺氧等原因引起造血细胞减少时，上述细胞就表达和分泌CXCL12，HSC开始动员并朝着CXCL12的方向迁移。

处于血液循环中的造血干细胞可返回骨髓微血管，并从微血管的内皮间隙迁移入骨髓束，最终寄宿在骨髓的造血干细胞微环境中。上述过程称为造血干细胞的归巢。临床上应用造血干细胞移植治疗血液疾病或化疗后的重度骨髓抑制，移植入体内的造血干细胞按上述过程归巢进入骨髓的造血干细胞微环境。β₁整联蛋白在造血干细胞的归巢过程中发挥着重要作用。缺乏β₁整联蛋白将导致造血干细胞归巢障碍。

表皮干细胞由胚胎干细胞分化而来，是皮肤组织中的专能干细胞。表皮干细胞有3个典型的特点：体内慢周期性、很强的自我更新能力和对皮肤基底膜的黏附。慢周期性在活体细胞表现为标记滞留，这类标记滞留细胞在体内分裂很慢，以保证其巨大的增殖潜能和减少DNA复制时出错的概率。干细胞的自我更新能力表现为在离体培养时细胞呈克隆性生长，如连续传代培养，细胞可进行140次分裂，即能产生1×10⁴⁰个子代细胞。干细胞对基底膜的黏附是干细胞维持其特性的基本条件。干细胞对基底膜的脱黏附是诱导干细胞脱离干细胞群落，进入分化周期的重要调控机制之一。

表皮干细胞经过不对称分裂，产生的子代细胞可分化为各种类型的表皮细胞和毛囊的各种组分。表皮干细胞位于毛囊的隆突和表皮的基底层。毛囊的隆突和表皮的基底层的特定空间结构以及细胞间的相互作用为表皮干细胞特性的维持和自我更新提供了合适的外部环境，这个处于毛囊隆突和表皮基底层的微环境就是表皮干细胞的微环境。

表皮干细胞微环境主要通过信号分子实现对表皮干细胞行为的调控。微环境中的细胞高度表达β₁整合蛋白，β₁整合蛋白对于表皮干细胞分化出表皮组织至关重要。将β₁整合素缺失的小鼠胚胎干细胞与表达野生型β₁整合素的细胞相比，发现野生型干细胞能分化出完整的表皮细胞谱系，而β₁整合素缺失的干细胞则不能产生分化的细胞。Wnt信号转导通路在表皮干细胞形成毛囊的过程中具有重要作用，体外实验证明，特异性的Wnt可维持生长初期毛发基因的表达，并在体外培养器官中诱导毛发的生长。

肠上皮在绒毛根部下陷至固有层而形成肠隐窝（图4-8A），肠道干细胞就位于肠隐窝的底部。如果将隐窝底部最底层的细胞作为第1层，肠干细胞大约在隐窝底部的第4层。一般每个肠隐窝底部有4～6个干细胞，干细胞产生短暂增殖细胞，短暂增殖细胞不断向隐窝顶部迁移，当迁移出增殖区后才能够开始分化（图4-8B），最终分化形成不同的肠黏膜细胞，包括柱状上皮细胞和产生黏液的杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞。

在肠隐窝的干细胞周围有肌成纤维细胞、Paneth细胞和间充质细胞，其中肌成纤维细胞分泌的因子有助于干细胞的维持和更新，内皮细胞为肠干细胞提供生存因子如表皮生长因子。隐窝底部还分布着许多表达的分子和信号，如Tcf4、EphB、Noggin、Wnt等，其中Tcf4对干细胞的维持至关重要，EphB的B亚族相互作用能调控肠上皮干细胞微环境的重新分布。Wnt信号参与调控肠上皮细胞的增殖和分化，在人体中Wnt信号增强有可能导致结肠癌的发生。

肠隐窝的干细胞周围有肌成纤维细胞、Paneth细胞和间充质细胞，以及隐窝底部的分子和信号共同组成了肠干细胞的微环境。

曾经有观点认为哺乳动物中枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞，缺乏再生能力。但1992年Reynolds和Richards从小鼠纹状体和海马中分离得到神经干细胞，随后人们又相继从其他哺乳动物体中发现了神经干细胞。从此，神经干细胞的存在成为共识。

哺乳动物脑内存在两个能终身产生神经元的区域：侧脑室的室管膜下带（subventricular zone，SVZ）和海马的颗粒下带（subgranular zone，SGZ）。SVZ有4种主要的细胞：成神经细胞、SVZ星形胶质细胞、未成熟前体细胞和室管膜细胞。室管膜细胞排列成一层，将SVZ和侧脑室分隔开（图4-9）。SVZ星形胶质细胞可以看作是SVZ微环境中的干细胞，它表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。SVZ星形胶质细胞（GFAP⁺）分裂产生短暂增殖未成熟的前体细胞（GFAP^-、Dlx2⁺），短暂增殖未成熟的前体细胞又进一步分裂产生成神经细胞（GFAP^-、Dlx2⁺、PSA-NCAM⁺）。血管内皮细胞延伸出基膜进入SVZ，终止于室管膜细胞附近。这种从血管延伸出的基膜与SVZ内的各种细胞都有联系，它与室管膜细胞是SVZ微环境的主要成分。

颗粒下带（SGZ）是位于海马的齿状回和齿状回门之间的生发层，产生颗粒状神经元。在SGZ中神经元产生发生在一些与血管密切联系的局灶中。局灶中含有SGZ星形胶质细胞，SGZ星形胶质细胞紧邻着血管（图4-10）。SGZ星形胶质细胞分裂产生幼稚的D细胞，幼稚的D细胞已经开始分化，表达神经元分化的分子标志PSA-NCAM。已分化的幼稚的D细胞再进一步分化为颗粒神经元。

表皮生长因子（EGF）和成纤维生长因子（FGF）可以刺激神经干细胞扩增。表皮生长因子的效应细胞不是微环境中的神经干细胞，而是短暂增殖C细胞（transit-amplifying C cell），它可以促进短暂增殖C细胞快速分裂并沿着血管迁移。成纤维生长因子的效应细胞是微环境中相对静止的神经干细胞即星形胶质细胞。其他的一些生长因子如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子也可促进微环境中的神经干细胞产生神经元。

以上介绍的几种干细胞微环境可以看出：干细胞微环境由微环境内的细胞、黏附分子、信号分子和细胞外基质组成。微环境支持干细胞，但是在不同的组织中有不同的成分、性质和位置。干细胞必须在相应的微环境中才能够维持和进行自我更新。干细胞与微环境细胞有着紧密的联系，微环境细胞通过黏附和分泌的信号分子影响干细胞的行为，而干细胞也可以影响微环境中周围细胞的行为。研究发现，干细胞分泌一些因子并不作用于自身，而是作用于周围的细胞。

干细胞微环境的功能可概括为以下几个方面：①维持干细胞的特性，抑制干细胞分化使干细胞处于未分化状态；②储存静止的干细胞，当机体需要时，这些储存在微环境中的静止的干细胞可以进行动员，满足机体的需要；③促使干细胞进行自我更新；④控制干细胞的数量，调节干细胞的不对称分化。

三、干细胞微环境与肿瘤

肿瘤组织中存在极少量的具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的肿瘤干细胞，正是这些肿瘤干细胞促使了肿瘤的发生和发展。与正常干细胞相同，肿瘤干细胞也需要微环境来维持干细胞的生长和自我更新等功能。目前的研究认为肿瘤干细胞的形成和微环境之间存在着密切的关系。肿瘤干细胞的形成在一定程度上可能使微环境发生异常的改变。最近，R.Dickson实验室报道乳腺干细胞niche的反常导致TNFα的反常表达，结果造成乳腺癌的发展，这似乎支持我们的假设。目前认为肿瘤干细胞的产生可能有两种途径：一种是由于干细胞微环境的变化或基因突变使正常干细胞转变为肿瘤干细胞；另一种是干细胞产生的快速增殖的前体细胞发生基因突变，使其继续保持快速增殖而不进入分化成熟的状态。更多的基因突变使这些仅部分分化而保持快速增殖的前体细胞逆分化为肿瘤干细胞。无论哪种途径导致肿瘤干细胞的产生都与干细胞的微环境关系密切。

微环境中的各种信号调控着干细胞的生物学行为，在正常组织中，微环境提供信号使正常干细胞自我更新，并促使快速增殖的前体细胞进行有限次数的分裂，并且随着每一次细胞分裂，这些子细胞的增殖能力下降而分化程度增加（图4-11A）。当信号产生异常使干细胞行为异常时可导致正常干细胞转化为肿瘤干细胞。例如：骨形成蛋白（BMP）为微环境中的干细胞提供抑制生长的信号。选择性灭活小鼠体内的BMP受体可导致毛囊肿瘤、肠息肉和造血干细胞数量增加。Wnt为微环境中的干细胞提供促进生长的信号，当Wnt与其受体Frizzled结合后，Wnt信号途径被激活。若Wnt信号被异常激活，可导致毛囊肿瘤、肠腺瘤性息肉和骨髓白血病。微环境中BMP 的生长抑制信号和Wnt的促进生长信号共同调控着干细胞的增殖。一旦平衡被破坏，就可能导致干细胞增殖失控从而转变为肿瘤干细胞，并启动了肿瘤的发生。

除了微环境中的信号异常外，基因突变也是导致正常干细胞转变为肿瘤干细胞的重要原因。例如某些基因突变导致干细胞依赖于微环境调控的自我更新机制障碍，使干细胞的自我更新和扩增失去了微环境的约束，导致干细胞转变为肿瘤干细胞。

起源于正常干细胞的肿瘤干细胞可以分泌一些因子，募集微环境细胞到肿瘤中来，结果导致干细胞微环境的扩张。肿瘤干细胞也随着干细胞微环境的扩张而扩增（图4-11B）。在肿瘤干细胞或微环境的影响下，微环境中的细胞也进行扩增并发生一些基因的变异。肿瘤干细胞把已经变异的微环境细胞募集在自己周围，形成新的微环境。新的微环境为肿瘤干细胞提供自我更新的信号，肿瘤干细胞也很快适应了新的微环境，在新的微环境中进行自我更新并产生分化的肿瘤细胞（图4-11C）。部分肿瘤干细胞还可以发展成为不依赖于微环境而自发进行自我更新的肿瘤干细胞（图4-11D）。上述过程很可能是肿瘤侵袭周围组织，或远处形成转移瘤的重要机制之一。

基因突变也可发生在短暂增殖的前体细胞（干细胞的后代细胞），这些短暂增殖细胞属于部分分化细胞。基因突变使这些部分分化的短暂增殖细胞不再继续分化为成熟细胞，但却保留了快速增殖的能力。大量的快速增殖的未成熟细胞形成一个细胞池，在这个细胞池中发生的一些分子或基因事件使快速增殖的部分分化细胞逆分化为肿瘤干细胞（图4-11E）。

已经离开干细胞微环境部分分化了的子代细胞有可能回到微环境，在微环境的作用下，重新返回干细胞状态，这一过程称为逆分化。在已分化细胞逆分化重新返回干细胞状态的过程中，若微环境发生异常或细胞基因发生突变，也会导致肿瘤干细胞的产生。

正常干细胞的迁移和动员与肿瘤的侵袭和转移的分子机制有些相似。一些因子在正常干细胞动员的过程以及肿瘤细胞侵袭转移的过程中都是必需的。例如：前面提到的造血干细胞的活化和动员需要基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水解细胞外基质成分。基质金属蛋白酶-9还可使干细胞因子从膜锚定状态转变为游离状态，游离状态的干细胞因子促使微环境中造血干细胞活化和动员。而基质金属蛋白酶家族也是恶性肿瘤侵袭和转移过程中的关键分子。此外，造血干细胞和神经干细胞的迁移需要整联蛋白，而整联蛋白也参与肿瘤的侵袭和转移。前面提到的趋化因子CXCL12及其特异性受体CXCR4在干细胞的动员中发挥着至关重要的作用，研究发现CXCL12与乳腺癌细胞的迁移也密切相关。因此，干细胞动员与肿瘤细胞侵袭和转移在理论上可能有一定的联系。

同正常干细胞相同，肿瘤干细胞虽然他们本身处于一个低分化的状态，但似乎同样依赖于其微环境，即肿瘤干细胞微环境，来保持他们独有的自我更新能力并引起更多的分化型祖细胞，此外，肿瘤干细胞微环境同时有一个保护的作用。为CSC提供隔离遗传毒性损害的庇护场所，同时肿瘤干细胞微环境可以增强治疗的抵抗。

肿瘤干细胞微环境在肿瘤发生各个步骤中发挥重要作用。在原发肿瘤中，肿瘤干细胞微环境调节肿瘤stemness（干性）。他们之间的相互作用可以通过失去niche之后主要导致失去CSCs的事实来证实。为了维持CSC池并且支持初级肿瘤的生长，niche通过与EMT的联系在非肿瘤细胞转变为肿瘤干细胞的过程中发挥重要作用，导致肿瘤的侵袭和播散。总之，微环境在肿瘤生成和前进的过程中以及转移过程中意义重大，肿瘤干细胞微环境已经成为新兴的靶点。