第五章 microRNAs和肿瘤干细胞
第一节 microRNA概述
microRNA（miRNA）是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约20～24nt（少数小于20nt），由一段具有发卡环结构的长度为70～80nt的单链RNA前体剪切后生成，通过与其目标mRNA分子的3′端非编码区域（3′UTR）互补配对使目标mRNA分子的翻译受到抑制。miRNA在肿瘤发生发展过程中，具有与癌基因或抑癌基因相似的作用。近年来，miRNA的研究发展迅速，随着研究不断深入，人们发现，许多miRNA参与了干细胞的自我更新与分化。
早在1993年，Lee等在秀丽线虫（C.elegans）的突变体内首先发现一种长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，命名为lin-4。它可以互补结合在其靶基因lin-14 mRNA 3′UTR的7个保守位点，从而下调lin-14蛋白的表达水平，使线虫由L1期向L2期转化。7年后，Reinhart等在线虫中发现了第二种类似的具有转录后调节功能的小RNA——let-7。它存在于线虫幼虫的第3、第4期及成虫期，其表达决定了线虫从幼虫向成虫的转变。与lin-4的作用原理相似，let-7通过识别、结合lin-41和hb1-1（lin-57）的3′ UTR实现转录抑制功能。抑制let-7的活性将导致成虫阶段出现幼虫期的形态；相反，let-7在幼虫期过度表达将会导致早熟。
随后，人们发现miRNA普遍存在于多细胞生物中，而且数量可观，占整个基因组基因总数1%左右。在不同物种之间高度保守，并已被证实参与和调控了包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程。
多数动物miRNA位于前体mRNA的内含子中，这种安排将使mRNA基因和内含子中miRNA共同转录。人类miRNA基因中，大约25%编码于内含子。内含子编码的miRNA与携带它们的前体mRNA方向相同，这就暗示每一个转录本可加工生成能翻译的拼接mRNA和有功能的miRNA。
miRNA基因簇大多以顺反子形式转录存在，可能是miRNA共同表达的另一途径。这似乎是果蝇的重要调控方式，大约50%预测的miRNA基因位于基因簇内。在线虫和哺乳动物中也发现了大量miRNA簇。尽管一些基因簇含有的miRNA序列不相同，但似乎参与控制相同的病理学过程。
miRNA是其基因转录体经过2次剪切加工形成的。miRNA通常是由RNA聚合酶Ⅱ转录，生成较长的具有茎环的miRNA基因转录体（pri-miRNA）。在动物体内，pri-miRNA在细胞核内被一个特异的RNaseⅢ核酸内切酶Drosha切割，产生长约70个bp的具有不完全茎环结构的miRNA前体（pre- miRNA），该切割点位于茎环的基底部，产生1个5′磷酸端和1个具有2个游离核苷酸的3′端。在蝇类和线虫体内，这种双链RNA结合蛋白是Pasha；而在人体内，这种结合蛋白是DGCR8。然后，pre-miRNA通过GTP依赖的Exportin-5蛋白由细胞核运输到细胞质中。在细胞质里，pre-miRNA被另一种RNaseⅢ核酸内切酶Dicer酶切割成为成熟的长约22bp的双链miRNA。随后，双螺旋解旋，互补链立即被降解，而另一条链即为成熟的miRNA。
miRNA对靶基因的调控是在转录后水平上，通过对靶基因转录体的切割或对其翻译抑制两种机制来下调靶基因的表达。这两种机制的选择主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，如果miRNA与靶基因mRNA 有充分的互补，miRNA将通过切割方式来调控靶基因；如果miRNA与靶基因mRNA没有充分的互补，但有多个互补位点，那miRNA将通过翻译抑制的方式来调控靶基因；并且对靶基因翻译的抑制需要多种miRNA对同一靶基因的协同作用。在动物体内，大部分miRNA不能与靶基因的转录体完全配对，故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶基因。
大多数植物、病毒和部分动物的miRNA通过对靶基因mRNA的切割来调控靶基因。而大多数动物的miRNA通过与mRNA3′端非翻译区（3′ UTR）的不完全互补配对在转录后阶段抑制靶基因的表达。当miRNA与其靶基因信使RNA不完全配对时，miRNA会抑制mRAN的翻译从而影响蛋白质的合成，但并不影响mRNA的稳定性。
miRNA对基因的调控是通过形成RISC复合体来进行的，RISC是其调控的物质基础。RISC组成的核心成分是miRNA以及各种蛋白，其中Ago蛋白是该复合体中的核心蛋白，具有非常重要的作用。这种蛋白具有2个保守的结构域：PAZ结构域和PIWI结构域。PAZ结构域能识别miRNA双链特征性的具有2个游离核苷酸的3′端，这种识别，可最大限度排除不相关RNA分子进入RNA介导的沉默通路；PIWI结构域是一种属于RNase H家族的结构域，具有核酸内切酶的活性，所以Ago蛋白就是RISC中对靶基因转录体进行剪切的物质。在RISC中，miRNA介导RISC与靶基因mRNA的相互作用，从而影响靶基因的表达。