第一节 端粒和端粒酶
一、端粒和端粒酶研究简史
早在20世纪30年代末，诺贝尔奖获得者Muller及Mc-Clintock等分别在以玉米、果蝇为材料的试验中发现损伤后断裂的染色体很不稳定，彼此的端口很容易相互粘连，造成染色体易位、倒位、缺失、双着丝点等畸变，而染色体的天然末端却相当稳定，他们推测在天然染色体的末端必定存在一种特殊的结构保证了染色体的稳定，因而提出染色体末端结构可能是为了维持染色体的稳定，并根据希腊文组词将其命名为端粒（telomere）。1978年，Blackburn发现单细胞生物四膜虫（tetrahymena）的端粒含有一种短而简单的核苷酸重复序列，此后，这种重复结构特征被证明在植物、微生物和动物的端粒中广泛存在，并具有如下共同特征：在进化上高度保守，常含有较多的T和G，总有1条富含G的链从5′→3′方向指向末端，并比反向链长12～16kb，3′末端伸出并弯曲呈帽状保护染色体，即3′悬挂链（3′-over hang strand）。1985年Howard发现了人类的端粒结构，其重复片段为TTAGGG，与小鼠的相同。
1999年，Griffith等结合电镜观察提出端粒结构假说即D-loop-T-loop模式，T-loop是通过端粒的3′突出部侵入端粒重复序列而形成，同时通过单链G尾的TTAGGG在环的端口内侧与CCCTAA碱基互补形成100～200碱基对的D-loop，D-loop-T-loop被认为是端粒末端结合蛋白结合端粒所必需的结构，从而保护端粒末端，防止端粒缩短或端粒融合而导致细胞衰老死亡。同时研究提示，端粒DNA的保护可能与其富含G序列能够形成一个大的具有很高规律性鸟嘌呤四联体结构有关，此结构是由4条相互独立的DNA链构成的四聚体复合物。
1978年Blackburn 等发现四膜虫的端粒是重复串联的5′-GGGGTT-3′DNA简单序列，1985年Shampay 等将四膜虫端粒DNA 转入酵母细胞，发现酵母端粒序列与之相连并延长，因此他们假设生物体内存在一种物质，能将特异末端序列转移至外源DNA 上，后来Greider、Blackburn等人在四膜虫细胞核提取物中首先发现并纯化了这种物质，证实该物质就是端粒酶，它具有端粒特异性末端转移酶的活性，它的活性不依赖于α-DNA 聚合酶和DNA 模板而使端粒序列自我复制，用这种简单序列给端粒DNA“加尾”。
此后，人端粒酶活性首先在人宫颈癌细胞株hela细胞而非人正常体细胞中发现，使人们意识到端粒的长度是可变的，端粒的“加尾”可能与肿瘤的永生化特性有关。在此基础上，1989～1992年，Lundblad、Harley及Allsopp先后进行了一系列端粒短缩与细胞分裂次数及其衰老的相关性实验，提出了“端粒假说”。该学说认为：端粒随细胞分裂次数的增加而缩短，达到一定程度细胞停止分化并出现老化，即进入第一危机期（M1期），此时若细胞被病毒转化（如SV40T抗原），或者某些抑癌基因如P53、Rb等的突变，则有可能使细胞越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，并最终进入第二危机期（M2期），此时染色体出现各种异常形态，细胞中某些端粒由于太短而失去功能，于是细胞死亡，但极少数细胞在此阶段激活了端粒酶，使端粒功能得以恢复，则又可使细胞越过M2期并永生化。
二、端粒的结构及功能
端粒是真核细胞线性染色体末端非编码的DNA重复序列和与之相连的端粒结合蛋白的功能性复合体，是染色体末端的特殊DNA -蛋白质结构，由一段富G（鸟嘌呤碱基）的DNA 序列及相关蛋白质组成，主要作用是防止染色体DNA降解、末端融合缺失和非正常重组。正常的体细胞随细胞不断增殖，端粒逐渐缩短，也逐渐失去对染色体DNA的保护作用，细胞每分裂一次约丢失一个岗崎片段长度的DNA，大约经过100次以上的细胞分裂，当端粒缩短至2 ～ 4kb时，端粒失去保护染色体末端的作用，染色体的稳定性就会遭到破坏，细胞开始衰老或凋亡，故称端粒为细胞分裂次数的“分子钟”。
人端粒DNA由5′-TTAGGG-3′的重复序列串联组成，大约重复2000 次左右，长度范围为2～15kb不等，这是由细胞分裂次数不同造成的。端粒的最末端由50到数百重复的TTAGGG 单链组成，称为3′ 悬突。这条单链与端粒结合因子形成环形结构，称为T-loop 结构。T-loop 结构在多种生物体中存在，与保护端粒及避免染色体末端融合有关。Blackburn 的研究表明，端粒的功能不仅与长度相关，而且与端粒的结构及状态有关。端粒始终处于一种动态的平衡当中，当端粒缩短时，端粒末端蛋白解聚，暴露出3′端，以便让端粒酶结合使端粒延长。在端粒酶依赖的端粒维持机制的肿瘤细胞中，大多数肿瘤细胞的端粒都非常短，因此，它们表达端粒酶来延长端粒，这也说明端粒必须具有一个最短的长度，使端粒末端形成一定的正常结构，也可能是端粒末端形成T- loop结构所必需的最短长度。现已明确，端粒的稳定是防止细胞癌变的一个重要步骤，大多数正常体细胞不表达端粒酶活性，只有极少数细胞由于端粒酶活性的激活，端粒得以合成，功能得以恢复，染色体末端也重获稳定，细胞获得永生化。人类大多数恶性肿瘤细胞都表达端粒酶，肿瘤组织细胞的端粒通常比癌旁组织细胞的端粒短，说明当端粒缩短到一定的限度，细胞便有向永生化方向转化的可能。
端粒末端有一系列的蛋白参与形成端粒的高级结构，目前已发现的有TRF1、TRF2、POT1 及PINX1 等。TRF1 是最早被发现的与端粒末端结合的相关蛋白因子，它能特异性地识别端粒末端的TTAGGG 重复序列并结合，实验表明，TRF1 结合端粒的强度与TTAGGG 重复序列的长度有关。TRF2 也结合于端粒末端DNA 双链，两者结构相似，但功能各异。抑制细胞中TRF1的表达表现出端粒3′ 端暴露并被降解，端粒的长度不断缩短，最终引起P53依赖的细胞凋亡信号通路的启动；在HTC75 细胞中高表达TRF1 则导致细胞端粒的缩短，由于TRF1 与端粒末端的DNA 双链结合，并发挥作用使端粒末端的单链形成T- loop 结构，而T-loop 结构可能阻碍端粒酶与单链DNA 的结合，从而在端粒的动态维持机制中发挥作用。在细胞中高表达野生型的TRF2，也使端粒长度缩短; 而抑制TRF2 的表达，则细胞的染色体出现末端融合导致细胞死亡。表明TRF2 对维持端粒末端的高级结构起重要作用。
POT1（protect of telomere）是端粒末端单链结合蛋白，结合在由 TTAGGG 组成的 3′- G 单链上。人类POT1 蛋白有5 种不同的剪接体，它们的相对分子质量分别为71×103、58×103、52×103、38×103和5×103。不同种属的POT1 蛋白的表现是不同的，即使在同一种属中，不同剪接体的作用也是不同的。酵母细胞分裂过程中如缺少POT1，端粒末端的DNA就会迅速缩短。而在人的细胞中，端粒末端双链DNA却并没有缩短，POT1蛋白只影响3′ 端粒末端单链的长度。
PINX1（PIN2-interacting protein 1）是与TRF1和hTERT（人端粒逆转录酶）相互作用的一种蛋白因子，由328个氨基酸残基组成，参与端粒长度的调控。在端粒酶阳性的肿瘤细胞中高表达野生型PINX1能部分抑制端粒酶活性，高表达PINX1 C端（254～328aa）则完全抑制端粒酶活性并引起肿瘤细胞凋亡；抑制细胞内PINX1表达则提高肿瘤细胞端粒酶活性，延长端粒，且使裸鼠的致癌性大大提高。由于PINX1基因位于染色体8p，在多种肿瘤中是一个杂合子缺失区，与肿瘤发生密切相关，PINX1因此被认为是一个潜在的抑癌基因。
三、端粒酶的结构及功能
端粒酶（telomerase）是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，由人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒酶相关蛋白（telomere associated protein，TRP1、TRP2）三个亚单位组成，其中hTERT和hTR组成端粒酶最小核心结构，对维持端粒酶活性至关重要。人正常组织细胞内hTERT基因为单拷贝基因，总长约为40kb，定位于染色体的5p15.33区，在hTERT基因的转录起始点上游的181bp片段为核心启动子序列。
1995年Feng等人首次通过构建肾癌293细胞系cDNA文库，进行RT-PCR扩增，最后从PCRcDNA库中筛选出人类端粒酶RNA基因并定义为hTR（human telomease RNA），定位于3号染色体（3q23.3）。hTR基因长约450bp，无内含子，其中模板互补序列为 CTAACCCTAAC，转录后生成 RNA 组分的 5′ -CUAACCCUAAC-3′ 序列，正好与 1.5 个TTAGGG 互补，用于合成一个染色体末端TTAGGG 序列。
hTERT是端粒酶的催化亚基，与端粒酶RNA-端粒酶相关蛋白l（hTEPl）复合物结合成全酶，激活端粒酶的活性。近期研究表明，hTERT为端粒酶活性所必须，是RNA依赖的DNA聚合酶，它区别与一般的蛋白逆转录DNA聚合酶的主要特征是自身携带模板，它含有引物特异识别位点，可识别单链富含G的寡核苷酸引物，以其RNA组分的碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，其蛋白质组分在合成、延伸碱基序列中起催化作用。实验表明，端粒酶合成端粒DNA 包括四个步骤：富含G的3′-overhang 作为引物与端粒酶RNA 中的端粒互补序列相互识别、碱基互补配对；端粒酶RNA 作为模板，在底物dNTP 参与下，按5′ →3′ 方向合成一个新的端粒重复序列，使染色体3′ 末端得以延长；端粒酶再转位。端粒酶RNA 模板与染色体末端配对解开，重新定位于新合成的端粒重复序列的3′ 末端，并重复步骤2的聚合反应，合成互补链。目前认为是以新合成的端粒重复序列为模板，在DNA 聚合酶作用下完成。上述几个步骤循环重复，则可合成很多个端粒重复序列，使端粒得以延长。
端粒酶的活性调控在多个水平进行，包括hTR和hTER基因转录、剪接和成熟、转录后修饰、各个组分的移位和定位、活性端粒酶组装等。目前认为hTERT启动子是端粒酶活性调节限速因素，hTERT基因启动子是高GC富含区，缺少TATA盒和CAAT盒，存在一些潜在的转录因子结合区，如E-box（CACGTG）、SPl、C-Ests等。这些结构特征使得hTERT基因启动子具有较强的启动活性及潜在的肿瘤靶向性。在大多数的恶性肿瘤中检测到hTERT启动子的活化并与端粒酶活性有高度的相关性，针对hTERT启动子的反义封闭和RNA干扰技术在肿瘤靶向基因治疗中具有巨大的潜力和广阔的应用前景。
端粒酶可以合成端粒中重复的DNA序列，从而维持端粒的长度，使某些增殖旺盛的细胞和肿瘤细胞的端粒保持动态平衡。端粒酶激活是细胞走向不死性的关键，而不死性又是肿瘤恶性增殖的必要步骤。人类端粒酶多出现在胚胎组织、正常成年男性生殖细胞、炎性细胞、造血干细胞、更新组织的增生细胞（如上皮的基底层细胞、肠隐窝等），特别是广泛存在于各种癌组织、癌旁组织、癌前病变组织细胞中，不同分化程度的癌组织其端粒长度不同，端粒酶活性表达程度也有所不同。
目前肿瘤发生的详细过程尚未完全了解，但已明确肿瘤发生需要基因突变的积累。端粒假说认为，正常细胞的端粒缩短到一定程度时会启动终止细胞分裂的信号，使细胞退出细胞周期而老化，而极少数的细胞在此时激活了端粒酶，从而使端粒不再缩短，获得无限增殖能力而成为永生化细胞，这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一，是癌变机制中一个十分重要的环节。端粒酶与恶性肿瘤之间的相关性，使它有望成为治疗肿瘤行之有效的新靶标。