第九章 肿瘤干细胞与外泌体
第一节 细胞外囊泡的概述
20世纪70年代后期，Rose Johnstone等从电镜中发现羊的网织红细胞中结构和核内体（endosome）相似的小囊泡称为“外泌体（exosome）”。直到1996年，外泌体才被认为是细胞处理废物的渠道，或细胞体内自身平衡的产物。20年前，人类基因组、蛋白质组学和微小生物学组受到广泛的重视与研究，而在另一个领域很少研究或被忽视，它就是细胞分泌。
细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）已经成为科学家研究的热点，包括外泌体（exosome）、脂质膜囊泡、微囊泡、微颗粒、纳米级颗粒、核外粒体（ectosome）和凋亡小体。这些细胞外囊泡含有蛋白质与RNA，这两者有重要的细胞功能，是纳米医学的重要始动者。在细胞外囊泡领域有很多工作急需进行：包括EV的分离、鉴定和定量研究；正常人与疾病患者的EV生物学功能；了解EV产生与释放的细胞内分子机制；阐明细胞膜通讯和蛋白质交往的过程。在不同疾病内，EV的成分和量是变化的，因此，EV是潜在的生物标志，并因EV具有间充质干细胞（MSC）治疗的活性成分，所以也有广泛用于疾病治疗的潜在性。
exosomes是由细胞内多囊泡体（multive vesicles bodies，MVB）与胞膜融合后分泌到细胞外环境中的直径40～100nm的膜性囊泡，它可由多种细胞分泌，作为一种载体在细胞间起到信息传递作用。外泌体存在于多种体液，包括血浆、尿液、恶性腹水、唾液、母乳及滑膜液等。exosome 是许多活细胞晚期内体形成并分泌到细胞外的一种膜性小囊泡，不同细胞来源的exosome 所含的蛋白质不同，其生物学功能也是有差异的。
exosome是一些细胞内再循环通路的最终产物，首先，细胞内小囊泡在浆膜上形成，并融合；形成早期的核内体（endosome）。细胞内内溶酶体微粒（endolysosomal vesicle）内陷形成多囊泡体（multi-vesicular body，MVB），然后，这些细胞内多囊泡体直接与胞膜融合后分泌到细胞外即外泌体（exosome）。作为小囊泡（microvesicle），它们直接从浆膜发芽（图9-1A）。一个扩大的exosome有种种外泌体的公共表面标志物，如CD9、CD63、脂质相关的蛋白质，包括flotillin-1以及内标志物，如Alix和Tsg101。每个exosome也含有small RNA与其他细胞质蛋白以及细胞特异受体，细胞特异受体能接受细胞（图9-1B）。
外泌体在透射电子显微镜下观察均为脂双分层扁平或球形小体，直径都在30～100nm之间，是由晚期核内体（endosome）形成并分泌到胞外的一种膜性小囊泡（图 9-2）。
1987年Johnstone等首次在网织红细胞多泡体（multi-vesicular body，MVB）中的胞外细胞质融合时发现。它的特性主要有：①直径为40～100nm；②具有来源细胞的胞质和脂质胞膜成分；③密度为1.13～1.19g/ml；④可通过超速离心等方法获得。
通过透射电镜可以观察到外泌体为微囊小体，形态均一、大小相近，呈典型的杯状结构，由脂质双层膜包裹的扁平球体，其外周及内含物均可见负染效应；流式细胞仪上可见CD24阳性率为（92.23±3.8）%。
exosome主要是由蛋白质和脂质组成。不同细胞来源的exosome，其蛋白质也是有区别的。exosome中蛋白质可以分为两类：普通蛋白质和细胞特异性蛋白质。
exosome 的普通蛋白质最可能涉及exosome的生物发生与一些未知的功能。它们包括细胞溶质蛋白，如微管蛋白、肌动蛋白、肌动结合蛋白（如细胞骨架成分）；细胞膜融合和转运相关蛋白质（annexin 和rab 蛋白质）、信号转导蛋白质（如蛋白激酶、异源三聚体G 蛋白）；代谢酶类（如过氧化物酶、丙酮酸酯酶、脂激酶、烯醇酶—热休克蛋白Hsp70、Hsp84 和Hsp90 等）。还有一类在任何细胞来源的exosome 上高表达的 tetraspanins 蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82），它们与多种蛋白质相互作用，包括MHC分子和整合素，所有这些蛋白质都可能与exosome 的生物起源有关。
exosome 的细胞特异性蛋白质涉及细胞的特定功能，其中研究多的是APC表达的exosome，如DEXs和B细胞来源的exosome（BEXs）富含MHC-Ⅱ分子和共刺激分子（CD86、CD80）是T细胞活化的必需共刺激分子；TEXs含大量的肿瘤抗原，与肿瘤的免疫相关，如人类鼻咽癌来源的exosome含LMP1能抑制T细胞活化效应；某些TEXs能异常地表达FasL，诱导AICD。黑素瘤异常表达HLA-G，能促进肿瘤的耐受作用，这些均与肿瘤细胞逃避宿主的免疫有关。最近研究发现DEXs含MFG-E8，被认为是将exosome和DC连接在一起的分子，这样使得exosome能将抗原信息传递给DC，从而刺激T 细胞活化。此外，肠上皮细exosome含A33抗原，血小板exosome含P选择素，肥大细胞exosome 含氨肽酶N/CD13，这些特异性表达的蛋白质，与细胞的特异性功能有很大的关系（表 9-1）。
外泌体中除了含有蛋白质外，也有一些脂质成分，对其研究还很少。网织红细胞外泌体所有成分与其细胞的质膜类似，B细胞来源的外泌体（BEXs）中含有大量的胆固醇，还有鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、神经节苷脂等，其中鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸在质膜脂筏结构中起重要作用。血小板是APC 表达的外泌体，如DEXs 中也有磷脂酰丝氨酸存在。
外泌体含有核酸，但没有DNA。然而，一些矛盾的报告指出：外泌体含有DNA取决于外泌体细胞来源。例如，成胶质细胞瘤（glioblastoma）和星形细胞瘤（astrocytoma）有线粒体DNA，自2007年，Valadi 等第一个报道外泌体含有mRNA 和microRNA以来，已有成千的mRNAs从鼠类和人的exosome中被鉴定。在MVs/exosome中可发现上百个基因转录子细胞分泌的外泌体还含有能在细胞间进行转移的RNA（mRNA及microRNAs），通过在细胞间水平转移方式激活靶细胞产生一系列生物学效应，外泌体在细胞微环境中具有十分重要的作用。现将外泌体RNAs和 miRNA的生物学功能列表9-2如下：
上述表9-2中研究的结果，提示外泌体中的特有的microRNAs、蛋白质或脂质将成为人类各种疾病诊断与预后的未来生物标志基础得以发展。
外泌体可以与靶细胞相互作用，其真正作用机制尚不完全知道。外泌体与靶细胞的识别具有特异性，如血小板来源的外泌体能识别内皮细胞和巨噬细胞，不能识别中性粒细胞；而中性粒细胞来源的外泌体则可识别血小板、巨噬细胞及树突状细胞。外泌体靶向细胞的方式有三种：一是直接与靶细胞的胞膜融合，同时释放mRNA、miRNA进入细胞质；二是通过内吞作用被靶细胞摄取；三是识别细胞表面的特异性受体（图9-3）。外泌体表面有多种生长因子、细胞因子（如VEGF、SCF），并且几乎所有的外泌体内都含有生理活性的脂质成分，如1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）、神经酰胺-1-磷酸（ceramide-1-phosphate，C1P）。外泌体进入靶细胞后，这些旁分泌因子直接与细胞相互作用，如S1P、C1P可抑制细胞凋亡和刺激血管新生。
此外，外泌体还可水平转移miRNA至受体细胞，miRNA作为信号分子直接传达遗传信息，调节细胞功能。例如，巨噬细胞在受到刺激后会增加外泌体中miR-150的分泌，miR-150可通过抑制内皮细胞（HMVEC）中miR-150靶基因c-Myb 的翻译来刺激内皮细胞迁移。
已有一些方法可从人体液或细胞培养液中分离、纯化EVs。但到目前为止，仍没有一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性。现将外泌体分离提取、纯化与鉴定的主要方法叙述如下：
分离方法 目前，外泌体分离策略的改进，主要聚焦在新技术的开发，如纳米膜为基础的过滤方法（nanomembrane-based filtration methods）——免疫亲和分离法（immunoaffinity isolation）和微液流动免疫亲和分离法（microfluidic immunoaffinity isolation）。这些技术具有很高的价值，并被成功应用到含有抗原的不同细胞类型，乳腺腺癌细胞系，结肠癌和患者的体液（腹水，血清）。但它们还没有被广泛应用，因为它们的应用需要不同囊泡阳性蛋白标志物，目前大多数标本缺少阳性蛋白标志物。
外泌体的分离提取方法很多，主要有差速离心法、密度梯度离心法及非沉淀的方法等。
Lamparski等用500 000 的膜超滤细胞培养上清，再经300g/L蔗糖/双氧水（98%）密度层进行超速离心。此方法相对于经典方法，快速简便，可使液体体积浓缩，回收率高。何志旭等和朱伟、李雅红，采用差速离心、超速离心、蔗糖密度梯度离心和超滤离心相结合的方法，可特异性地与靶物质结合。同样密度梯度离心是将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时黏度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在此基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液（如2.5M和0.25M）配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000g离心16小时，外泌体会沉降到等密度区（1.10～1.18g/ml）。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
免疫磁珠是包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合。Clayton 等将外泌体相关抗原的单克隆抗体（如CD9、CD63、Alix）包被在磁珠上，并与外泌体共同孵育，反应后，以蒸馏水洗脱，重悬于PBS缓冲液中。这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但不适用于大规模提取制备，也不适合于未知EV的分离提取。此外，非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，对深入研究有影响。
色谱法是利用色谱柱固定相凝胶的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到吸附与滞留，更慢地被流动相洗脱出。分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
外泌体的鉴定主要依赖其形态学和特异性分子组成。
首先应用透射电镜进行形态学观察，结果显示外泌体是多个大小不一，呈明显异质性的圆形或椭圆形，外包裹着被膜的小囊泡，直径约为30nm～1μm，中心可见低密度光亮区的低电子密度物质。很多细胞来源的EV在形态学上相一致。
不同细胞来源的exosome 所含的特异性分子也不同，可通过Western-blot、RT-PCR 、流式细胞仪的方法来鉴定。例如，从羊水中分离的外泌体在流式细胞仪上可见CD24阳性率达92.23%±3.8%。人骨髓间充质干细胞（MSCs）培养分泌的外泌体用 Western-blot 检测到外泌体表面相关蛋白CD9、CD81。
Ratajczak J等报道小鼠胚胎干细胞的微囊体（ES-MV）内可检测到SDF、LIF、P-selectin、Oct-4、KL、HOXB4、GATA-2、GATA-4、Cathepsin G、Nestin、myogenin、c-met、CXCR4、VE-cadherin、Wnt-3、SCL、Nanog、Rex-1、TIMP-1 及 TIMP-2 等蛋白表达。
何志旭等以Oct-4、Wnt-3和Hoxb4为标志，采用RT-PCR 的方法鉴定小鼠胚胎干细胞（ESC）的外泌体（ES-MV）。因Oct-4是胚胎干细胞的特异性的表达分子，它只在全能细胞或胚胎多能干细胞中表达，同时Oct-4 的表达水平也是ESC是否分化的常用指标；Wnt-3是一种具有自我更新能力的细胞所具有的特异性分子，可在ESC、造血干细胞（HSC）等具有自我更新能力的细胞内表达。HOXB4 可以增强ESC 的造血潜能，促进 ESC 向造血细胞分化。
1998年Zitvogel等发现树突状细胞分泌的外泌体在小鼠体内可引起肿瘤排斥，因此，外泌体的抗肿瘤免疫作用受到重视，并且开展了外泌体相关的临床试验。外泌体对肿瘤生长的免疫影响主要有三方面：①抗肿瘤免疫；②免疫功能抑制；③肿瘤免疫逃逸。携带肿瘤抗原的外泌体可将其表面的MHC抗原肽复合物传递给树突状细胞，增强抗肿瘤免疫。肿瘤细胞来源的外泌体可通过表达FasL诱导CD8+ T细胞凋亡，导致肿瘤免疫逃逸；减少树突状细胞的分化、促进骨髓来源的免疫抑制细胞（MDSC）分化、通过NK细胞激活型受体（NKG2D）抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性影响宿主的免疫系统。耐受性树突状细胞（tDC）来源的外泌体（tDex）与tDC具有相似的诱导免疫耐受特性，将tDex输注免疫介导型再生障碍性贫血小鼠体内，可促进小鼠造血功能的恢复。Hart发现，在大鼠骨髓移植前注射供体骨髓树突状细胞分泌的外泌体给受体，受体心脏存活时间延长，提示存在免疫耐受现象。此外，热休克蛋白（HSP70+）人结肠癌细胞来源的外泌体在体外可刺激NK细胞直接杀伤肿瘤细胞。冯业童等报道结肠癌细胞分泌的外泌体能促进外周血单个核细胞（PBMC）的增殖，而热休克蛋白处理外泌体可增加外泌体的免疫原性，更好地促进外周血单个核细胞增殖。
肿瘤来源的外泌体受热休克蛋白处理，其中，低剂量时，表现出对肿瘤细胞的促增殖作用，在高剂量时则表现为抑制作用。因此外泌体对肿瘤微环境的影响可能与外泌体的剂量有关。
外泌体来源的miRNA和其他信号分子一样，调节着生物信号网络，参与多种生理过程。间充质干细胞（MSC）来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长；血管新生是内皮细胞发生增殖和游走形成小血管的过程。K562细胞来源的外泌体miR-92可促进人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的游走和管状结构形成，从而促进血管新生；缺氧可上调miR-17超家族，在缺氧诱导的小鼠肺动脉高压模型中观察到间充质干细胞移植可抑制肺炎性反应、血管重塑及右心衰竭，研究其旁分泌机制发现间充质干细胞来源的外泌体可抑制miR-17超家族从而逆转肺动脉高压。
并且已有实验证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此，外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向。大量研究表明干细胞可分泌外泌体，Lai RC等报道骨髓间充质干细胞来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤。史云燕等也报道了人脐带间充质干细胞（hucMSC-exosome）来源的外泌体对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用，证明hucMSC-exosome能有效抵抗心肌细胞因缺血/再灌注损伤而引起的细胞凋亡。
外泌体的成分可以反映分泌细胞的功能状态，其中会包含不同疾病类型细胞相关的分子信息，临床研究已发现不同疾病的不同类型细胞的外泌体都能分泌RNAs。因此，从人体体液中纯化外泌体，再对其RNA成分及序列分析成为可能，有望用于疾病诊断及监测，尤其在肿瘤标志物检测方面，外泌体具有独特的优势和良好的前景。
肿瘤在生长过程中肿瘤细胞会不断地将外泌体释放到周围环境中去，由于外泌体携有的蛋白质及RNA成分具有其来源细胞的特异性，可作为特异的生物学标志用于肿瘤和一些非肿瘤疾病的诊断。Taylor等首先提出通过检测血液外泌体miRNA来诊断卵巢癌，他发现卵巢癌患者与正常人血液外泌体的miRNA图谱有明显差异；卵巢癌患者血浆外泌体高表达上皮细胞黏附分子（EpCAM），且与疾病进程相关。
卵巢癌患者血浆外泌体含有 miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203 miR-205及miR-214，特异性高表达，且与肿瘤组织表达水平一致。这一研究首先将外泌体中microRNA作为肿瘤诊断分子标志应用于良性和恶性肿瘤的鉴别诊断，表明外泌体有助于卵巢癌的诊断。
Silva等发现结肠癌患者血浆中肿瘤来源的外泌体明显增多，且癌胚抗原的表达含量很高，外泌体增多预示结肠癌预后差、生存率低。血浆外泌体中microRNA检测也可作为肺癌的诊断标志。Rosell等提出外泌体miRNA可作为肺癌的诊断标志物。Rabinowits G，也提出外泌体miRNA可作为肺癌的诊断标志物;肺癌患者外泌体较健康对照组高表达EpCAM，且血浆外泌体中有12种microRNA与肿瘤组织高表达一致。前列腺癌中，尿液标本中外泌体表达PSA、PSAM和肿瘤相关标志物，而正常尿液中外泌体则不表达。
外泌体在非肿瘤性疾病的研究中也得到广泛的关注和应用。Keller等用RT-PCR分析羊水中的外泌体，发现外泌体存在编码ZFY（人类Y染色体的性别决定区编码一种锌指蛋白）的mRNA，可用于胎儿性别的判断。
Michael等从干燥综合征患者和健康人的唾液中提取出的外泌体携带有其microRNA标志物，对疾病的诊断有重要意义。外泌体在肝脏和肾脏疾病的诊断中也受到关注，研究发现有肝损伤的兔和鼠尿液标本中含有外泌体。尿液中的外泌体也可能携带肾功能障碍和结构性损伤的蛋白质标志，在顺铂诱导的大鼠急性肾损伤模型中，尿液外泌体胎球蛋白A的含量明显升高，可作为急性肾损伤的诊断标志物。急性肾损伤患者尿液外泌体中含有活化转录因子-3（ATF-3），而健康对照尿液中没有，表明尿液外泌体检测可作为急性肾损伤的诊断指标。
以上研究表明外泌体在疾病诊断领域得到广泛关注，并取得了部分研究成果，为疾病诊断做出贡献。
肿瘤或损伤时外泌体可调节机体免疫能力，因此外泌体在疾病治疗中的作用也受到很大的关注。肿瘤生长过程中可将外泌体释放到微环境中，肿瘤分泌的外泌体具有多向免疫抑制功能，可以保护和支持肿瘤使其可顺利逃避机体抗肿瘤免疫反应，且外泌体在抗肿瘤免疫反应中发挥其重要的作用。朱伟等分离纯化得到人骨髓间充质干细胞（hBM-MSC）的外泌体，发现hBM-MSC的外泌体可以活化肿瘤细胞MAPK通路，促进肿瘤细胞VEGF自分泌，增强肿瘤血管形成，促进肿瘤细胞的生长为肿瘤的微环境发生学说及靶向治疗提供实验依据。
肿瘤外泌体的分泌还可以影响肿瘤对抗癌药物的敏感性，影响肿瘤治疗进展。在针对HER2+的乳腺癌治疗中，HER2+外泌体的分泌会使肿瘤对抗癌药物敏感性降低，影响靶向HER2的抗癌治疗外泌体具有RNAs转运能力，在体液中稳定性好，因此，可以通过外泌体靶向运载核酸片段（如RNAi）治疗疾病。外泌体可作为一种载体，将基因或药物带入细胞，发挥治疗作用。2011年Alvarez等首次成功用电穿孔技术将外源iRNA导入内源性外泌体（靶向神经元、小胶质细胞、少突神经胶质细胞）来治疗鼠阿尔茨海默病，发现其可特异性敲除靶向基因。
将胚胎干细胞株来源MSC外泌体治疗急性心肌梗塞作为干细胞治疗的一种新方法，这些研究表明，MSC可通过旁分泌外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制对受损组织进行修复，这一旁分泌机制为基于MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。
马博、任军等利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外泌体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外泌体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育，72小时后观察H22细胞增殖状态。结果表明：外泌体负载的IFN-γ刺激活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72小时后，活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组。肿瘤源性外泌体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强，间充质干细胞联合肿瘤源性外泌体有可能成为一种更为有效的外泌体疫苗诱导抗肿瘤效应。
鉴于外泌体的诊断和治疗价值，目前存在的主要问题是如何建立快速、经济、高效的分离纯化外泌体的方法，克服现有提纯方法存在的缺点，这是外泌体应用于临床诊断和治疗的关键。