第二节　常见小儿肝胆外科疾病的分子生物学进展

一、肝纤维化

肝纤维化是一种常见的慢性进行性肝脏病变,最终发展成肝硬化。 各种肝脏疾病如病毒性肝炎、药物性肝病、缺血、寄生虫感染和遗传性代谢障碍等,均可导致肝纤维化的发生。

(一)肝纤维化的发生机制

各种原因形成的肝纤维化有其共同特征,主要表现为细胞外基质的过度沉积。 分子病理学研究证实,在炎性和毒性物质的长期和反复刺激下,肝星型细胞(Ito 细胞)、再生的肝细胞、库普弗细胞(Kupffer 细胞)、肝血窦上皮细胞以及自然杀伤细胞(NK 细胞)产生大量细胞因子和免疫活性介质,相互作用,构成复杂的反应体系,促成肝纤维化的发生和进展。

有关损伤因子如何诱导肝脏发生纤维化,目前研究认为:PI3K/Akt 信号通路参与肝纤维化的发生、发展。 PI3K 通过促进下游凋亡蛋白的产生而诱导肝细胞的凋亡,而LY294002 作为PI3K 的特异性阻断剂,可诱导HSC 凋亡的发生,并可抑制细胞的增殖,从而影响肝纤维化的发展。 转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF),上皮生长因子(EGF)是主要的促肝纤维化因子,而γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-10(IL-10)等则是抗纤维化细胞因子。 无论是促肝纤维化因子还是抗纤维化细胞因子,多可能是通过改变PI3K/Akt 信号通路而显示其生物学特性,以上发现为该病的基因治疗提供了理论基础。

(二)抗肝纤维化的治疗策略

有关肝纤维化的分子病理的研究为有效的抗肝纤维化治疗提供了可能,但迄今为止,基因治疗大多处于动物实验阶段,主要集中在以下几个方面:

1.阻断细胞因子的信号转导

在已知的细胞因子中,TGF-β 在肝纤维化发生过程中起主要作用,其主要通过TGF-β1/Smad 信号转导通路,使细胞外基质(ECM)合成增多,促进肝纤维化的发生,阻断TGF-β 的信号转导则有望减轻肝纤维化。 研究证实,ACE-2 重组体、Ang(1-7)可显著抑制TGF-β1/Smad 介导的COLl 和结缔组织生长因子(CTGF)的表达,从而抑制肝纤维化进程。 干扰素α-2a 存在通过调节bcl-2、bax 基因的表达,诱导活化的肝星状细胞凋亡途径,亦能阻断CCL4 诱导的肝纤维化,且该调节作用与干扰素α-2a 的剂量呈正相关。

2.促进肝细胞的再生

在肝纤维化的发展过程中,肝细胞的绝对和相对数量均减少,促进肝细胞的再生是治疗肝纤维化的有效途径之一。 研究显示,肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞刺激因子(HSS)及肝再生增强因子(ALR)具有比较明确和特异性的促肝细胞生长效应。 肝细胞生长因子具有有丝分裂原功能,能激活休眠状态的肝细胞,进入分裂和增殖状态,并促进血管的再生。 肝细胞刺激因子,是一种具有热稳定性的特异性肝细胞刺激因子,存在于哺乳动物的胚胎性肝细胞。 外源性的HGF 促肝细胞再生表现为剂量依赖型,在肝叶切除后,血清中的HGF 的水平在12 小时后上升,但不伴有mRNA 的水平升高,提示HGF 平时以非活性态存在,在机体需要时转变成活性状态。 肝再生增强因子(ALR)与肝细胞表面相应受体结合,促进细胞内线粒体基因表达和线粒体呼吸链氧化-磷酸化,增强肝细胞活性,促进肝细胞再生。

3.抑制肝脏间质的炎性反应

间质的炎症反应是肝脏纤维化的基本病理变化之一,抑制炎性反应亦可达到减轻肝纤维化的目的。 在已知的炎症抑制性因子中,IL-10 最引人注目。 IL-10 主要由辅助性T 细胞(Th 细胞)的Th-0 和Th-2 亚群分泌产生,另外单核细胞、巨噬细胞、胶原细胞在不同的阶段也能或多或少产生。 研究表明,其抑制炎症的功效体现在:①从细胞水平抑制多种炎性细胞因子的合成;②抑制Th1 细胞和抗原递呈细胞(APC)的活性、主要组织相容性复合体的表达、B 细胞增殖和抗体产生,从而减轻免疫反应;③抑制肥大细胞增殖和蛋白酶的表达,抑制肝脏间质间炎症反应。 在四氯化碳诱导的IL-10 缺陷型的动物模型中,肝脏纤维化程度很重,但将带有IL-10 基因的病毒载体转导入动物体内,肝纤维化的程度则明显减轻。 目前,IL-10的抗肝纤维化作用已成为研究热点。

4.端粒酶的基因疗法

端粒是真核细胞染色体末端富含TTAGGG 重复结构的帽状结构,端粒的长度与细胞的正常分裂和增殖密切相关,端粒能增加染色体结构的稳定性,防止染色体结构的破损、重排或相互融合。 端粒的长度需要端粒酶维持。 有研究发现,肝组织中的端粒酶的活性与肝纤维化的严重程度呈负相关,硬化的肝组织中,端粒酶的活性下降,端粒长度显著缩短,推测端粒酶的活性下降后,肝细胞的破坏增加,而再生受到抑制。 亦有研究将端粒酶缺陷型的小鼠制成肝硬化的动物模型,用含有端粒酶基因的腺病毒感染小鼠,发现小鼠的腹水减少,血清蛋白水平提高,转氨酶下降,肝硬化的程度减轻,提示肝组织细胞中端粒酶活性的增加有利于缓解肝纤维化。 当然,过高的端粒酶活性往往与基因结构的不稳定性和肿瘤的发生有关,对端粒酶的基因疗法应持审慎态度。 对于准备行肝移植的肝硬化患者而言,施行短期的基因治疗,提高端粒酶的活性,改善肝硬化症状,仍有一定的实用价值。

5.肝纤维化的基因治疗

理想的抗纤维化治疗应该具有肝脏特异性和目标选择性。 近年来出现的基因治疗方法为抗纤维化治疗开辟了一个新的领域。 小干扰RNA(siRNA)可以通过纤维化肝脏的窦周间隙而发挥抗肝纤维化作用。 大部分目的基因是对星状细胞活化、增殖、胶原合成和沉积较为重要的基因。 研究结果显示,uPA 基因和HGF 基因联合治疗可在促进ECM 降解的同时,有效改善肝功能,减轻肝细胞坏死。 此外,瘦素(leptin)是一种强有力的促细胞分裂原,能促进HSC 增殖,抑制HSC 凋亡。有实验人员成功构建了瘦素siRNA 的重组质粒,这种质粒转染HSC 后转录siRNA,可抑制瘦素和Ⅰ型胶原基因表达,可减轻肝纤维化,为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。

二、肝内胆汁淤积症

肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis,IHC)是婴幼儿期常见肝病,由各种病因或病原引起的肝细胞和(或)毛细胆管结构与功能异常,导致胆汁的生成和(或)排泄功能障碍,或使经胆汁排泄的物质(如胆汁酸、胆红素、胆固醇等)聚集于肝细胞和血液中所导致的一系列临床综合征。 临床主要表现为高结合胆红素血症、胆汁酸水平升高,肝大、质地异常和粪便颜色改变,甚至胆汁性肝硬化、肝功能衰竭等。 它和高胆红素血症的含义并不相同,胆汁淤积时除有高胆红素血症外,血中胆汁酸成分亦增加,故称为胆汁淤积性黄疸,而高胆红素血症不一定伴有血中胆汁酸浓度的增加。

(一)胆汁形成的机制

1.肝细胞的排泌

肝细胞分泌胆汁是一主动过程,肝血窦基侧膜的多种转运器参与胆汁排泌过程。 钠依赖牛磺酸胆盐同向转运多肽(NTCP),其作用是一种钠依赖的胆盐转运器,对肝血窦内结合胆盐的高亲和力,摄取大部分胆盐。 Na+-K+-ATP 酶(钠泵),其作用为在肝血窦侧膜上选择性地摄取与白蛋白结合的有机阴离子、阳离子及中性化合物,使细胞内低钠高钾,从而形成跨膜电位,有利于结合型胆盐的摄入。 有机阴离子转运多肽(OATPs),其作用为非钠依赖的载体,主要转运非结合型胆盐及有机阴离子。 胆汁进入毛细胆管是ATP 依赖性的耗能过程。

2.胆管上皮细胞的排泌

除了肝细胞的主动转运,胆小管膜上皮细胞上的数种输出泵亦参与胆汁的形成。 多重药物输出泵-1(MDR1),负责转运有机阳离子;ADR3 是一种磷脂输出泵,负责将卵磷脂分泌入胆汁;Cl-/HCO3-阴离子交换器(AE2),与氯通道一起促进胆小管细胞分泌碳酸氢盐;钠依赖性胆盐转输器(ISBT),与回肠上皮细胞的钠依赖性胆盐转输器一道参与胆盐的肝胆循环;胆盐输出泵(BSEP),是存在于毛细胆管膜的ATP 依赖性胆盐转运器,能以ATP 依赖方式转运各种结合型胆盐;多药耐药蛋白-3(MDR3P-gp),能有效地转运磷脂进入毛细胆管;多药耐药相关蛋白(MRP2),其功能是在ATP 介导下,转运多种有机阴离子结合物,有利于胆盐非依赖的胆汁转运。

(二)常见胆汁淤积性疾病的分子病理基础

肝细胞和胆管上皮细胞转运蛋白的数量和功能是维持正常胆汁分泌的分子生物学基础,任何一种异常可导致胆汁淤积的发生。 目前的研究主要从肝细胞的转运蛋白异常方面阐述胆汁淤积的发病机制(表4-1)。

　　1.进行性家族性肝内胆汁淤积症(progressive familial intrahepatic cholestasis,PFIC)

又称遗传性胆汁淤积症,现已证实是因基因缺陷所致,为常染色体隐性遗传疾病,常在新生儿期或1 岁内起病,表现为肝细胞源性胆汁淤积症,自然病程呈进行性发展,常在婴儿期至青少年期之间因肝硬化或肝功能衰竭致患儿死亡。 近年来,随着遗传学及分子生物学的发展,人们已发现并明确了在肝脏内存在以下胆汁淤积相关基因,ABCB4、ABCB11 和ATP8B1 基因,分别编码毛细胆管磷脂载体、胆汁酸输出泵以及氨基磷脂载体。 以上三种转运蛋白均参与了肝脏胆汁酸的转运和分泌过程。 胆汁淤积相关基因的突变、异常表达可分别引起多种遗传性肝内胆汁淤积症。 根据缺陷基因不同分为PFIC Ⅰ、PFIC Ⅱ和PFIC Ⅲ三型,其相关基因依次为ATP8B1、ABCB11和AB-CB4,此3 种基因负责编码肝细胞毛细胆管膜上的蛋白依次为FIC1 蛋白、BSEP 蛋白和MDR3 蛋白,都是胆汁形成过程中所涉及的肝细胞转运系统中的重要转运蛋白。

Ⅰ型为Byler 病,患儿呈血清胆汁酸盐浓度升高、γ-GT 降低,而胆固醇正常,且无胆管的增生。研究发现,遗传学异常表现为FIC Ⅰ基因突变。 FIC Ⅰ基因主要在肝细胞和小肠上皮细胞中表达,与胆汁酸盐的肝肠循环有关,该基因的突变造成肝细胞表面的ATP-依赖性胆盐输出泵功能障碍,导致胆汁排泌受阻。 Ⅱ型的临床表现与Ⅰ型相似,但患儿的肝脏损害更为严重,血清ALT 和胆汁酸浓度更高,甲胎蛋白水平升高,早期出现肝功能衰竭、胆结石和肝癌。 其原因可能是BSEP 蛋白定位于胆固醇富积的肝细胞毛细胆管膜上,是毛细胆管转运胆汁酸盐的主要系统,是人类胆汁形成的主要驱动力。ABCB11 基因突变导致BSEP 蛋白表达降低或缺失,使BSEP 蛋白功能缺陷,胆汁分泌显著减少,胆汁流动减缓或停滞,肝细胞内胆汁淤积,从而引起进行性肝细胞损伤。 与上述二型相比,Ⅲ型临床上除表现为进行性胆汁淤积外,血中γ-GT 明显升高,镜下还可见毛细胆管增生、汇管区炎性细胞浸润。 其原因是ABCB4 基因突变造成MDR3 蛋白功能受损,胆汁中磷脂的分泌减少或缺如,损伤胆管和胆道上皮,诱发炎症反应,从而促进胆盐对胆管上皮的损伤和进行性肝纤维化或肝硬化。

2.良性复发性肝内胆汁淤积症

为常染色体隐性遗传,主要发生在青年人,有家族性,临床表现为反复发作的自限性淤胆性黄疸,持续几周或几月,间隔几周甚至几年,严重瘙痒、脂肪泻及体质量下降,但预后较好。 据报道,该症与Ⅰ型遗传性胆汁淤积症类似,同为ATP8B1 基因突变引起。

3.Citrin 缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症

本症为Citrin 蛋白先天功能障碍的一种遗传代谢性疾病,以淤积性黄疸、高氨基酸血症、肝功能异常为主要临床特征,多发生于4 个月内的婴儿。 研究证实,NICCD 患儿为SLC25A13 基因纯合或复合杂合突变,导致位于线粒体内膜的载体蛋白Citrin 功能不足所致。

4.Alagille 综合征

AS 是一种累及多系统的常染色体显性遗传疾病,现已证实由20 号染色体短臂Jaggedl 基因突变引起。 该病可累及全身多个脏器,临床表现主要为慢性胆汁淤积、心脏杂音、眼部异常、特殊面容及椎骨蝶形改变等。

5.半乳糖血症

是婴儿期发病的一种先天性代谢性疾病,属常染色体隐性遗传,发病率约为1/12 000,以半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶缺乏型最为常见。 典型临床症状表现为喂食乳类制品后数天出现呕吐、拒食、体重不增及嗜睡等症状,随后出现黄疸及肝大,若未及时发现而继续乳类喂养,会使病情进一步恶化。 多在2～5 周出现腹水、出血等肝衰竭终末期症状。

6.先天性胆汁酸合成障碍

CBAS 是一种罕见的常染色体隐性遗传病,占儿童胆汁淤积症的 1%～2%,最常见临床表现为婴儿期进行性肝内胆汁淤积。 主要由胆汁酸合成相关的酶缺陷引起。 常见以下几类:①3β-羟基-C27-类固醇脱氢酶/异构酶缺陷;②胆固醇7α-羟化酶缺陷;③δ-4-3-胆固醇-5β-还原酶缺陷;④胆固醇27 羟化酶缺陷;⑤胆固醇25 羟化酶缺陷;⑥a-甲酰基辅酶A 消旋酶缺陷;⑦胆汁酸结合作用中的酶缺陷等。

7.α1-抗胰蛋白酶缺乏症

α1-ATD 是由　α1-AT常染色体隐性基因突变所致,发病率罕见,国内仅有个例报道,新生儿肝炎是PiZZ 纯合子α1-抗胰蛋白酶缺乏的最早表现。

8.其他

目前的研究还发现,胆道闭锁患者肝细胞中NTCP 的mRNA 转录减少,但再通后其水平增加,认为血中高浓度的胆汁酸盐对NTCP 的mRNA 的转录有负反馈性抑制作用。 相反,原发性硬化性胆管炎患者肝细胞的OATP、肝外胆管梗阻的MDR1 和MDR3 均有mRNA 水平上升,可能是机体为了减少肝细胞内毒性化合物积聚而产生的代偿性变化。

(三)基因治疗

如上所述,胆汁淤积症可由胆道上皮细胞的CFTR 基因变异所致,有人将含有该基因的反转录病毒转染CFTR 基因缺陷小鼠,发现血中CFTR 蛋白含量有暂时增加,胆汁淤积有所缓解。 亦有报道,将含有CFTR 基因的反转录病毒转染离体培养的基因缺陷型胆管上皮细胞,可纠正该基因缺陷。 另外,研究显示,大剂量熊去氧胆酸能使肝组织上BSEP蛋白表达量增加,对ABCB11 基因的转录具有上调作用,因此有人提出,将缺陷基因作为未来基因治疗的靶点,可能对IHC 的治疗带来革命性的影响。 目前,有关胆汁淤积基因治疗的研究尚处于细胞培养或动物实验阶段。

三、胆道闭锁

胆道闭锁是新生儿阻塞性黄疸常见的原因,其组织病理学特征是进行性肝内外胆管炎和肝纤维化。 通过Kasai 手术,患儿的黄疸能够得到一定程度的改善,但大多数患儿仍发生进行性肝内胆管破坏和肝纤维化,最终发展成肝硬化和门脉高压,需要进行肝脏移植。 这种进行性的病变使得胆道闭锁的远期疗效欠佳,也使之成为小儿外科的研究热点。现代免疫学和分子生物学技术促进胆道闭锁的研究从细胞水平深入到分子水平,借助基因芯片及生物信息学技术,对基因表达谱系及基因间的相互关系进行研究,发现细胞因子、相关基因的表达异常机制在病情进展过程中起着极其重要的作用。

(一)胆道闭锁的分子病理学基础

1.遗传物质变异

研究发现,胆道闭锁与胆总管囊肿相比,存在1000 余条基因差异,通过基因芯片技术发现了两个最具显著性的表达趋势,趋势21及趋势23。 趋势21 的关键基因有ITGB2、ITGAM、TNFSFR21、RGS19,趋势23 的关键基因有LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMPL1,主要涉及细胞凋亡调控、细胞代谢等,以上研究提示基因异常可能参与胆道闭锁的形成。

2.病毒感染

近年来发现,轮状病毒、巨细胞病毒、Ⅲ型呼肠弧病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒等均与胆道闭锁的发病有关。 其中,轮状病毒与胆道闭锁的作用更为引人关注。 轮状病毒感染机体后,部分抗原被巨噬细胞吞噬并呈递给CD4+淋巴细胞,从而激活CD8+淋巴细胞,并分泌穿孔素等因子攻击胆管上皮细胞,造成胆管上皮细胞破坏,并导致巨噬细胞吞噬被破坏的胆管上皮细胞而将自身抗原递呈至免疫系统,从而造成进一步的损伤。

3.免疫反应异常

由病毒感染激发免疫炎症反应的观点认为胆道闭锁可能是一个“多次打击”的病理过程,在这个过程中,病毒或毒性物质对胆管上皮的初始损伤作用导致胆管上皮表面新的抗原表达或抗原变异,Th1 细胞被激活,活化的T 细胞释放分泌γ 干扰素,刺激巨噬细胞释放一氧化氮、过氧化物和肿瘤坏死因子(TNF),导致胆管上皮细胞进一步损伤,由此再释放隐蔽抗原或新抗原,导致免疫瀑布的持续激活,并最终导致肝外胆管的进行性纤维化。

4.细胞因子的异常

多种细胞因子参与了胆管炎症和肝纤维化的发生和发展过程。

(1)HMGB1、RAGE 及NF-кB:

在围生期,病毒感染引起肝细胞及胆管上皮细胞的损伤和炎症,激活细胞核内的HMGB1 基因,释放HMGB1。 HMGB1与其受体RAGE 结合,继而激活p38 丝裂原活化氧自由基、蛋白激酶(MAPK)等,继续激活NF-кB,启动其介导的相关炎性因子(如TNF-α、iNOS、IL-1等)表达,同时活化的NF-кB 又可正反馈作用于HMGB1 及RAGE 基因,强化炎症反应,使炎症反应持续扩大,最终可能导致失控性炎症反应。

(2)TNF-α:

TNF-α 是BA 发生的关键性细胞因子。 细菌、病毒感染、免疫复合物、化学药物等因素可导致库普弗细胞大量释放TNF-α,参与肝损伤过程;另外,TNF-α 通过激活肝星状细胞等间质细胞分泌TGF-β1 等,促进细胞合成大量的胶原等细胞外基质(ECM),加重肝纤维化。 另外TNF-α 与其他细胞因子如TGF-β1、PDGF 及IL-1 等形成调节网络,不仅对肝纤维化的启动及调控起重要作用,同时也是介导肝损伤的主要终末介质。 因此,部分学者认为,TNF-α 的表达水平与肝纤维化程度呈正相关,可作为反映肝纤维化程度的重要监测指标。

(3)转化生长因子β(TGF-β):

是最强力的促纤维化因子,根据分子结构的差异可分为TGF-β1～β5,其致病性主要表现在以下几个方面:①患儿Kupffer 细胞、胆管上皮细胞、肝星形细胞和肝细胞大量表达TGF-β1;②术后虽然黄疸消退、肝功能恢复正常,血清TGFβ-1 水平仍明显高于终末期需肝移植的患儿;③Kasai 手术时发现肝实质细胞和胆管上皮细胞强烈表达TGF-β 受体Ⅰ、Ⅱ,灶性表达TGF-β,而终末期患儿所有上述的表达均降低,说明TGF-β 主要是在肝纤维化早期阶段起作用。 因此,血清TGFβ-1 水平可以作为胆道闭锁术后是否存在进行性肝纤维化的可靠指标。

(4)结缔组织生长因子(CTGF):

CTGF 与TGF-β1 关系密切,直接由TGF-β1 诱导,是TGF-β1的下游反应元件,具有比TGF-β1 更为广泛的生物学活性。 不仅可促进HSC 活化、转化、增殖及迁移,且可促进ECM 基因表达,参与肝纤维化形成。

(5)Fas 和FasL:

Fas 又称AP0-1 或CD95,是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白分子,属于TNF 和神经生长因子(NGF)受体超家族,可见于激活的T 细胞、NK 细胞、B 细胞等。 Fas 和FasL 在所有BA 肝组织内均有表达,Fas 多数呈强阳性,FasL 表达强度较低。Fas 和FasL 结合后,向细胞内传递死亡信号,诱发胆管上皮细胞和肝细胞凋亡,阻断这些过程可能会减轻BA 肝损伤和纤维化。

(6)上皮间充质化:

上皮间充质转化(epithelium mesenchymal transition,EMT)与组织器官慢性纤维化关系密切,EMT 过程持续存在,可造成组织器官纤维化和硬化。 部分研究提示,在BA 胆管上皮组织中,EMT 持续存在,胆管上皮细胞逐渐丧失原有特性,逐渐表现出间充质细胞特性,一系列重要的细胞因子CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3 和Hes-l等参与了这一重要的病理过程。

(二)胆道闭锁的生物治疗策略

如何在Kassi 术后防止肝内胆管的进行性损伤、最大限度地保存原有的肝脏功能,是胆道闭锁治疗过程中十分重要的环节。 随着对发病机制研究的深入,人们正在通过动物实验,一方面通过控制的细胞凋亡、调节细胞因子等方面控制胆管的炎症,保持胆汁引流通畅,另一方面是调控TGFβ-1、PDGF 等细胞因子的基因,治疗和控制肝纤维化,改善胆道闭锁的预后,但目前尚未应用到临床。

四、肝移植

广义的肝移植包括脏器移植、肝细胞移植以及肝细胞的基因治疗。 目前开展得最多、也是最成熟的是肝脏器官移植,肝细胞移植刚进入临床试验,而肝细胞基因治疗尚处于实验研究阶段。

(一)肝脏器官移植

随着日臻成熟的手术技术、组织配型和免疫抑制剂治疗,肝脏器官移植的成功率有了很大提高,肝移植已成为外科常规手术。 但在移植病例数迅速增多的同时,移植物无功能正成为重要的并发症。 诸多研究显示,缺血-再灌注损伤(I/R)是移植物早期无功能的重要原因,在I/R 时期,有明显移植肝细胞凋亡的证据,凋亡程度与移植肝无功能呈正相关。如能抑制移植肝脏的细胞凋亡或促进肝细胞的再生,可望减少移植肝脏无功能的风险。

1.抑制移植肝细胞凋亡

肝细胞的凋亡受P53、Fas、Myc、Bcl-2 等基因家族的调控,其中Bcl-2是主要的抑制基因。 Bax 基因是同一细胞内Bcl-2的同源基因,二者相互拮抗。 Bax 蛋白与Bcl-2 蛋白结合后形成二聚体,可使Bcl-2 失活,即触发凋亡过程。 动物实验现已证实,如在移植前导入带有Bcl-2基因的腺病毒,则可明显抑制移植肝的细胞凋亡,促进移植肝的存活。 实验还证实,Fas 受体(又称CD95 或APO-1)、TNF1 和TNF2 受体、APO-2、APO-3、DR-4(死亡受体-4)和TGF-β 受体等均可参与肝细胞的凋亡过程。 在肝移植方面,Fas 和TNF 受体的研究较多。 结果表明,Fas 受体-配体系统是激发肝细胞凋亡的最主要的受体介导途径,Fas 受体与配体结合后,激活凋亡酶-8(Caspase-8),进而导致Caspase-3 的激活和一系列的凋亡级联反应,通过钙离子非依赖的形式诱发凋亡;还发现TNF-R1 与TNF-α 结合后,同样可激发“凋亡级联反应”。 这些研究为防治移植肝无功能提供了新的思路。

2.促进肝细胞的再生

在成熟的肝脏组织中,有部分细胞停留于G0 或S 期,处于休眠态。 肝叶切除术后,休眠细胞很快便恢复增殖能力,24～48 小时即可检测到DNA 的复制,经复杂的增殖后,形成肝脏特异性细胞,发挥肝脏功能。 另外移植肝实质细胞通过释放一些细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6 等,促进肝细胞的再生。 在这些细胞因子的作用下,转录因子如核因子κB(NF-κB)、信号转导和转录激活因子-3(STAT3)的表达量增加,启动肝细胞再生。如对TNF-R 缺陷的小鼠进行同种基因的肝移植,肝细胞中NF-κB、STAT3 不能相应升高,肝细胞的再生受到抑制,肝移植的成功率较对照显著降低。 试验证明,随着缺血和低温保存时间的延长,移植肝细胞中TNF-α、IL-1、IL-6 的表达量增加,NF-κB、STAT3的表达水平升高,肝细胞的再生增强。 此外,有研究表明,术前给予丙酮酸乙酯预处理可显著降低血清中炎性细胞因子TNF-α 和IL-6 的水平,从而对大鼠肝移植缺血再灌注损伤起保护作用。 但值得注意的是,细胞中TNF-α、IL-1、IL-6 的水平往往与细胞的炎症反应和免疫反应有关,肝细胞的再生、炎症反应和免疫反应三者之间的关系尚待进一步的研究。

(二)肝细胞移植

包括肝细胞的分离和培养、增殖、保存和基因修饰四项基本技术。 细胞移植主要有经肝、经脾和经腹膜腔三种途径。 对于因各种限制无法立即施行脏器移植的肝衰竭患者,肝细胞移植可改善肝功能,从而帮助患者度过肝衰竭的危险期。 在多年的实验研究基础上,该技术已应用到临床,至今有50 余例患者接受了自体和异体肝细胞移植,治疗的初步结果令人鼓舞。

由于肝细胞的培养和保存比较困难,而且会在数天内很快失去原有的特异性功能。 目前,最好的长期储存人肝细胞的方法是冷冻储存,但冻存液的组成、冻存及复苏方法等因素均会影响肝细胞的功能。 为克服这一难题,有学者运用基因克隆技术导入适当的原癌基因例如猿病毒40 大片段T-抗原基因,建立了类似永生化的肝细胞株。 经分析,该细胞株具有部分肝细胞的特异性功能。 实验还显示,将这种永生化肝细胞株移植到几种肝衰竭的动物模型内,80%的动物得以存活,而未行移植的动物在60小时后无一生存。 为了将永生化肝细胞的增殖和分化活动控制在适宜的范围之内,有学者试图在这种肝细胞内导入温控性基因,亦有人先在引起永生化的基因两侧设计特异性酶切位点,在永生化细胞株建立后,再通过基因剔除方法将永生化基因去除,所得细胞则能表现出更多的肝细胞特异性功能。 这些控制永生化肝细胞增殖的设想,已由动物实验得到证实。

应该看到,肝细胞移植例数还很有限,适应证尚不明确,方法欠成熟,临床疗效亦缺乏统计学检验的支持。 在临床广泛应用以前,还需解决移植所需的最低细胞数量、最适移植途径和时机等难题。

(三)肝细胞的基因治疗

由于遗传性肝病是理论上最符合进行基因治疗病例,有关实验研究多集中于此。 基因治疗最关键的问题是选用合适的基因转移方法,较普遍的是病毒载体和受体打靶法。 目前,基因治疗的转载体一般采用莫洛尼白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MLV)和人类免疫缺陷病毒,通过基因导入的方法在体外改变自身肝细胞的基因结构,然后再将肝细胞移植回输入体内,以期达到治疗目的。

五、肝脏恶性肿瘤

(一)肝母细胞瘤

肝母细胞瘤是小儿常见的肝脏恶性实体瘤,占小儿肝脏恶性肿瘤的2/3,是一种胚胎性肿瘤,恶性程度较高,好发于婴幼儿。 大量研究表明,基因异常与肝母细胞瘤的发生、发展和预后密切相关。

1.染色体数目和结构的异常

研究发现,肝母细胞瘤细胞的染色体大多为双倍体或多倍体,染色体的变化主要集中在1、2、8、20 号染色体,最多的表现为2 号和20 号染色体三体,部分伴有1q 和2q 的结构异常;微卫星标记技术和多态性分析技术显示,肝母细胞瘤常有1p 和11p 杂合丢失现象,丢失的部位为1p36 和11p15.5;亦有报道运用比较基因杂交法(comparative genomic hybridization,CGH)将肿瘤和匹配DNA 进行荧光标记,通过杂交的方法进行基因组DNA 的全貌分析,发现肝母细胞瘤常有1q、2q和20q 的重复,但染色体的不平衡性较为少见。

2.β-catenin 原癌基因的激活

原癌基因是细胞中本来存在的基因,常与细胞的生长、增殖和细胞的信号转导有关,是维持细胞正常生理活性必不可少的基因,正常情况下其活性被控制在一定的范围之内。 当原癌基因发生突变后,其活性显著增加,导致细胞生长失控,最终发生癌变。 β-catenin 基因是原癌基因的一种,表达产物是一种多功能蛋白,在信号转导过程中发挥重要的作用,该基因的过度表达与细胞的癌变和永生化有关。 有人发现,肝母细胞瘤细胞可存在β-catenin 基因的突变,DNA 测序显示突变位点位于GSK3-β 基因,突变使得　β-catenin 基因更加稳定,细胞的分裂和增殖能力增强,而凋亡过程受到抑制,认为该突变在肝母细胞瘤的发病机制中起重要作用。

3.抑癌基因P53 和RECK 基因

研究表明,几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活。 肿瘤抑制基因P53 是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,也是目前研究最广泛和深入的抑癌基因。 基因突变是其丧失正常功能的最主要方式。 由于P53基因点突变,直接的后果是导致氨基酸的改变,最终产生没有活性的P53 蛋白,失去抑癌作用。 研究证实肝母细胞瘤的发生与P53 蛋白异常表达有关,肝母细胞凋亡与增殖平衡调控异常在肝母细胞瘤的发生、发展中可能起重要作用,突变型P53 蛋白均具有抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,诱发细胞瘤变。

RECK 基因是近年发现的新型基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。 其可在转录后水平抑制多种MMP的表达,抑制肿瘤血管形成,从而抑制肿瘤的侵袭及转移。 RECK 基因定位于9p13-p12。 相关研究认为,RECK 蛋白对肝母细胞瘤的侵袭转移具有抑制作用,其机制与降低膜型基质金属蛋白酶-1 的表达有关。

4.肿瘤血管生长因子(VEGF)

肿瘤血管生长因子(VEGF)是目前已知最强、特异性最高的促血管内皮细胞的生成因子,与肝母细胞瘤的发生、浸润、转移及预后之间的关系密切。 通过对VEGF 及其受体KDR、EG2VEGF 在肝母细胞瘤中作用机制的进一步研究,从分子水平可以预测肿瘤的侵袭、转移和复发,为防治肿瘤的转移和复发赢得时间。

5.遗传物质异常与肝母细胞瘤预后之间的相互关系

有学者通过56 例肝母细胞瘤的分析和随访,发现分化程度较低的胚胎性细胞是预后不佳的主要相关因素,而该类肿瘤常合并细胞染色体的缺失和异位,还发现β-catenin 基因突变与肿瘤的分化程度相关。 但另有研究显示,染色体异常与肝母细胞瘤的临床及生物学特性并无确定的关联。 迄今尚缺乏与肝母细胞瘤的预后明确相关的遗传学标志物。

(二)肝细胞癌

是最多见的肝脏恶性实体肿瘤,主要集中在东亚、东南亚和非洲地区。 其发病与乙型和丙型肝炎病毒(HBV 和HCV)感染、黄曲霉素(AFB1)污染等因素密切相关。 病毒感染和黄曲霉素污染造成抑癌基因的失活,构成了肝细胞癌的分子病理基础,其分子病理学异常主要包括以下几种:

1.P53 基因突变

P53 基因是一种抑癌基因,位于人染色体17p13,全长16～20kb,该基因的表达产物通过抑制细胞DNA 的合成而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。 在肝细胞癌标本中,P53 基因突变率介于30%～60%之间。 突变的特点表现在:①以点突变为主要方式,较之中分化和高分化者,低分化性肝细胞癌具有更高的突变率。 ②与AFB1 的暴露关系密切,突变率与AFB1 的高暴露率呈正相关。③在不同人群中突变位点常不一致,非洲南部和中国由于均为高AFB1 高暴露地区,P53 基因的突变基本恒定发生在第249 密码子,表现为G-T 转换,编码P53 蛋白的精氨酸被丝氨酸所替代;而同为亚洲地区的日本和泰国,虽然亦是肝癌高发区,由于为AFAB1 的低暴露区,P53 基因突率较低,并很少有P53 第249 密码子突变的报道。

2.Rb 基因变异

Rb 基因亦属抑癌基因,位于13 号染色体,所表达的Rb 蛋白主要起抑制细胞增殖的作用,Rb 基因的缺陷可导致细胞的无限制性生长。 肝细胞癌中Rb 基因的杂合丢失率介于25%～44%,合并有P53 基因突变时,其丢失率为80%。

3.P16 基因变异

是一种多肿瘤抑制基因,其抑癌重要性大于P53 和Rb 基因。 P16 基因位于人类第9 号染色体短臂2 区1 带区域(9p21),全长8.5kb,包含2 个内含子和3 个外显子,编码分子量为16kD 的蛋白质。 该基因的缺失和突变与多种肿瘤的发生有关。 研究发现,在肝细胞肝癌标本中20%～30%存在P16 基因种系突变,80%的肿瘤标本中检测不到P16 蛋白,而在癌旁组织中,P16 蛋白的表达正常,推测P16 的基因缺陷与肝细胞癌的发生有关。

4.DAB2IP 基因异常

研究发现,在人类肝细胞癌(HCC)中,存在DAB2IP 启动子5’区域的异常甲基化,并伴有转录水平下调和失活,治疗后其表达可恢复,DAB2IP 的这种再激活与启动子的去甲基化有密切关系。 研究还发现,DAB2IP 启动子m2b 区域甲基化情况与HCC 的进展相关,与邻近的正常组织相比,早期肿瘤的启动子甲基化率较高,因此,DAB2IP 可作为HCC 进展期的标志物。

5.HBV 的致癌作用

HBV 基因可与人的基因发生整合而产生致癌作用。 病毒DNA 与人的基因整合是随机的,整合后的HBV 基因产物可激活基因启动子,或激活c-jun 和c-fos 等原癌基因,促进肝细胞癌的发生。 HBV 基因产物还可与P53 蛋白相结合,抑制其抑癌功能,从而间接发挥促癌作用。

(三)肝脏血管肉瘤

是一种较少见的肝脏恶性肿瘤,儿童的发病率较成人低。 成人肝脏血管肉瘤的发生可能与长期接触有毒化合物有关,如长期接触聚氯乙烯等化合物,可致基因组DNA 损伤,诱发Ki-ras 基因和P53 基因突变,诱导细胞发生癌变。 对小儿肝血管肉瘤病因而言,目前尚未找到分子生物学证据,曾有病例分析提示,该肿瘤可能与母体妊娠期服用雌激素有关。

六、胆管恶性肿瘤

(一)胆管癌

包括肝内和肝外胆管癌,是胆道系统常见的高度恶性肿瘤。 有关胆管癌基因的研究主要集中在细胞原癌基因异常激活和抑癌基因失活方面。

1.细胞原癌基因的异常激活

大量的研究认为,与胆管癌有关的原癌基因主要是k-ras 和c-erbB-2 基因,与临床病理和预后的关系如下:

(1)k-ras 基因:

据文献报道,肝内、外胆管癌kras 基因的点突变率分别为50%和60%～70%,两者差异不大。 突变部位主要在第12、13 和61 密码子,以第12 密码子突变的发生率最高。 一般只有一个位点发生突变,偶见两个或三个同时发生,突变类型为G-A、G-C、G-T 和A-T 等。 大宗病例分析表明,该基因的突变与患者的性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、临床分期和组织学类型无关,由此推断k-ras基因突变发生在胆管癌变的早期阶段。

(2)c-erbB-2 基因:

属Src 癌基因家族,定位于染色体17q21,产物为P185 蛋白,与表皮生长因子受体(EGFR)同源。 免疫组织化学法分析显示,中、低分化组胆管癌细胞的P185 阳性率为81%,高分化组为37%,阳性患者的平均生存时间较短,因此可将P185 作为胆管癌的预后指标之一。

2.抑癌基因的失活

与其他恶性肿瘤类似,P53 和P16 两种抑癌基因亦是胆管癌的研究重点和热点,并发现有较高的突变率。

(1)P53 基因:

有学者分析胆管癌P53 点突变情况,日本和泰国两地突变率相似,分别为33%和35%。 我国为35.7%～47.6%,其中未分化组高于低分化和高分化组,提示P53 突变与胆管癌的分化程度有关,Ⅲ期胆管癌患者平均生存期,P53 突变阳性组为10.2 个月,而阴性组为34 个月,可见P53 基因突变患者预后欠佳。

(2)P16 基因:

在原发性胆管癌中,与P53 和K-ras 相比,P16 基因的突变率较高,但与肿瘤的分期、分化程度以及部位没有明显的相关性,推测该基因的突变可能发生在肿瘤形成的早期阶段。

(二)胆管横纹肌肉瘤

横纹肌肉瘤是小儿最常见的一种软组织肉瘤,偶可发生在胆管系统,其生物学性状与其他部位的横纹肌肉瘤相似。 目前的研究认为,某些抑癌基因的失活在肿瘤的发生和发展过程中起主要作用,以P16 的基因异常表现尤为明显。 有人运用聚合酶链反应-单链构相多态性分析(PCR-SSCP)分析横纹肌肉瘤组织中P16 基因,发现其纯合缺失率为37.8%,突变率为5.5%,并发现其外显子有因甲基化而失活的现象,P53 基因亦有很高的突变率。 抑癌基因异常的患者,肿瘤的恶性程度高,广泛转移早,预后较差。

七、胰腺癌

胰腺癌是一种高度恶性的疾病,至今5 年生存率仍小于5%。 原癌基因和抑癌基因异常同样与胰腺癌的发病和预后密切相关。

(一)原癌基因的突变

近年的研究表明,胰腺癌是一种基因病,与K-ras、c-erb-B2 等原癌基因的突变有密切关系。 研究发现,患者的K-ras 基因突变率在90%～95%,突变的部位大多在第12 密码子,且为点突变。 K-ras 基因属膜相关GDP 家族系列,突变使细胞信号转导异常,可导致细胞生长失控,诱发癌变的产生。

(二)抑癌基因的变异

据文献报道,胰腺癌的手术标本的P53、P16、DPC4 等抑癌基因都有很高的突变率,P53 基因突变检出率在58%～100%之间,平均检出率为70%,大部分的突变为A-T 和C-G 之间的转换;P16 基因主要表现为杂合丢失,约为80%;DPC4 基因位于17p,编码一种DNA 结合转录因子,能抑制细胞分裂和促进细胞凋亡,研究提示该肿瘤中有该基因的失活。

八、先天性胆管扩张症

先天性胆管扩张症又称胆总管囊肿,是小儿常见的胆道畸形,未经处理或处理不当常有很高的胆系癌变率。 运用细胞分子生物学技术揭示其癌变机制是目前引人注目的课题。 胆总管囊肿癌变与机体的如下变异有关:

(一)Ki-ras 基因的变化

曾有研究发现,胆总管囊肿患者发生胆囊或胆管乳头状瘤时,胆系黏膜上皮不但呈增生活跃状态,而且出现Ki-ras 原癌基因的点突变。 由于乳头状瘤是胆系癌前病变之一,推测胆管扩张症癌变可能与Ki-ras 基因突变或变异有关。 亦有学者检查9 例合并胆囊癌的患者,发现4 例的肿瘤组织或不典型增生黏膜组织有Ki-ras 基因突变。 国内亦有报道,胆总管囊肿囊壁组织的Ki-ras 突变率为13.3%(4/30),突变位点位于第12 密码子,突变率虽低,但也同样提示Ki-ras 原癌基因在胆管扩张症癌变机制中的重要性。

(二)P53 基因的突变

研究结果显示,P53 基因突变仅在不典型增生和肿瘤组织中有较高的发生率,而在化生的肠上皮和增生不良的组织中突变率较低,推测在癌变过程,该抑癌基因的突变参与胆管黏膜细胞向不典型增生和癌变的发展,P53 基因突变可能是胆管癌的高危因素。 另外,先天性胆管扩张症的患者,在长期胰液反流和慢性炎症的刺激下,发生P53 等位基因的丢失和P53 基因蛋白的过度表达,参与了胆管癌的发生。

(三)其他

最近发现胆道扩张症患者胆系黏膜具有很多癌前期病变的特征:胆囊上皮细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)阳性率增高,嗜银性核仁组织区(AgNOR)计数增多,均反映胆系黏膜增殖活性增强。 与癌变有关的黏蛋白核心蛋白1(Muc1)呈持续表达。 检测还发现,微卫星不稳定性检出率增加,并伴有TGF-β2、IGF2 受体基因突变率以及hMSH2 和hMLH1 等位基因杂合性缺失率的明显提高,提示微卫星不稳定性在先天性胆管扩张症患者胆系黏膜癌变中亦起重要的作用。

九、慢性胰腺炎

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)又称慢性复发性胰腺炎,是一种以胰腺组织渐进性炎症和进行性纤维化进而导致胰腺内、外分泌腺组织受损和胰腺导管不规则扩张为主要特征的疾病,最终导致胰腺组织和(或)胰腺功能不可逆性损伤,常伴有胰腺导管内结石或假性囊肿形成。 慢性胰腺炎有多种病因,但临床表现相似,且有类似的分子病理学基础。 临床主要表现为顽固性或反复发作性腹痛、腹泻、消瘦、黄疸、腹部包块和糖尿病等。

(一)胰蛋白酶原基因突变

慢性胰腺炎的研究发现,胰蛋白酶原基因PRSS1 基因3 号外显子存在c.369C→T 杂合性突变,改变了胰蛋白酶原基因上Ca2+的结合位点,胰蛋白酶原被激活,导致胰腺的自身消化,引发胰腺炎。对慢性胰腺炎患者的基因筛查还发现,胰蛋白酶原的编码基因至少还有以下几种突变:A16V、K23R、P36R、G83E、V123M,这些基因突变在慢性胰腺炎发病过程的具体作用尚有待研究。

(二)胰酶抑制物(PSTI)编码基因(SPINK-I)突变

腺泡内胰酶抑制物(PSTI)是胰酶自身消化的重要抑制物质。 丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal Ⅰ型(serine protease inhibitor Kazal typeⅠ,SPINK-Ⅰ),是最近发现的与慢性胰腺炎相关的一种胰蛋白酶抑制剂,对抗激活的胰蛋白酶,起到保护腺泡的作用。SPINK Ⅰ基因突变可阻断SPINK Ⅰ前体进入内质网管腔,使SPINKⅠ蛋白表达减少,最终使抑制胰蛋白酶功能降低,可能是慢性胰腺炎的主要致病因素。Lempine 等学者研究发现慢性胰腺炎患者存在SPINK-Ⅰ基因的N34S 和P55S 突变。

(三)CFTR 基因突变

囊性纤维化跨膜转运调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator,CFTR)位于胰腺导管的上皮细胞膜上,为cAMP 调控的氯离子通道,对胰液有碱化和稀释的作用,该基因突变的结果可导致胰酶的分泌受阻。 有些慢性胰腺炎患者并无胰蛋白酶原基因和胰酶抑制物编码基因异常,据认为CFTR 基因的突变可能是这些患者的发病基础。 当CFTR 基因突变时,由于功能不全,HCO3-的分泌障碍,导致分泌液pH 下降。 酸性环境在引起组织炎症损害的同时,还会导致胰酶分泌及激活的异常,最终导致胰腺的纤维化及功能不全。 目前,国内外学者已经认识到了CFTR 的重要性,开始了CFTR 基因常见突变及多态性与慢性胰腺炎相关性的研究,但尚存争议。

(四)其他

与慢性胰腺炎发病相关的基因突变还包括α1-抗胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、肽链端解酶等基因缺陷,但其在慢性胰腺炎发病中的重要性有待进一步的研究。

十、遗传性胰腺炎

遗传性胰腺炎是一种常染色体显性遗传病,具有80%的外显率,提示单基因的突变可导致胰腺炎的发生。 据人类基因图谱分析,已找到胰蛋白酶原基因的全长DNA,定位于7q35,有两个遗传性胰腺炎相关性的点突变。 一个突变点位于第3 外显子,密码子CGC 被CAC 所替代,另一个位于第2 外显子,AAC 被ATC 所替代,突变的结果使胰蛋白酶原易被激活,从而导致胰腺炎的发生。

正像其他医学学科一样,分子生物学方法在小儿外科的应用尚集中在疾病发病机制和诊断方面,而利用分子生物学方法进行治疗,特别是进行基因治疗还处于动物实验甚至是离体细胞的体外培养方面,真正应用到临床还有较长的一段距离,但相信随着分子生物学技术的发展,该技术能为小儿患者带来福音。