第二节　NK细胞的发育分化

1975年就发现无胸腺小鼠与正常小鼠来源的脾细胞对靶细胞有相同的杀伤水平，表明NK细胞发育分化不依赖于胸腺，具有独立于T、B细胞之外的发育途径。HSC在骨髓分化成早期淋巴前体细胞(early lymphoid progenitors，ELP)，进一步分化为共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor，CLP)。CLP再进一步成熟分化，依序分别为NKp、iNK细胞和mNK细胞。目前认为iNK细胞可能已经具备某些免疫学功能，尤其是在iNK细胞向mNK细胞分化过程中，NK细胞受体与自身MHCⅠ类分子相互作用是促进NK细胞功能成熟与维持自身耐受的关键。

成年人外周循环NK细胞总量保持在2×109，其平均寿命较短。因此，NK细胞的发育分化始终处于活跃状态。维持NK细胞发育分化的各种因素就成为研究的主要内容。IL-15在NK细胞发育分化的整个过程中担负重要角色。IL-15缺陷、IL-15Rα缺陷和IL-15Rβ缺陷均导致NK细胞数目和功能异常，其中NK细胞不能获得足够的识别受体谱是主要环节。淋巴毒素α(LTα)缺陷和淋巴毒素β受体(LTβR)缺陷对NK前体细胞的发育的影响十分明显，导致出现IL-15缺陷同样的结果。TGF-β是NK细胞分化扩增的重要负调控细胞因子，TGF-β的缺失可导致机体NK细胞大量扩增，使机体NK细胞的稳态失衡。

一、小鼠NK细胞发育分化

2002年美国Yokoyama研究小组曾应用CD122、NK1.1和DX5三种抗体将小鼠NK细胞发育粗分为三个阶段(可细分五个阶段)［1］：前体阶段(CD122+NK1.1-DX5-)、受体获取阶段(CD122+NK1.1+DX5-)和成熟阶段(CD122+NK1.1+DX5+)。由于CD122+NK1.1-DX5-细胞是异质性前体细胞，仅有少部分能定向发育成NK细胞，后续研究采用Lin-CD27+CD244+CD122+Flk2-作为更准确的NK细胞前体阶段的划分标志。此外，学者们对于NK1.1+NK细胞的划分存在较多分歧，主要还涉及基于NKp46、CD27、CD43、NKG2D等不同分子标志的划分方式。

(一)以CD27/CD11b为划分标志将NK细胞发育分化分为四个阶段

CD27是二硫键连接单体组成的二聚体跨膜糖蛋白，是TNF受体超家族(TNFRSF)成员之一。由于NK细胞从初始阶段(NK1.1+CD3-DX5-)开始持续表达CD27，因此根据NK1.1+NK细胞发育的某个特定阶段CD27的不同表达水平，可以将NK细胞分为两个亚群：CD27hiNK细胞与CD27loNK细胞。CD11b是一种黏附分子，不成熟NK细胞表型大多数为CD11blo，成熟NK细胞表型大多数为CD11bhi。CD27分子联合CD11b可以将NK细胞划分为CD11bloCD27lo、CD11bloCD27hi、CD11bhiCD27hi、CD11bhiCD27lo四个亚群。小鼠NK细胞在体内沿着CD11bloCD27lo→CD11bloCD27hi→CD11bhiCD27hi→CD11bhiCD27lo路径分化发育。这些NK细胞亚群处于不同分化发育阶段，并且表型、功能、组织分布也各具特点。

(二)以NK1.1/DX5为划分标志将NK细胞发育分化阶段为不同阶段

由于小鼠NK1.1表达有种系限制，某些种系小鼠无NK1.1表达(例如Balb/c鼠)，NK1.1作为NK细胞标志受到挑战。几乎所有品系的小鼠NK细胞都可以被DX5单抗标记，被认为能够更有效的鉴定小鼠NK细胞。研究发现，DX5与NK1.1标记NK细胞并不完全重合，存在DX5+NK1.1+CD3-细胞以及DX5-NK1.1+CD3-细胞，前者目前被称为经典NK细胞，后者称为DX5-NK细胞。DX5-NK细胞对YAC-1细胞的杀伤能力较低，分泌细胞因子能力也较弱，表现出Ly49-NKG2Ahi等不成熟表型，故一直认为它可能是一群不成熟的NK细胞亚群，可再进一步发育为DX5+NK细胞。然而，近期研究提示DX5-NK细胞是异质性的细胞群体，包含DX5-Eomes-组织驻留NK细胞，这群细胞在稳态下不向DX5+NK细胞方向分化，是一群有别于经典NK细胞的独立亚群；而DX5-Eomes+NK细胞则是不成熟的经典NK细胞，可进一步获得DX5的表达。DX5+NK细胞上调表达Ly49受体后，进入扩增阶段，CD43和KLRG1的高表达则标志着处于终末成熟阶段的NK细胞。

二、人类NK细胞发育分化的阶段

美国Caligiuri研究小组在2013年提出应用CD117、CD161、CD94、CD56等抗体将人类NK细胞发育分为五个阶段［2］：CD34+CD45RA+CD10+CD117-细胞为stage1，具有向NK细胞、T细胞和DC分化的潜能；stage 1细胞下调 CD34，上调 CD117，成为 stage 2细胞(Lin-CD34dimCD45RA+α4β7brightCD117+CD161+/-CD94-)，并获得对IL-15信号应答的能力；stage 3细胞表型为Lin-CD34-α4β7-CD117+CD161+CD94-，能发育成mNK细胞，不再具有T细胞和DC发育潜能，因而也被称为iNK细胞阶段；mNK细胞包括stage 4和stage 5细胞，分别为CD56brightNK细胞(Lin-CD34-CD117+/-CD94+CD16-)和CD56dimNK细胞(Lin-CD34-CD117-CD94+/-CD16+)，这两群NK细胞在表型、功能和组织分布上各具特点。

(一)以CD56为划分标志将成熟NK细胞划分为两个亚群

人类NK细胞可根据表达CD56分子的表面密度而将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两个亚群。CD56dimNK亚群占外周血NK细胞的90%，以杀伤功能为主；CD56brightNK细胞亚群占外周血NK细胞的10%，具备对细胞因子的增殖应答能力，以分泌细胞因子为主。尽管小鼠NK细胞与人类NK细胞在很多方面具有相似性，但是小鼠NK细胞没有CD56同源物的表达，因此小鼠NK细胞和人类NK细胞生物学功能难以精确比较。

(二)以CD27为划分标志将NK细胞划分为不同亚群

将CD27和CD56联合标记相对于经典CD56单独标记可以更加精细区分人类NK细胞亚群。人类外周血NK细胞大多数是CD27loNK细胞，这些细胞均为CD56dimNK细胞。CD27hiNK细胞虽然既有CD56bright NK细胞，也有CD56dimNK细胞，但CD56brightNK细胞是CD27hiNK细胞的主要群体。CD27分子作为人类NK细胞亚群划分标志将会有助于更好理解小鼠和人类NK细胞间联系。关于CD11b对于人类NK细胞亚群划分的研究报道较少。

与小鼠NK细胞亚群相似，人类CD27loNK细胞亚群对肿瘤细胞(K562)具有较强的杀伤活性。尽管NKG2D在人类NK细胞的各亚群上的表达量相似，但人类CD27hiNK细胞的NKG2D特异细胞毒活性较高，而颗粒酶表达量明显低于CD27loNK细胞。体外试验证明，人类NK细胞在PMA/ionomycin等刺激后，CD27hiNK细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平高于CD27loNK细胞亚群。

(三)以NKp46为划分标志将NK细胞划分为不同亚群

法国学者Vivier提出以CD122、NKp46和抑制性NK受体(inhibitory NK receptor，iNKR)(人：KIR；鼠：Ly49)为标志可同时划分人和小鼠的NK细胞不同发育阶段和成熟亚群(粗分为三个阶段)：前体阶段(CD122+NKp46-iNKR-)、未成熟 NK细胞阶段(CD122+NKp46+iNKR-)和成熟阶段(CD122+NKp46+iNKR+)，其中成熟阶段NK细胞可以再分为CD107ahiNK细胞和CD107alowNK细胞。这是首次明确采用一套方法对人和鼠NK细胞分化和亚群进行统一划分。

三、NK细胞发育分化的转录调控

NK细胞发育分化的核心问题是寻找决定CLP向NK细胞定向发育的转录因子。通过细胞转录组和蛋白组水平检测，辅以缺陷小鼠验证，已经发现了一系列决定NK发育分化的重要转录因子。

(一)E4BP4(E4-binding protein 4)

E4BP4又称白细胞介素3核因子(nuclear factor interleukin3，NFIL3)，尽管E4BP4对CD8α+DC的发育和T、B细胞功能有影响，但它仍是目前为止对NK细胞发育调节最为特异的转录因子［3］。E4BP4缺陷小鼠体内经典NK细胞几乎全部丧失，NKp数量明显减少，仅存在极少组织驻留NK细胞以及正常数量的CLP，提示着E4BP4在NK细胞早期发育过程中发挥了重要作用，最新研究发现E4BP4能直接结合到Eomes和ID2的基因位点上，促进其转录，从而调控NK细胞发育。此外，E4BP4也调控其他固有淋巴细胞(innate lymphoid cell，ILC)亚群的发育分化(如ILC2、ILC3)，对ILC共同前体的形成起到关键作用。

(二)T-bet和Eomes

T-bet是公认的Th1细胞分化的关键转录因子，驱动IFN-γ表达。Eomes是CD8+T细胞杀伤功能的决定因子。最新的研究表明，T-bet和Eomes是NK细胞发育成熟的重要调控点，其中T-bet主要调控组织驻留NK细胞和终末成熟的经典NK细胞生成，T-bet缺失导致以上两群NK细胞数量锐减；Eomes主要表达在经典NK细胞中，Eomes缺陷使得经典NK细胞缺失，而组织驻留NK细胞不受影响。T-bet的过表达能抑制Eomes，从而使Eomes-NK细胞增多。T-bet和Eomes联合缺失会致使NK细胞整体缺失，揭示了T-bet和Eomes在NK发育成熟过程中的协同作用［3］。

(三)ID2

ID2是E蛋白(E protein)的转录抑制子，造血干细胞过表达ID2会使其偏向分化为NK细胞，提示ID2在NK发育中的重要作用。ID2缺陷小鼠不仅外周NK细胞锐减，且缺失淋巴结和派氏结(Peyer’s Patches，PP)，提示除NK细胞外，ID2可能还是LTi细胞(lymphoid tissue-inducer cell)发育分化的重要转录因子。当ID2和E2A双缺陷时，NK细胞发育分化得到部分恢复，LTi细胞和淋巴结也能正常形成，说明ID2通过抑制下游的E2A转录因子来发挥作用。

(四)GATA-3

GATA-3是T细胞往Th2方向分化的关键转录因子，促进IL-4等细胞因子分泌。近来研究表明，GATA-3对NK细胞和其他ILC的发育也有重要作用。与T细胞中观察到的GATA-3与T-bet的拮抗作用相反，GATA-3缺陷的NK细胞表达T-bet水平下降，且IFN-γ分泌能力降低。造血干细胞特异性缺失GATA-3的小鼠中，包括胸腺NK细胞在内的CD127+NK细胞缺失，而经典CD127-NK细胞数量不受影响［4］。目前GATA-3在调控NK细胞发育中的具体靶点和作用阶段尚不清楚。

(五)其他转录因子

已知的其他可决定NK发育成熟的转录因子还包括PU.1、Krf1、Ets1、Helios和Blimp1等，但是这些转录因子大多数也是其他淋巴细胞发育的重要转录因子，缺乏针对NK细胞的特异性，发挥作用时相可能是在CLP上游；目前已鉴定的决定CLP向ILC前体细胞分化的转录因子主要包括E4BP4、TCF1、Tox、PLZF、GATA-3，这些转录因子的缺陷往往导致包括NK细胞在内的多个ILC亚群数量减少［2～7］；而真正决定ILC前体细胞向NKp定向发育的转录因子目前尚不明确。进一步的研究依然需要结合NK发育阶段表型变化及转录水平变化，综合判断寻找出NK细胞发育定向的关键性分子。

四、NK细胞的功能成熟与组织分布

从iNK细胞转变为mNK细胞的过程称为NK的功能成熟，主要指NK细胞杀伤活性及细胞因子分泌等功能的获得，伴随着相关NK细胞受体及表面标志的表达。根据NK细胞表型可以将NK细胞成熟过程进行划分，其中基于CD11b和CD27的划分标准在小鼠最为公认。小鼠NK细胞从不成熟到成熟共经历CD11b-CD27-、CD11b-CD27+、CD11b+CD27+和CD11b+CD27-四个阶段，其中后两个阶段NK细胞具有杀伤及IFN-γ分泌功能，并且大多分布于脾脏等外周器官中。人 NK细胞可根据 CD56表达强弱划分为CD56bright和CD56dim两个具有不同成熟度的群体，其中CD56brightNK成熟度较低，分泌细胞因子能力稍强，而CD56dimNK成熟度较高，杀伤能力较强。此外，过去认为iNK细胞高表达TRAIL、CD51，不表达NKG2D、DX5、CD11b、Ly49家族受体等，但随着近年来组织驻留NK细胞的发现，提示过去所认为的iNK细胞包含组织驻留NK细胞，需要借助转录因子的检测才能进一步区分开真正意义上的iNK细胞和组织驻留NK细胞。

五、NK细胞发育分化的几个热点问题

(一)NK细胞发育途径

了解NK细胞的发育分化途径是认识NK细胞发生起源的根本。尽管目前基本描绘出了NK细胞的初步发育途径，但是这些人为定义出的每个阶段是否对NK发育不可或缺依然无法定论。例如，在C-kit缺陷的小鼠中，CLP几乎完全丧失，而NKp和NK细胞发育依然能够正常进行。NK细胞作为ILC的主要成员，诸多报道发现NK细胞发育同其余ILC亚群之间存在交叉，且在CLP下游存在NK和其他ILC的共同前体，但共同前体发育出来的各ILC亚群功能上却存在显著差异；经典NK细胞在ILC发育路径上的分叉早于非经典NK细胞；这些现象折射出来的问题便是NK细胞和ILC亚群究竟是发育途径有所不同，还是在成熟或活化过程中由于不同环境因素所形成的不同状态；此外，非经典NK细胞在发育分化路径上更接近于ILC2、ILC3抑或是经典NK细胞，以及是否需要重新命名和归类尚需更深入地研究和探讨。

(二)NK细胞发育分化的转录调控

转录因子是决定造血免疫细胞定向分化和稳态维持的核心分子，由于NK细胞发育分化的转录调控研究起步较晚，有关NK细胞定向分化的转录调控路线尚不如T、B细胞明确。但随着近几年对NK细胞发育分化阶段的认识加深和各种转录因子缺陷小鼠的运用，在NK细胞转录调控方面取得了突破性的成果。目前已经发现一系列在NK发育阶段中发挥重要作用的转录因子，其中E4BP4、ID2、T-bet、Eomes等已经展示出对NK细胞发育分化的相对特异性，且这些转录因子的相互作用网络正逐步被揭示，如最近报道的E4BP4对ID2和Eomes的促进以及T-bet对Eomes的抑制作用。其他转录因子(PU.1、Krf1、Ets1、Helios、Blimp1和GATA-3等)也展现出对NK细胞分化的转录调控效应，但是对几乎所有淋巴细胞的发育分化均有影响，缺乏针对NK细胞的特异性，发挥作用时相可能是在CLP上游，也正因为转录因子对免疫系统作用的广泛性，转录因子缺陷小鼠观察到的现象不一定真实反映其本身对NK细胞发育的内在影响，也可能是通过其他细胞间接影响NK细胞发育。

(三)NK细胞成熟与驯化

NK细胞获得杀伤活性及细胞因子分泌等功能需要经历成熟驯化，这一过程伴随着相关表面标志的变化，如何界定iNK与mNK细胞仍然是一个挑战。尽管可以根据CD11b和CD27的表达大致将小鼠NK细胞划分为四个成熟过程(CD11b-CD27-、CD11b-CD27+、CD11b+CD27+和CD11b+CD27-)，但是前两个阶段的NK细胞既包含不成熟阶段的经典NK细胞，也包含组织驻留NK细胞；而后两个阶段NK细胞已经具有杀伤及IFN-γ分泌功能，主要为经典NK细胞，并且多分布于脾脏等外周器官中，因此，不同分化阶段的NK细胞的界定仍然不清。同样，人NK细胞可分为CD56bright和CD56dim两个具有不同成熟度的群体，但仍不能将成熟度较低的CD56brightNK细胞定义为人iNK细胞。此外，NK成熟过程的驱动因子同样是研究的热点，尽管一些研究证实IL-15、LTα等细胞因子对于NK成熟至关重要，其作用时相及靶点仍需进一步确认。NK细胞成熟过程存在的另一个重大问题便是iNK细胞是否具备功能。有研究表明iNK细胞具有一定的细胞因子分泌功能，其是否代表成熟阶段末期的NK细胞仍然不定。