第六节　记忆性NK细胞

一、NK细胞的免疫记忆功能

近期研究表明，NK细胞具有获得性免疫细胞的关键特征——免疫记忆功能。von Andrian教授、Lanier教授和Yokoyama教授三个实验室分别采用不同动物模型，证实NK细胞具有免疫记忆功能［17～20］。MCMV感染模型中，NK细胞具有获得性免疫应答所具备的抗原特异性细胞扩增、增殖减降、记忆维持及记忆应答等四个阶段，该动力学与记忆性T细胞的应答相似。小鼠NK细胞在半抗原刺激后同样能够产生抗原特异性二次应答，在T/B细胞缺陷小鼠(RAG2-/-或SCID鼠)可诱发接触性皮肤变态反应(经典DTH反应)；同时发现小鼠NK细胞可通过Ly49H受体对MCMV病毒产生记忆反应，表现为强烈的病毒清除能力和长期记忆功能；此外，还发现NK细胞受到细胞因子刺激后可以在体内外保持长期的对同样细胞因子的记忆反应。

记忆性NK细胞具有特定的表型：半抗原特异的接触性过敏反应模型(DNFB致敏模型)中，记忆性NK细胞主要来自于肝脏，该亚群主要集中于Thy-1+Ly49C-I+NK细胞中，其比例仅占肝脏NK细胞的10%。在DNFB致敏的T、B细胞缺陷的RAG2-/-鼠中NK细胞的迁移和黏附途径与正常鼠T细胞应答相似。MCMV感染模型中，Ly49H+记忆性NK细胞高表达Ly49H、KLRG1、CD43、Ly6C，低表达CD27。Ly49H+记忆性NK细胞在抗NK1.1抗体或Ly49H抗体的刺激下，IFN-γ的分泌量高于初始NK细胞，且抗NK1.1抗体处理后Ly49H+记忆性NK细胞的CD107a的表达水平明显增加。鉴于NK细胞不表达RAG蛋白，故推测NK细胞通过RAG非依赖的机制来识别特异抗原。尽管NK细胞的记忆样免疫特征产生的机制及其调控尚不清楚，但毫无疑问NK细胞记忆功能在机体抵御病原体入侵时扮演重要角色。

二、抗MCMV病毒的记忆性NK细胞及其特性

(一)针对MCMV病毒的记忆性NK细胞的发现

MCMV具有逃逸T和B细胞应答的机制，因此利用MCMV感染模型可以特异的研究NK细胞的免疫监视功能。C57BL-6小鼠的NK细胞表达Ly49H和Ly49P两种特殊活化受体，这两种受体能特异识别MCMV的M157和m04蛋白。2001年Arase等发现，小鼠Ly49H+NK细胞在病毒感染阶段发生扩增，并在感染控制后Ly49H+NK细胞数量下降。2002年Dokun等证明小鼠NK细胞表达的胚系基因编码的恒定受体Ly49H，可直接识别MCMV编码的m157蛋白。2009年Sun JC等发现这些MCMV致敏的NK细胞亚群在病毒感染后可在宿主体内维持两个月以上并具有“记忆性免疫应答”能力，初次感染40～50天后的Ly49H+NK细胞对再次感染仍可发生针对m157蛋白特异的Ly49H+NK细胞的大量扩增。Ly49H+NK的扩增依赖于m157蛋白。过继转输MCMV致敏的Ly49H+NK细胞在MCMV刺激下能够大量扩增，并且具有更强的病毒清除能力，产生相当于10倍的初始NK细胞的保护效果。提示记忆性NK细胞可以自我更新，长期存活，在病毒再次攻击后可引起二次应答，迅速脱颗粒和产生细胞因子。记忆性NK细胞在脾脏扩增可大于100倍，在肝脏大于1000倍［18］。

(二)针对MCMV病毒的记忆性NK细胞的特征

MCMV模型中Ly49H+记忆性NK细胞可特异性识别MCMV病毒糖蛋白m157并经历克隆样扩增。该增殖为抗原特异性，缺失m157的突变型MCMV感染小鼠不能引起Ly49H+NK细胞扩增。Ly49H+NK细胞转输至感染MCMV的受体鼠，在受体鼠淋巴组织及非淋巴组织观察到100～1000倍的记忆性NK细胞的增殖。这些自我更新的NK细胞在经过多次的过继转输和病毒感染后可进行二次甚至三次扩增。记忆性NK细胞在小鼠感染MCMV几个月后恢复到稳定水平且表现更强的效应性功能。体外条件下与相同数量的静息状态NK细胞相比，记忆性NK细胞对病毒的刺激发挥更有效的抵抗作用，证明病毒抗原预先感染NK细胞可引起二次记忆性免疫应答。

Sun JC等用MCMV感染小鼠，记忆阶段Ly49H+NK细胞的表面分子与对照组有所不同。Ly49H+记忆性NK细胞表面高表达KLRG1、CD43、Ly6C、Ly49H，低表达CD27，提示Ly49H+记忆性NK细胞比初始NK细胞更成熟。Ly49H+记忆性NK细胞低表达其他NK细胞活化受体，可能与其保持较低的活化阈值有关。记忆性NK细胞在转录水平上组成性高表达IFN-γ。MCMV感染模型中抗原特异性的记忆性NK细胞与记忆性T细胞的表型特征相似。

(三)针对MCMV病毒的记忆性NK细胞的功能

在MCMV感染模型中发现，记忆性NK细胞的IFN-γ分泌量低于初始NK细胞分泌量，但是在抗活化型受体如抗NK1.1抗体或Ly49H抗体的刺激下后，记忆性NK细胞IFN-γ的分泌量明显高于初始NK细胞。在MCMV感染小鼠模型中发现，Ly49H+记忆性NK细胞的CD107a的表达较初始NK细胞低，该NK细胞从体内分离后体外再次经抗NK1.1抗体处理后，Ly49H+记忆性NK细胞CD107a的表达量明显高于对照组。m157蛋白缺失型MCMV再次感染不能引起Ly49H+记忆性NK细胞的体内增殖，提示Ly49H+记忆性NK细胞的扩增具有严格的抗原特异性。然而记忆性NK细胞的抗原非特异性受体(如NK1.1)受刺激后，产生细胞因子的能力明显高于初始NK细胞。因此，记忆性细胞参与免疫应答不仅针对初次遇到的抗原发挥作用，而且亦可能在一些感染过程中以旁观者的模式发挥作用。

NK细胞在对MCMV的应答过程中可以非常活跃地增殖。利用正常骨髓细胞和DAP12-/-骨髓细胞混合转输的方式人为降低受害者初始Ly49H+NK细胞比例。他们发现这些细胞在对MCMV的应答过程中可以非常活跃地增殖(甚至可达900倍的扩增倍数)。当感染达到峰值即进入收缩期，一部分被MCMV刺激过的Ly49H+NK存活下来，而且保持效应细胞的各种特性。研究人员将经历过病毒刺激的Ly49H+NK细胞和正常小鼠的Ly49H+NK分别转输给新生免疫缺陷小鼠，并对其进行MCMV的感染，发现经病毒刺激过的Ly49H+NK细胞的保护作用约为未刺激过Ly49H+NK细胞的十倍。这种更强的保护作用归功于经历过病毒刺激的Ly49H+NK细胞更强的效应功能。

三、记忆性NK细胞介导皮肤迟发性超敏反应

(一)针对接触性皮炎半抗原的记忆性NK细胞的发现

迟发型超敏反应是研究免疫记忆的经典模型，接触性超敏反应(contact hypersensitivity，CHS)是诱发性迟发型超敏反应的一种。以往认为CHS是典型的T细胞介导的获得性免疫应答，但是近期发现无T、B淋巴细胞的Rag2-/-鼠和SCID鼠中，也可以诱发针对二硝基氟苯(DNFB)半抗原的接触性超敏反应［17］。这种反应可持续4周。并且当再次进行相同抗原感染刺激时，可产生与野生型鼠相似的记忆性免疫应答的发生。无T、B、NK细胞的小鼠不能产生CHS，但是转输了DNFB致敏的小鼠NK细胞后又可恢复产生CHS。有趣的是，经过分别转输肝脏、脾脏或多脏器混合的NK细胞，结果表明对半抗原具有特异性和记忆功能的NK细胞主要来源于肝脏。对于为什么只有肝脏NK细胞介导二次免疫应答以及引起该应答的受体-半抗原之间的相互作用尚需进一步研究。目前该类记忆性NK细胞产生的机理和介导NK细胞记忆功能的抗原特异性的受体尚不清楚。

(二)针对接触性皮炎半抗原的记忆性NK细胞的来源与表型特征

采用各种半抗原(例如DNFB、OXA、PC、FITS)分别在各种T/B细胞双缺陷鼠(Rag-KO C57BL-6、Rag-KO Balb-c、SCID Balb-c)和T/B/NK三缺陷鼠(Rag-KO-γc-KO B10、SCID beige Balb-c)诱导接触性超敏反应，更为准确证实了NK细胞可介导各种CHS反应。将来源于致敏小鼠不同免疫器官(脾脏、肝脏)的不同亚群NK细胞(NK1.1+、Thy1+NK1.1+、Thy1-NK1.1+、Thy1+NK1.1+CD27-、Thy1+NK1.1+CD27+、Thy1+NK1.1+Mac-1+、Thy1+NK1.1+Mac-1-、Thy1+NK1.1+Ly49C-I+、Thy1+NK1.1+Ly49C-I-)过继转输给未刺激的T/B/NK三缺陷小鼠，然后对受者小鼠进行半抗原免疫。根据小鼠是否发生接触性皮炎来确认介导记忆性免疫应答的NK细胞来源和表性。研究表明，具备该记忆功能的NK细胞只来源于肝脏，其表型为Thy1+NK1.1+CD27-Mac-1+Ly49C-I+。针对上述NK细胞亚群的抗体清除实验也辅证了上述结论。这些结果为深入了解记忆性NK的基本生物学特性提供了重要依据。

(三)针对接触性皮炎半抗原的记忆性NK细胞的迁移特征

NK细胞的免疫记忆反应具有获得性免疫的基本特征：抗原特异性与记忆持久性。通过流式细胞检测和激光共聚焦相结合，可以观察到二次半抗原免疫刺激RAG缺陷鼠时NK细胞向CHS局部的聚集。只有在相同抗原再次刺激时才能产生该CHS反应，对于其他无关抗原没有应答。初次半抗原免疫刺激RAG缺陷鼠数月后，这种抗原特异的免疫记忆仍能够维持。研究表明黏附分子参与CHS应答过程。NK细胞介导针对半抗原的接触性皮炎的基本免疫学过程可以归纳如下。表皮涂抹致敏剂后皮肤中迁移DC细胞摄取半抗原并游走至引流淋巴结，激起NK细胞免疫应答并形成记忆性NK细胞。CHS反应中记忆性NK细胞形成过程大致如下：a)初次致敏小鼠体内的NK细胞在刺激局部引流淋巴结中接受DC或者其他APC的信号，发生免疫应答；b)随后NK通过血运迁移到肝脏，肝脏特有微环境促进长期存活的记忆性NK形成，并使其驻留于肝脏；c)小鼠耳朵再次接受半抗原刺激时，某种机制使肝脏记忆性NK离开肝脏，聚集到病灶部位。在病灶部位，记忆性NK再次接触半抗原，迅速扩增并招募其他的炎性细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、DC等)并形成炎症。

(四)CXCR6受体与记忆性NK细胞生存和迁移的关系

记忆性NK细胞迁移并定位于肝脏与自身表达CXCR6受体密切相关。肝脏NK细胞中35%～55%为CXCR6+，脾脏NK细胞中仅仅3%～5%为CXCR6+。过继转输致敏小鼠肝脏CXCR6+NK细胞给T/B/NK三缺陷小鼠可以产生特异性记忆反应，Rag2-/-小鼠在抗CXCR6抗体处理后或者CXCR6-/-小鼠均失去NK细胞记忆反应，肝脏CXCR6+记忆性NK细胞可在6周内保持二次记忆应答能力，表明CXCR6+NK细胞具备记忆性NK细胞的所有特性，可以针对五种不同抗原行使二次免疫应答。CXCR6-NK细胞在转输后可以均匀分布于各免疫器官，只有CXCR6+NK细胞集中定居于肝脏。CXCR6与记忆性NK细胞的定居、效应功能和长期生存有关，但是与抗原识别无关。肝脏CXCR6+NK细胞需要肝窦内皮细胞持续表达分泌型和膜型CXCL16，从而维持CXCR6+NK细胞的生存和记忆功能。CXCR6也可能负调NK细胞的杀伤功能，从而减轻NK细胞对肝细胞的损伤。一旦记忆性NK细胞离开肝脏进入抗原攻击区域，由于CXCL16的缺乏而可能彻底释放记忆性NK细胞的功能。

(五)NK细胞对多种病毒免疫应答的记忆功能

O’Leary JG研究小组在研究半抗原皮肤致敏模型的同时，还分别用流感病毒、VSV或者HIV的抗原疫苗进行皮下致敏，观察到这种病毒诱发的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)也可发生在T/B细胞缺陷小鼠中。未经致敏但是转输了致敏小鼠NK细胞的Rag2-/-γc-/-鼠(T、B、NK细胞缺陷)也会发生DTH。这些致敏原诱导的反应都是抗原特异性的。十分重要的是，转输了致敏小鼠NK细胞的Rag2-/-γc-/-鼠获得了对活病毒感染的抵抗力，小鼠存活期明显延长。这种保护作用具有抗原特异性，转输了流感病毒抗原致敏的NK细胞的受体鼠只能获得对活流感病毒滴鼻感染的抵抗力，但没有针对VSV病毒感染的抵抗力。同样，在流感病毒、VSV和HIV之间没有交叉保护作用，只有针对各自病原的保护作用。NK细胞的这种功能与获得性免疫介导的记忆应答十分相似，这种功能无疑为疫苗接种展示了广阔的想象空间。

四、NK细胞对细胞因子再次刺激的记忆反应

Megan等在体外用IL-12和IL-18联合预活化NK细胞可导致该NK细胞IFN-γ分泌水平明显升高［19］。该NK细胞经CFSE标记后转输到Rag1-/-鼠中，该细胞因子预活化的NK细胞在转输7～22天仍可在受者鼠中检测到预活化的NK细胞。从受者鼠分离CSFE+NK细胞体外经同样细胞因子再次刺激，CFSE+NK细胞IFN-γ分泌量较对照组明显增加。该NK细胞对活化型抗NK1.1抗体或抗Ly49H抗体的刺激亦有记忆反应(亦引起IFN-γ分泌增加)，而受体鼠本身的NK细胞并没有此现象，该过程不依赖于NK细胞的增殖。这些结果提示NK细胞经细胞因子预活化后，再次受到刺激可以产生更强烈的应答反应，暗示存在记忆样功能的NK细胞。这些结果从另外一个角度提示NK细胞的这种记忆样功能并非需要抗原的参与。

五、NK细胞记忆功能的分子调控

Lanier和Sun JC的研究团队在后续一系列研究中，揭示了NK细胞在MCMV感染过程中发挥记忆功能所依赖的信号机制［20］。不仅Ly49H及其下游连接蛋白DAP12在NK细胞对MCMV的记忆应答中起关键作用，共刺激分子DNAM-1在此过程也有重要作用。DNAM-1在胞浆区的信号转导基序能招募酪氨酸激酶Fyn和丝氨酸-苏氨酸激酶PKC，从而向胞内传递活化信号。DNAM-1缺陷不影响MCMV感染早期NK细胞的活化，但会导致Ly49H+NK细胞的初次应答和二次应答阶段的扩增能力下降，记忆性NK细胞的形成受到影响［21］。其中DNAM-1-Fyn信号轴主要影响记忆性NK细胞的形成，但在效应性NK细胞和记忆性NK细胞的扩增过程中不发挥作用；而DNAM-1-PKCη信号轴在细胞扩增和记忆形成阶段均发挥重要作用。

NK细胞的记忆功能与外源性因素密切相关。在针对病毒感染的早期NK细胞扩增阶段，促炎性细胞因子发挥重要作用。IL-12受体或其下游信号分子STAT4缺陷的NK细胞在MCMV感染后无法大量扩增并形成记忆性NK细胞。IL-12、IL-18和IFN-α信号均能诱导NK细胞上调表达转录因子Zbtb32，在MCMV感染过程中，Zbtb32通过抑制Blimp1来促进NK细胞扩增［22］。此外，在IL-15缺失的环境下，外源性输入的记忆性NK细胞很快消失，说明IL-15在记忆性NK细胞的维持阶段起重要作用。

NK细胞的稳态收缩在记忆性NK细胞的形成中是一个关键阶段。细胞凋亡分子Bim缺陷时，NK细胞在MCMV感染后期能长期存活，但呈现相对不成熟的表型，对病毒的再次刺激反应性降低，提示Bim介导的细胞凋亡对记忆NK细胞的形成有重要作用。促炎性细胞因子通过上调miR-155来抑制凋亡相关分子Noxa和SOCS1，从而维持NK细胞扩增；最新研究发现，ROS依赖的线粒体自噬途径对于NK细胞的存活和记忆性NK细胞的形成至关重要［23］。