第二节　γδT细胞抗原识别及活化机制的研究进展

γδT细胞是一种T淋巴细胞，它表面表达在胸腺发育中经过V-(D)-J-C基因重排产生的具有一定多样性的TCRγδ，但是却在抗原识别和活化方面与αβT细胞截然不同，显示出一种固有免疫样的模式。自从这种细胞被发现以后，其识别的抗原类型及活化机制一直是该领域的研究热点。

现在人们普遍认为，就识别的抗原类型和方式而言，TCRαβ主要以“一对一”的方式，识别MHC分子提呈的蛋白类抗原肽。相比于TCRαβ，TCRγδ识别的抗原种类似乎更多样，包括蛋白、脂类、磷酸化分子(双磷酸盐、磷脂)等体内的一些“应激”信号分子，不具有MHC限制性，而且TCRγδ对配体的识别不具有“一对一”的特异性。αβT细胞的活化是受控的，除了TCRαβ与MHC/抗原肽复合物的第一信号以外，还需要细胞表面CD28分子与抗原提呈细胞表面的CD80/86分子相互作用，产生第二信号。双信号共同激发αβT细胞产生完全活化。而TCRγδ可以直接结合抗原，产生识别，直接使γδT细胞完全活化，不需要第二信号，甚至一个细胞因子信号就能使γδT细胞活化，发挥生物学效应。αβT细胞的免疫应答具有抗原特异性和记忆性。而大多数研究显示，γδT细胞识别抗原不具备αβT细胞反应的特异性和记忆反应。正是基于此，学术界倾向于将γδT细胞归类为固有免疫细胞。

当然，尽管理论上TCRγδ的配体很多，但是由于一直缺乏TCRγδ与其配体结合的最直接的证据(晶体结构)，大多数研究只是观察到这些配体使γδT细胞活化的现象，理论上来说，γδT细胞表面有很多受体，其中包括重要的NK细胞活化性受体NKG2D等，TCRγδ在配体引起的γδT细胞活化中所起的作用无从得知。因此，寻找TCRγδ识别的抗原仍然是γδT细胞研究领域内的最大挑战，也是充分揭示γδT细胞抗原识别及活化机制的关键。

一、基于CDR3δ结合特异性的γδT细胞识别的蛋白配体筛选研究

我们实验室一直致力于TCRγδ识别的疾病相关蛋白配体的鉴定研究。从CDR3δ结合特异性为核心出发，2008年，我们首次发现人DNA错配修复相关蛋白2(hMSH2)为γδT细胞所识别的蛋白配体之一［1］。进一步机制研究发现，hMSH2可广泛异位表达在多种上皮性肿瘤细胞表面，也能诱导表达在EB病毒转化的永生细胞株的细胞表面，与γδT细胞表面的两种受体TCRγδ和NKG2D均发生相互作用，介导γδT细胞对异位表达hMSH2的靶细胞产生细胞毒活性［2］。我们还发现，氧化应激也可诱导hMSH2在人肾癌细胞的异位表达。在氧化应激下，p38-MAPK和JNK通路均被活化，通过ASK1和ATF3介导hMSH2的异位表达。而且，IL-18和 IFN-γ预处理可增强γδT细胞对肾癌细胞的毒性作用［3］。2015年，我们用重组的hMSH2蛋白体外刺激γδT细胞，发现经过刺激的γδT细胞的TCR序列发生了寡克隆的扩增，也检测到含有用来筛选配体的特异性的CDR3δ序列的克隆。这说明尽管不是一对一的，γδT细胞的某些克隆确对hMSH2蛋白产生了反应，进一步验证了我们的基于CDR3δ结合特异性的抗原筛选策略［4］。以hMSH2为代表的一类应激抗原，它们在正常细胞膜上低表达或者不表达，而在细胞应激、恶变时则会在细胞膜上异位表达，为TCRγδ所识别。这一发现的重大生物学意义在于揭示了细胞在受到严重不良刺激或细胞恶变时可通过细胞内源蛋白在细胞膜上的异位表达的方式来为免疫系统，尤其是固有免疫系统(γδT细胞)提供可识别的抗原分子的机制。如果继续可发现大量恶变或感染应激所致的抗原异位表达，将有利于发现TCRγδ所识别的抗原配体。从这个角度出发，我们对已有报道的肿瘤异位表达的蛋白进行了分析，最新的研究结果表明，在多种肿瘤细胞表面异位表达的核仁素分子也是γδT细胞识别的配体之一。

我们用同样的基于CDR3δ结合特异性的策略，使用转染了肺结核患者中γδT细胞优势的CDR3序列的基因工程细胞筛选与之结合的蛋白抗原及表位，鉴定了两个功能性多肽TP1和TP2，并确认了与TP1匹配的分枝杆菌蛋白质DXS2为γδT细胞所识别的结核杆菌相关蛋白抗原［5］。2016年，以系统性红斑狼疮患者优势的CDR3δ序列为基础，相同的策略又成功的鉴定了CCT6A是γδT细胞所识别的自身免疫性疾病相关蛋白配体［6］。同时，用相同策略，筛选更多的γδT细胞识别的结核杆菌感染、炎症性肠病相关的抗原的研究也在进行中。

我们实验室建立了特有的基于CDR3δ结合特异性的γδT细胞识别蛋白配体的筛选策略。一方面，为鉴定更多的γδT细胞识别的抗原，阐明γδT细胞抗原识别的结构基础，揭示γδT细胞在疾病中发挥作用的机制提供强有力的支持；另一方面，这些疾病相关的CDR3δ序列，可用于基于γδT细胞的免疫治疗，鉴定的抗原也可以作为疾病治疗的新靶点，有很高的转化应用价值。

二、γδT细胞识别双磷酸盐抗原的机制研究

除了蛋白类抗原之外，在γδT细胞识别的配体方面比较有共识，并且研究的比较多的是小分子非肽类双磷酸盐抗原。

人外周血主要的γδT细胞亚群为Vγ9Vδ2 T细胞，这群γδT细胞能识别小分子的非肽类的焦磷酸盐抗原，既有以IPP为代表的内源性生成的，也有以HMBPP为代表的外源微生物来源的。作为由非甲戊二羟酸途径合成类异戊二烯化合物的中间产物，HMBPP在原核与一些真核的病原微生物中广泛存在，而在哺乳动物中不存在，故认为是一个特异的病原体相关分子模式。Vγ9Vδ2 T细胞以MHC非依赖性的方式识别抗原，被证实能被小分子双磷酸盐活化扩增。尽管临床上已经使用一些焦磷酸盐化合物扩增γδT细胞用于一些肿瘤的免疫治疗，但是γδT细胞对这些小分子双磷酸盐的识别机制尚未明了。人们也尝试过从表达在细胞表面、作为提呈小分子磷酸化抗原的分子被γδT细胞识别的角度来寻找相关的蛋白，但一直没成功。

2013年，Vavassori等证实了磷酸化抗原确实是经分子提呈在细胞表面来活化γδT细胞的。他们发现，嗜乳脂蛋白BTN3A1是磷酸化抗原的提呈分子［7］。嗜乳脂蛋白BTN3A1是一种具有免疫调节功能的免疫球蛋白样分子。早期研究发现，BTN3A1在Vγ9Vδ2 TCR识别异戊二烯焦磷酸盐中发挥重要的作用。Vavassori等的研究成果有三大亮点：一是证明BTN3A1可介导γδT细胞与焦磷酸抗原的相互作用；二是证明BTN3A1是作为抗原提呈分子提呈焦磷酸抗原；三是证明了BTN3A1能直接被Vγ9Vδ2 TCR识别。BTN3A1的功能就像感应细胞内磷酸化抗原水平的传感器，当处于体内某种应激压力下或者有外源微生物感染时，细胞内磷酸化抗原水平上升后，高水平的磷酸化抗原以某种形式促进BTN3A1的聚集和二聚化，并与其结合，表达于细胞表面，供γδT细胞识别。这一发现丰富了人们对γδT细胞抗原识别机制的认识，表明γδT细胞识别非肽类磷酸抗原要有赖于抗原提呈分子。

近年来，围绕着BTN3A1活化Vγ9Vδ2 T细胞，又有了一些最新的研究成果。2014年，Sandstrom等人通过结构的、生物物理学的和功能的全方面的验证，证明BTN3A1分子胞内的B30.2结构域形成了一个表面携带正电荷的口袋，是直接与双磷酸盐抗原结合的位点。而如果把该区域的带正电的基团去除，那么整个分子与双磷酸盐抗原结合，活化Vγ9Vδ2 T细胞的功能也消除了。另外，他们还发现了口袋结构内有一个重要的突变。如果把这个突变引入到不能活化Vγ9Vδ2 T细胞的BTN3A分子内，就能使其获得相应的功能［8］。这个发现首次提出BTN3A1分子感知细胞内双磷酸盐抗原浓度的变化是活化Vγ9Vδ2 T细胞，参与抗感染和抗肿瘤免疫应答的关键(图3-4)。

从BTN3A1分子发现之初，人们普遍认为，BTN3A1分子胞外的IgV结构域能与异戊二烯焦磷酸盐相互结合，它的作用更类似于一个抗原提呈分子，它与异戊二烯焦磷酸盐的复合物一同被Vγ9Vδ2 TCR识别。而BTN3A1分子胞内的B30.2结构域的发现颠覆了这一看法。紧接着2015年，Wang等人发表文章，用实验支持了上述观点。他们通过将胞内和胞外的两个异戊二烯焦磷酸盐与BTN3A1的结合位点突变处理，检测突变的BTN3A1分子对Vγ9Vδ2 T细胞的活化作用，结果显示BTN3A1确实是通过胞内的B30.2结构域与异戊二烯焦磷酸盐相互作用，导致BTN3A1胞外的二聚体结构发生变化，从而为Vγ9Vδ2 TCR所感知到［9］。BTN3A1参与异戊二烯焦磷酸盐活化Vγ9Vδ2 T细胞的机制并不是人们起初想象的那样，作为一个提呈分子，提呈胞外的异戊二烯焦磷酸盐，而是感知细胞内源性异戊二烯焦磷酸盐浓度的变化，发生结构的改变，而活化Vγ9Vδ2 T细胞。

这些机制的发现进一步激发了人们的研究热情，短短两年时间，又有几个实验室，在对Vγ9Vδ2 TCR通过BTN3A1分子，应答双磷酸盐抗原的详细分子机制方面有了重大发现。

2014年，Riaño等人对BTN3A1活化Vγ9Vδ2 T细胞的最小结构进行了研究。他们通过比较分别转染BTN3A1基因和包含BTN3A1基因的人类6号全染色体的CHO细胞对双磷酸盐抗原PAgs的提呈作用。结果显示，单独转染BTN3A1基因的CHO细胞就可以充分活化Vγ9Vδ2 T细胞，但是双磷酸盐抗原PAgs对Vγ9Vδ2 T细胞的活化，则不仅仅只依赖BTN3A1基因，还需要整个6号染色体的存在［10］。这一结果说明，BTN3A1作为蛋白抗原，能直接活化Vγ9Vδ2 T细胞；而其作为抗原提呈分子，参与磷酸化抗原与Vγ9Vδ2 TCR之间的相互作用，则需依赖于定位于6号染色体上的某个或者某些基因的共同作用。该研究对于设计双磷酸盐抗原介导的Vγ9Vδ2 T细胞免疫反应动物模型有重要意义，并且引发人们对控制双磷酸盐抗原提呈的基因与控制肽类抗原提呈的MHC本位基因之间相似性的思考。

机体有三种BTN3A分子，分别是BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3。它们都有胞内的B30.2结构域，能与双磷酸盐抗原结合，而它们之中只有BTN3A1有活化Vγ9Vδ2 TCR的作用。Rhodes等人发现，原因是在于Periplakin在其中的作用。Periplakin与BTN3A1分子胞质端非常临近B30.2结构域的区域结合，而其他两种BTN3A家族成员(BTN3A2，3)因为缺少这一结构，就不能活化Vγ9Vδ2 TCR［11］。

Sebestyen等人则是通过无偏向性的全基因组的筛选，发现肿瘤细胞中的RhoB分子是肿瘤细胞内异戊二烯焦磷酸盐浓度的升高通过BTN3A1分子，转化成活化信号，活化γδT细胞过程的一个重要的介导者［12］。RhoB分子的GTP水解酶活性能调节γδT细胞的活化。首先RhoB分子与BTN3A1结合，通过调节细胞骨架的改变，把BTN3A1分子稳定在细胞膜上。随后RhoB从BTN3A1上脱落，后者感知肿瘤细胞内双磷酸盐水平的变化而发生构象改变，活化γδT细胞。

Gruenbacher等人则发现了CD39分子在双磷酸盐抗原活化γδT细胞上的调控作用。双磷酸盐抗原能够诱导细胞膜的CD39分子的表达，而作为ATP水解酶，CD39不仅仅是水解ATP，还可以水解自身的和微生物来源的双磷酸盐抗原，阻断其与TCRγδ的相互作用。只有甲羟戊酸类的焦磷酸盐能够调控CD39分子表达和功能，抵御CD39介导的水解作用［13］。

相比上述机制的研究，Kilcollins等人则将关注点放在利用双磷酸盐抗原和γδT细胞的细胞裂解作用，清除被感染的，或者恶性转化的细胞上。他们发现γδT细胞对K562细胞的细胞毒活性能被HMBPP和TCR抗体加强，而被Src和BTN3A1的阻断剂减弱。但是细胞外的HMBPP对γδT细胞细胞毒活性的加强作用必须有一个HMBPP的内化过程，而一种类似于HMBPP的合成的前体药物能够很好的绕开HMBPP内化这一步骤，促进γδT细胞的细胞毒活性［14］。这一结果也佐证了内在双磷酸盐抗原通过BTN3A1活化γδT细胞的观点。

三、其他γδT细胞识别配体及活化的机制研究

aβT细胞和γδT细胞分别隶属于两个不相同的T细胞谱系，在很多方面的性质都存在差别。γδT细胞利用其表面的TCRγδ识别抗原配体，配体类型多样，目前为止研究得比较多的还是一些应激蛋白和焦磷酸盐抗原。除此以外，γδT细胞能识别一些脂类抗原，而在这个过程中CD1d分子被认为发挥了抗原提呈的作用。

2014年，Pellicci等人发现了一种被他们命名为δ/αβ T细胞的新细胞类型。这种细胞的TCR是由δ链的V基因片段(Vδ1)与α链的J和C片段融合形成的杂合链与不同类型的完整β链组成。这种δ/αβ T细胞数量上能占到所有人Vδ1 γδT细胞的50%，能独立地识别由HLA分子提呈的多肽类和CD1d分子提呈的脂类抗原。与NKT细胞类似，它们能识别α-半乳糖神经酰胺，但是与NKT细胞不同的是，它们对其他脂类抗原，如α-葡萄糖神经酰胺，有很好的特异性。Vδ1编码的序列在这种融合的δ/αβ TCR的抗原识别中占据主要的地位，由它实现对CD1d和脂类抗原的复合物的识别［15］。

2016年，Roy等人的研究同样是针对γδT细胞对脂类抗原的识别的。他们研究发现，广泛表达在人DC细胞和B细胞表面的CD1c分子在γδT细胞识别脂类抗原的过程中发挥重要的作用。他们发现，CD1c分子四聚体携带结核分枝杆菌的脂类抗原phosphomycoketide，能被Vδ1 TCR识别。如果突变了Vδ1结构域，该识别过程将被破坏，提示该结构域在识别中的重要作用。他们的结果提供了在Vδ1TCR识别脂类抗原的过程中CD1c-TCRγδ相互作用的生物物理学证据。出人意料的是，TCR能识别CD1c与多种脂质的复合物，包括溶血卵磷脂、硫脂类等，但是却不包括脂肽类［16］。这一研究澄清了被人们频繁观察到，却一直没有很好地理解的自身的和外源的脂类抗原通过CD1系统活化γδT细胞的分子基础。

除了对外抗击各种病原体的入侵之外，γδT细胞被认为在机体内的免疫监视中发挥着重要作用。2014—2016年期间，Schwacha等人一直在γδT细胞应答损伤相关分子模式方面进行研究［17，18］。他们发现，分离自小鼠皮肤的γδT细胞在与受损线粒体接触后被活化，表现为上调γδT细胞表面TLR2和TLR4的表达水平，并且分泌大量的炎症性细胞因子，包括IL-1β和IL-6，还产生很多生长因子。这些发现支持了机体组织或细胞受损后释放的大量损伤相关分子模式能活化皮肤的γδT细胞的理论。这些活化的γδT细胞在启动组织无菌性炎症反应，以及随后的组织修复中发挥重要作用。