第四节　组织区域免疫微环境中γδT细胞的相关研究进展

经典免疫学研究主要关注发生在一些专职性的免疫器官：中枢免疫器官(骨髓、胸腺)及外周免疫器官(脾脏和淋巴结)的免疫应答，但是近年来研究者开始重视非专职性免疫器官：肝脏、肠道、肺、皮肤黏膜等的免疫相关作用，发现这些器官因具有一些特殊的结构和微环境，含有独特的免疫细胞亚群和免疫功能分子，从而构成了有别于发生在“专职”免疫器官的系统性免疫应答的区域免疫特性，在一些区域性疾病中区域微环境的免疫应答有着区域的特殊表现。

由于对组织器官区域免疫特性的了解较少，妨碍了人们对疾病病理机制的深刻认识，影响了疾病诊治技术的发展。γδT细胞的一些特性决定了其在区域免疫特性的形成及区域免疫应答中发挥着重要的作用。γδT细胞优势分布于以表皮、肝脏、肺脏、小肠、子宫为代表的黏膜组织。这些地方正是重要的区域免疫器官。分布于这些区域免疫器官的γδT细胞不仅是在数量上与经典免疫器官有较大区别，而且其TCR的多样性大大减小，往往呈现出寡克隆，甚至单克隆。这预示着γδT细胞在区域免疫中发挥着特殊的功能。因此，从γδT细胞的构成与作用角度，探索γδT细胞在区域免疫特性的形成、区域免疫应答模式及其调控机制以及相关疾病病理机制中的作用，已经成为最近几年γδT细胞研究领域的重要热点之一。

一、肠道中的γδT细胞

肠道上皮间淋巴细胞(IEL)被认为是肠道黏膜免疫系统的一个重要免疫效应细胞。IEL定位于肠道单层上皮细胞与基底膜之间，与肠上皮细胞紧密接触并相互作用，正常成人的小肠组织中，每4～10个肠上皮细胞存在1个IEL。作为肠道中对抗外界感染的第一道屏障，IEL在维持上皮细胞的完整性、免疫监视、加强和调节免疫应答及维持肠道稳态等方面发挥了重要作用，构成并维持着肠道特殊的区域免疫微环境。

IEL的细胞组成和免疫特性与经典免疫器官相差很大。尽管外周循环γδT细胞只占总体T细胞的1%～5%，但γδT细胞却优势分布于肠黏膜组织上皮内。在人IEL中，γδT细胞比例可达10%～18%，并且以Vδ1细胞亚群为主。在小鼠中，IEL中γδT细胞比例将近50%，多数表达CD8αα，少数呈CD4和CD8双阴性。这群γδT细胞在肠道疾病的发生发展中起着重要的作用。

TL1A是在肠道广泛存在的一种前炎性因子。在炎症性肠病(IBD)的患者和IBD的小鼠模型的肠道组织中均能检测到高浓度的TL1A。然而，TL1A在肠道生理状态下的作用仍然还不清楚。2015年，Touggard等人用TL1A基因敲除鼠研究了TL1A对肠道免疫系统和肠道微生物的影响。他们发现，TL1A基因敲除以后，小鼠小肠上皮间的γδT细胞和CD8+T细胞的数量会显著减少，且表达活化性受体NKG2D的水平也大大降低。与野生型小鼠相比，敲除小鼠体重和组织的脂肪沉积显著减低，同时瘦素和CXCL1的表达水平也较低。肠道菌群的分析结果显示，敲除小鼠盲肠的IV类梭菌属细菌数量下降，厚壁菌门和拟杆菌门细菌的比值发生变化，回肠黏膜的乳杆菌属细菌减少［40］。该研究揭示了TL1A在生理情况下能调节肠道菌群的组成和脂肪组织，调节黏膜免疫系统，尤其是上皮间γδT细胞亚群，提示抑制TL1A可能对治疗IBD有重要意义。

肠道的免疫系统往往对一些无害的外来抗原(如食物中的一些蛋白)产生局部的免疫耐受。如果这种免疫耐受一旦被打破，就会发生对某些食物的过敏反应。为了阐明食物过敏的相关机制，Frossard等人在实验中用到一种用霍乱毒素(CT)来打破肠道免疫耐受的小鼠模型。他们研究发现，在CT诱导肠道由耐受状态到食物过敏的过程中，其针对的主要靶细胞是IEL中的γδT细胞(γδ-IEL)。在用CT喂养的小鼠中，γδ-IEL的数量显著升高。如果将γδ-IEL分离出来，过继给一种对食物过敏原β-乳球蛋白的免疫耐受被破坏的小鼠，后者会产生大量的抗β-乳球蛋白的抗体。同时在接受了外源的CT喂养小鼠的γδ-IEL后，尽管从没有接触过CT，这种小鼠也会产生抗CT的抗体。这一结果提示，γδ-IEL在此发挥了一种类似于抗原提呈细胞的作用。与经典的αβT细胞不同，γδ-IEL在体内体外均能将CT内化，这种CT活化的γδT细胞表达MHCⅡ、CD80和CD86，迁移到肠道的固有层，并且在此产生IL-10和IL-17［41］。该研究为γδ-IEL调节口服免疫耐受和促进食物过敏中的作用提供了体内实验的证据。

γδT细胞在皮肤和肠道等上皮组织的损伤修复过程中发挥重要作用。然而，其相关作用的分子机制仍不清楚。先前有报道，皮肤中的γδT细胞表达的臀板蛋白CD100与角质细胞表达的丛状蛋白B2的相互作用与γδT细胞在皮肤组织修复作用密切相关。那么CD100在肠道区域的损伤修复中是否也有相似作用呢?Meehan等人实验结果显示，在小鼠的结肠中，CD100在所有的IEL中都有表达，而丛状蛋白B2也表达于所有的上皮细胞。在DSS诱导的结肠炎模型中，CD100敲除的小鼠病情显著加重，表现为增加的结肠溃疡和粘膜炎性细胞浸润。这种严重的结肠炎表型可归因于结肠上皮细胞不能产生有效的增殖、损伤修复。与野生型γδIEL相比，CD100敲除小鼠的γδIEL在DSS诱导的过程中不能产生角化细胞生长因子1(KGF-1)。外源性给予KGF-1能有效缓解病情，减低炎症易感性［42］。该研究证明，CD100介导的信号在有效活化γδ-IEL产生KGF-1方面发挥重要作用，从而促进结肠上皮组织在炎症损伤中的修复过程。

γδT细胞是肠道免疫系统的优势的T细胞亚群。以往研究认为，γδT细胞可通过增强Th17细胞应答，从而在T细胞诱导的结肠炎症反应模型中的免疫反应中发挥重要作用，但是其的详细机制尚不明了。2016年，Do等人借助一个体外共培养的模型，用肠道抗原反应性的效应T细胞，来筛选提呈这些肠道抗原的抗原提呈细胞。他们发现，γδT细胞的存在能显著的增强在小鼠淋巴结中肠道抗原的提呈过程。CD11b+的DC对肠道抗原的提呈特异性可为γδT细胞所调控。他们还发现，γδT细胞迁入淋巴结对促进抗原的提呈至关重要［43］。这一发现突出了一个以前不为人知的γδT细胞的重要角色，它可以通过在引流淋巴结中促进肠道抗原的提呈过程来促进结肠中的免疫应答。

γδ-IEL能限制病原体跨越肠上皮细胞的转位过程，但是机制不明。Edelblum等人研究了在肠道感染的过程中，γδ-IEL是否通过迁移到特定部位与上皮细胞之间的相互作用，促进黏膜屏障的维持，从而限制病原体跨越肠上皮细胞的转位过程。他们用鼠伤寒沙门氏菌和鼠刚地弓形虫去感染TCRδ链敲除或闭合蛋白敲除的小鼠，用活体镜检法观察携带绿色荧光蛋白的γδT细胞在小肠黏膜中的迁移情况，发现γδ-IEL在感染后迅速地迁移到与细菌直接接触的上皮细胞附近，并且停留在那里。如果γδT细胞的迁移能力或者γδT细胞本身缺陷，会观察到一小时之内，更多的病原体在黏膜存在。与γδ-IEL的迁移在宿主防御早期的作用相一致，闭合蛋白缺陷的小鼠的系统性的沙门氏菌病的发展过程比对照更快，损伤更严重［44］。该研究表明，γδ-IEL在肠道上皮内的迁移及其与接触病原体的上皮细胞的相互作用对感染的免疫监视和快速的宿主防御反应十分重要，γδ-IEL的闭合蛋白在其中发挥了关键作用。

IL-17在肠道黏膜中到底是起致病作用还是保护作用一直颇有争议。因为γδT细胞是肠道黏膜区域IL-17的主要分泌细胞，因此，其在肠道微环境中的具体功能也一直存在争议。2015年，Lee等人证实他们找到了IL-17对肠道黏膜具有保护性的证据。他们发现在急性肠道损伤中，结肠固有层的IL-23R+γδT细胞是主要产生IL-17的细胞，而它们分泌IL-17并不依赖于IL-23。而IL-17可通过调控闭合蛋白的功能，对肠道黏膜完整性起到保护作用［45］。

另外，2015年，Rezende等人报道了一种新型的γδT细胞亚群。这群γδT细胞表达一种膜结合的TGF-β1，被称作潜伏相关的肽(LAP)，主要是发挥一种调节性T细胞的作用。胸腺中的CD27+IFN-γ+CCR9+α4β7+TCRγδ+T细胞成熟后迁移到外周组织，尤其是在小肠集合淋巴结和小肠固有层中。在此处，它们通过表达ATF-3来上调LAP，同时下调IFN-γ表达，逐渐获得一种调节性T细胞的表型。TCRγδ+LAP+细胞表达抗原提呈分子，虽然它们本身并不表达Foxp3，但是可以作为抗原提呈细胞，诱导CD4+Foxp3+调节性T细胞活化［46］。这种TCRγδ+LAP+细胞的发现与鉴定，为深入理解与肠道功能和肠道疾病相关的免疫调控和相关生物学过程指明了新的方向。

二、皮肤中的γδT细胞

人参皂苷F1(GF1)是人参皂苷Rg1的代谢物。有很多研究报道GF1在维持皮肤的生理机能方面有很多有益的作用。Han等人关注了GF1在皮肤色素沉积方面的效应及可能机制。他们发现，含有0.1%GF1的面霜在使用8周以后，对人造的被晒成棕褐色的皮肤有显著的增白作用。但是GF1并不能直接在mRNA水平上抑制酪氨酸酶或者多巴色素互变异构酶在正常人的上皮黑色素细胞或共培养的上皮黑色素细胞和角质细胞中的表达水平。有意思的是，他们发现GF1能增强人表皮γδT细胞分泌IL-13的能力，而IL-13能显著地降低上皮黑色素细胞表达的酪氨酸酶或者多巴色素互变异构酶水平，减少上皮黑色素细胞中黑色素的合成，从而形成了肉眼可见的增白效果［47］。该研究发现GF1能通过增强皮肤γδT细胞分泌IL-13，后者调控上皮黑色素细胞表达的酪氨酸酶或者多巴色素互变异构酶，影响黑色素的合成过程，从而在皮肤美白方面发挥作用。

长期定居于皮肤的T细胞在维持组织的内稳态和损伤修复的过程中发挥重要作用。MacLeod等人的研究从另一个方面关注了这群细胞的作用，那就是紫外线辐射引起的皮肤损伤和随之而来的组织再生过程。他们发现，严重的紫外线辐射能迅速的激活人皮肤内定居的T细胞和小鼠的树突状上皮γδT细胞(DETC)，而其中的机制涉及角质细胞释放ATP的过程。在紫外线辐射后，细胞外的ATP导致DETC上调CD69的表达、细胞增殖和分泌IL-17，并发生形态学的改变。角质细胞在紫外线辐射后依赖嘌呤受体P2X7和caspase-1通路，分泌IL-1，从而加速了DETC分泌IL-17的过程。随后IL-17诱导上皮TNF相关的细胞凋亡、生长停滞和启动DNA损伤相关的基因表达，从而限制角质细胞的损伤［48］。

在遭遇外来抗原刺激后，传统的αβT细胞能在非淋巴组织中形成持久的具有免疫记忆的记忆型T细胞。近年来，提出来一个关于“固有免疫细胞的免疫记忆”的新概念，认为免疫系统中，属于固有免疫范畴的一些细胞在遭遇到相同的感染和相同的打击的情况下，也能发动快速的、更强劲的类似于记忆型免疫细胞的免疫应答。2015年，有两个相似的研究，均揭示了在牛皮癣的复发和迁移中，皮肤组织中的γδT细胞类似于免疫记忆二次免疫应答的机制。利用不依赖于αβT细胞的咪喹莫特牛皮癣的小鼠模型，联合遗传上的命运映射分析(genetic fate-mapping and reporter systems)，Hartwig等人鉴定了小鼠中的一种γδT细胞亚群，它们能够在小鼠的皮肤中长期的存在，并且具有免疫记忆的能力。这群细胞是分泌IL-17的Vγ4+Vδ4+γδT细胞。它们能在最初的咪喹莫特刺激后，在真皮中长时间存在。这种拥有记忆的Vγ4+Vδ4+γδT细胞在再次遭遇到咪喹莫特的刺激后，可启动更强的效应功能，导致加重的再次炎症反应损害［49］。该研究在界定一个新功能γδT细胞的同时，发现了γδT细胞这种固有免疫细胞在一定条件下也可出现免疫记忆特征，并且为牛皮癣的复发和迁延化提供了新机制的阐释。

小鼠皮肤和真皮中的γδT细胞是主要的分泌IL-17的细胞亚群，促炎性试剂咪喹莫特能导致皮肤中的Vγ4+γδT细胞分泌IL-17，并且很快地在引流淋巴结中扩增。人体局部的使用咪喹莫特能加剧远端的银屑病的皮肤损害，那么在淋巴结中扩增的IL-17+γδT细胞是否能离开淋巴结，与远端皮肤对炎症的敏感度增加有相关仍然不清楚。Ramírez的一篇报道显示，淋巴结扩增的IL-17+γδT细胞依赖于CC型趋化因子受体离开淋巴结，在远端发炎的皮肤部位集聚，促进中性粒细胞的浸润，从而加剧炎症反应。它们同样能够迁移到未发炎的皮肤组织和外周的淋巴结，并在这些远端的部位维持一个很高的数量并保持至少三个月。这些致敏的小鼠显示出对咪喹莫特更快的皮肤炎症反应和更剧烈的IL-17+γδT细胞的增殖。这些类似于有免疫记忆的分泌IL-17的Vγ4+γδT细胞表现出更高的IL-1R的表达水平，并且对IL-1β产生增殖反应［50］。这篇报道关注了局部皮肤炎症后皮肤γδT细胞的组成和性质所发生的长期、系统性的变化，揭示了针对同一种刺激的更快更强的二次免疫应答的机制。

关于γδT细胞在皮肤炎症反应中的作用的报道也并非都是一致的。也有研究者认为，γδT细胞在皮肤微环境中的作用并非不可替代的。慢性皮肤炎症导致的表皮屏障损坏是过敏性皮炎的特征性标志。此前有报道指出小鼠角质细胞缺失FGF受体1和2，能在皮肤屏障受损条件下，发展出类似于过敏性皮炎的慢性皮肤炎症。Sulcova等人发现，在缺失FGF受体1和2的小鼠还没有出现任何异常组织学表型的时候，在各种损伤情况下快速应答的γδT细胞在表皮中数量开始增加。而在异常表型出现后，这些γδT细胞的数量和活化都进一步增长，很可能是由于Il-2、Il-7和一些应激诱导蛋白，比如Rae-1、H60c、Mult1、PlexinB2和Skint1等的上调表达导致的结果。为了确定这些γδT细胞在过敏性皮炎中的作用，他们使用了γδT细胞敲除的小鼠。但是令人意外的是，γδT细胞的缺失对角质细胞的增殖、表皮层厚度、表皮屏障的功能及在皮肤中招募和活化不同的免疫细胞并没有、或者仅有很小的影响，可能的原因与αβT细胞的某些功能代偿有关［51］。

三、肝脏、肺脏中的γδT细胞

研究者观察到γδT细胞在很多实验性的自身免疫病的模型中都具有免疫调节功能。如果将Foxp3基因突变后，由于调节性T细胞的缺失，会造成皮屑病小鼠致命性的系统免疫反应。将皮屑病小鼠的淋巴细胞转移给RAG基因敲除的小鼠，不仅能引起皮炎，还能复制出跟供体小鼠相类似的炎症表型，包括肝炎和肺炎。Ujiie等人发现，仅缺失αβT细胞，但是γδT细胞和B细胞功能正常的TCRα(-/-)的受体小鼠在接受了皮屑病小鼠的淋巴细胞后同样有皮炎症状，但是不再产生肝炎和肺炎，而是γδT细胞而非B细胞在此过程中发挥了作用。他们发现，γδT细胞在TCRα(-/-)受体小鼠中可显著扩增，并且表现出高度活化的CD62LloCD44hi表型。活化的γδT细胞在其表面高表达CD39和NKG2D。在TCRα(-/-)受体小鼠中，有很高频率的皮屑病T细胞产生IL-10，提示在肝肺中γδT细胞或是通过增强抑制性细胞因子的分泌，来抑制了TCRα(-/-)受体小鼠的炎症反应［52］。该研究表明，γδT细胞通过抑制自身反应性T细胞的活性，在维持肝肺脏的免疫稳态中发挥作用。

胆管闭锁(BA)是婴幼儿的罕见病，发病机理一直不明。该病的表现为肝胆管炎症反应以及肝胆管系统的损坏，导致肝脏纤维化和肝脏功能的退化。Klemann等人研究了在BA小鼠模型和BA患者肝脏组织样本中，IL-17和分泌细胞的作用。结果显示，用恒河猴轮状病毒感染建立的BA模型鼠和BA患者的肝脏组织中，IL-17的水平上较对照有显著上调表达。γδT细胞是唯一的IL-17的来源，没有检测到Th17细胞的存在。分泌IL-17γδT细胞在肝脏组织中的扩增导致IL-17、CCR6、IL-23R的上升。给予IL-17抗体后，肝脏的炎症和胆红素的血清水平都降低［53］。该研究揭示了肝脏中IL-17+γδT细胞在炎症和胆道系统的破坏方面的重要作用，为阐明BA的发病机制提供了新资料。

慢性肝脏损伤导致的肝内炎症反应是肝脏纤维化的先决条件。Hammerich等人研究了趋化因子受体CCR6及其配体CCL20在调节γδT细胞迁移过程中的重要作用。CCR6和CCL20在慢性肝病的患者中表达显著增高，免疫组化染色揭示肝实质细胞分泌的CCL20趋化CCR6+单核细胞聚集在肝门静脉周围。CCR6基因敲除的小鼠在两种慢性肝损伤的模型中都显示出显著增强的免疫细胞浸润，以及由此造成的更严重的肝脏纤维化。进一步研究发现，CCR6对Th细胞的组成没有影响，而是分泌IL-17的γδT细胞在损伤肝组织中的集聚是必需的。将野生型小鼠的γδT细胞过继转移给CCR6基因敲除的小鼠，能将慢性肝损伤和纤维化水平降低到与野生型小鼠相当的水平。有趣的是，肝脏γδT细胞抗炎的功能并不依赖于IL-17，而是通过细胞间直接接触的方式，依赖FasL，促进肝脏星状细胞凋亡［54］。该发现揭示了γδT细胞通过CCR6迁移到肝脏部位，并通过抑制肝脏星状细胞，保护肝脏免受慢性损伤中由于过度的炎症导致的肝脏纤维化。

γδT细胞是被人们熟知的在抗细菌感染的免疫反应中主要的效应性T细胞亚群之一，但是γδT细胞的表型特征一直没有像其他细胞那样被很好地界定过。最近，Wanke等人用质谱流式细胞仪系统的界定了在肺炎双球菌肺部感染的小鼠中γδT细胞在表型上的免疫响应。在肺炎双球菌感染后，小鼠的肺灌洗液、脾脏和淋巴结的细胞被分离出来，进行包括细胞表面、细胞内的和信号分子的多个蛋白的相关染色，然后进行质谱流式细胞仪分析。结果显示，肺炎双球菌感染后，肺灌洗液中γδT细胞显著增加，既包括分泌IFN-γ的亚型，又包括分泌IL-17的亚型。进一步的功能相关的表型分析发现，这群活化的γδT细胞独特地表达Gr-1。表达Gr-1的γδT细胞是IFN-γ的主要来源，而不表达Gr-1的γδT细胞则主要分泌IL-17。同时，与Gr-1-细胞相比，Gr-1+的γδT细胞也高表达ζ链相关的蛋白激酶70、p38和4eBP1等信号分子［55］。这篇报道关注了Gr-1在肺脏γδT细胞上的表达模式，为区分在早期细菌性肺炎中分泌IFN-γ和IL-17的功能亚型提供了一个新的强有力生物标志。

几乎与此同时，Wehrmann等人也报道了在急性肺损伤中γδT细胞的肺脏保护的机制。野生型的小鼠和TCRδ(-/-)小鼠同时暴露于大肠杆菌LPS环境中，诱导急性肺损伤模型，然后分析小鼠肺脏的γδT细胞和巨噬细胞的亚型。结果显示，在缺失γδT细胞以后，TCRδ(-/-)小鼠与野生型相比，显示出增强的炎症反应和肺泡毛细血管渗漏，而这些都与明显的巨噬细胞的扩增有关。经典的M1型巨噬细胞在TCRδ(-/-)小鼠的肺脏中数量增加，增加从建模后第1天开始，第4天到达最高点，一直持续到第7天。在LPS的刺激下，Vγ1和Vγ7 γδT细胞在肺中扩增，并分泌IL-4。共培养结果显示，肺泡巨噬细胞在γδT细胞存在的情况下分泌TNF-α减少，而在使用了IL-4单抗后，这一情形得到扭转。外源给予重组IL-4能导致M1型巨噬细胞减少，同时炎症和肺泡毛细血管渗漏症状减轻。因此，可以看出，Vγ1和Vγ7 γδT细胞在LPS诱导的肺损伤中起到保护作用，其具体机制是γδT细胞通过分泌IL-4，抑制肺泡巨噬细胞分泌TNF-α，从而导致M1型巨噬细胞在肺中的数量减少，减轻由其引起的炎症和肺泡毛细血管渗漏症状［56］。

重症脓毒症引起的系统性炎症反应的主要后果表现为肺部的炎症。有报道指出，在实验性败血症中γδT细胞向肺部的迁移增加，但是相关的γδT细胞亚型没有很好的鉴定。Costa等人采用盲肠结扎和穿刺诱导小鼠重症脓毒症模型，观察到肺部强烈的炎症反应，以Vγ4γδT细胞在肺中的集聚为代表。这些在肺中集聚的γδT细胞来源于外周淋巴器官，它们在CCL2、CCL3和CCL5的趋化作用下，向肺脏迁移。脾脏中Vγ4 γδT细胞在早期快速活化，表现为活化分子CD25的表达升高比αβT细胞更早。而肺脏中的Vγ4 γδT细胞严重的偏向于分泌IL-17的分化轴，是IL-17的主要来源。在重症脓毒症模型小鼠体内给予Vγ4抗体后，就观察不到肺中IL-17的升高，而且模型小鼠的死亡率也显著增加［57］。本文作者证明了早期活化的Vγ4γδT细胞是重症脓毒症中肺部IL-17的主要分泌细胞，在肺部保护性炎症反应中起到重要作用。

2014年，Hu等人的一篇报道研究了在多种微生物感染引起的败血症中，谷氨酰胺在调节肺部γδT细胞功能方面的作用。他们用到了同样的盲肠结扎和穿刺诱导小鼠重症脓毒症模型，有部分小鼠造模成功1小时后尾静脉给予一定剂量的谷氨酰胺。实验结果显示，与对照组相比，模型小鼠肺部γδT细胞和中性粒细胞的数量显著增加，γδT细胞分泌的细胞因子也显著增加。组织病理学结果显示，给予了谷氨酰胺的小鼠的炎症和肺泡毛细血管渗漏症状明显较轻。这些小鼠肺中γδT细胞的比例更高，而γδT细胞的凋亡和中性粒细胞的数量降低。而且在给予谷氨酰胺组，γδT细胞分泌IL-17、IFN-γ和IL-10明显降低，中性粒细胞表达CXCR2也显著降低。谷氨酰胺还能降低肺中IL-17A、IL-1β和IL-23的浓度和髓过氧化物酶的活性。这篇文章得出结论，谷氨酰胺能通过影响γδT细胞在肺中的比例、分泌细胞因子活性和中性粒细胞的浸润，在肺损伤中起到保护作用［58］。