第六节肿瘤病理学基础_常见恶性肿瘤综合治疗学-QQ阅读男生都市网

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第六节　肿瘤病理学基础

一、病理学在肿瘤诊治中的价值

肿瘤是很常见的疾病，重者危及生命，早发现、早诊断、早治疗是获得好疗效及提高患者生存率的基本原则。肿瘤的确诊是个复杂的多步骤过程，涉及诸多临床科室的通力协作，包括临床医生触诊、检验科抽血化验肿瘤标志物、腔镜科及影像科定位肿瘤并取材送检病理，由病理医生在显微镜下观察明辨病变本质，发出病理报告。病理学诊断的级别最高，尤其对于鉴别肿瘤良、恶性具有指导意义。

病理检查是诊断肿瘤最直观最可靠的方法，它将病变器官直接取下的病灶制成切片，放在显微镜下观察，明辨病变性质。如果确定为恶性肿瘤，就要对肿瘤进行病理分型，包括命名、分级、侵袭范围、切除是否充分、组织学疗效评估、预后相关等临床病理信息，这些信息是临床治疗方案制定和实施的重要依据。因此，病理学诊断被誉为疾病诊断的“金标准”。我们一般所说的病理诊断包括细胞病理学和组织病理学两大部分内容。

细胞病理学是以肿瘤部位的细胞为材料进行病理学检查、诊断。它方法简单，便于开展，经济实用，诊断阳性率也较高，是目前进行食管癌、宫颈癌诊断的主要方法。临床上细胞病理学诊断是通过对表浅部位的肿瘤或有腔道与外界相通的自然分泌物，进行直接刮片或涂片检查的方法。对无分泌物的深部肿瘤，也可借助穿刺法采取标本后再进行涂片检查。细胞病理学诊断可以用于鼻咽癌、肺癌、食管癌、贲门癌、胃部、肝癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌等。病变常用分级方法为五级法。Ⅰ级：无异型或不正常细胞。Ⅱ级;细胞学有异型，但无恶性证据。Ⅲ级：细胞学疑为恶性，但不能确定。Ⅳ级：细胞学高度怀疑为恶性。Ⅴ级：细胞学确定为恶性。

组织病理学是以切取或切除的病变组织进行病理学检查、诊断。由于组织病理标本较大，可以有目的地选择最可疑的部位多次进行病理切片检查，诊断符合率明显高于一般方法，是病理检查的主要项目。组织病理学检查法可广泛用于所有肿瘤的术前、术中、术后病理诊断，能为手术治疗提供有价值的诊断依据。

虽然病理检查是目前最可靠的肿瘤确诊方法，但是它也有局限性。通常情况下只能将患者的部分病变组织进行病理取材和镜下观察，只是对病变样本的抽样检查，还是有漏诊代表性病变的可能。再者，病理诊断是病理医生观察病变结合自己掌握的病理学理论和阅片实践经验，通过严密的逻辑推理得出的主观性诊断结论。与检验科化验和影像学检查相比，病理诊断思维复杂，有一定主观性。一纸肿瘤病理报告，对患者及其家庭不亚于一份“法院判决书”，将影响到患者及其家庭的生活幸福，必须慎之又慎。

病理检查不同于其他化验室的检查，临床医生根据需要从患者身上取下小块病变组织（称为活体组织检查，简称活检），或用大于1.0mm的粗针穿刺出小条病变组织，或用小于0.9mm的细针穿刺出细胞，或用脱落细胞（痰、胸腔积液、腹水、阴道涂片等）来做。凡是组织，需经过一系列处理。制成很薄的切片，再经染色，病理医生在显微镜下观察组织的形态改变，做出病理诊断;如是穿刺的细胞或脱落细胞，需制成涂片并染色后才能观察并做出诊断，临床医生根据病理诊断，制定治疗方案。举例来说，一成年妇女一侧乳房触及一小肿块，临床医生一般不能肯定此肿块是癌？是乳腺增生？还是其他病变？这时临床医生就需要取肿块的活检或做细针穿刺，活检组织或细针穿刺物送病理科检查。病理医生根据活检组织形态或细针穿刺细胞的形态判断是癌还是增生或其他。如果是癌，则临床医生需要为该患者做乳腺根治术，根治的乳腺标本还要再经过病理科的仔细检查，明确癌的范围、组织学类型和有无淋巴结转移等，以决定该患者是否还需加放疗或化疗。如果术前病理诊断是乳腺增生，临床医生只需为该患者做局部肿块切除。又如一患者发现脖子大，检查发现甲状腺有结节，这结节到底是结节性甲状腺肿？是腺瘤？是癌？还是甲状腺炎？如果是腺瘤，有无癌变？如果是甲状腺炎，是否合并癌，因为有些淋巴细胞甲状腺炎可合并乳头状癌。要明确此甲状腺结节的性质，只有通过病理检查才能得出明确的诊断（图1-3）。

图1-3　组织常规HE染色病理形态

（一）肿瘤病理的基本定义、分类和命名

1.肿瘤的定义

是机体局部组织的细胞在各种内在和外界的致瘤因素长期作用下，逐渐发生的过度而不协调生长所形成的异常新生物（neoplasm）。它是由正常细胞获得了新的生物学遗传特性转化而来，并伴有分化和调控的异常，其诱发的刺激因素消除后，仍继续其与机体不相协调的过度生长。

2.肿瘤病理的分类依据

（1）生物学特性：

良性肿瘤、交界性肿瘤、恶性肿瘤。

（2）组织来源：

癌、肉瘤。

（3）功能按淋巴细胞亚群分类：

B细胞性、T细胞性（抑制/辅助）、内分泌性肿瘤。

（4）分化程度：

分化型（高分化、中分化、低分化）、未分化型。

3.肿瘤病理的命名

（1）良性肿瘤命名原则：

××部位+××组织+瘤，如：背部脂肪瘤，结肠腺瘤。

（2）恶性肿瘤（cancer）命名原则

1）癌（carcinoma）：

来源于上皮组织的恶性肿瘤。

2）肉瘤（sarcoma）：

来源于间叶组织的恶性肿瘤。

（3）交界性肿瘤：

如：卵巢交界性乳头状黏液性囊腺瘤。

（4）特殊命名

1）以人名命名：

如：Hodgkin病、Kaposi肉瘤、Bowen病等。

2）以细胞形态命名：

如：燕麦细胞癌、印戒细胞癌等。

3）以解剖学名称命名：

如：胸腺瘤、松果体瘤、颅咽管瘤。

4）以分泌激素或功能命名：

胰岛素瘤、胃泌素瘤、APUD瘤。

5）复合性命名：

如：血管脂肪瘤、纤维腺瘤、骨软骨瘤。

6）以细胞嗜色特性命名：

嗜银细胞癌，嗜铬细胞癌等。

4.肿瘤病理学常用术语

（1）瘤样病变（tumor-like lesion）：

是一大组与肿瘤相似的增生性病变，其本质，不是真性肿瘤，而是一种组织的畸形。如血管瘤、错构瘤等。有些组织的瘤样病变可转变成真性肿瘤，如色素性绒毛结节性滑膜炎可变为滑膜肉瘤，应视为癌前病变处理。

（2）错构瘤（hamartoma）：

先天发育障碍所致的局部组织生长过多，结构错乱的一类瘤样病变。错构瘤介于畸形与真性肿瘤之间，不同程度兼有两者特征;瘤中各种组织虽增生过度，但细胞分化成熟，一般无异常分化表现，只是结构紊乱，生长缓慢，到一定程度即停止生长，与机体生长相协调。如先天性全身性纤维瘤病、脂肪瘤病、血管瘤、淋巴管瘤、色素痣等。

（3）增生（hyperplasia）：

一般指组织细胞的增多，同时常伴有细胞的肥大，但无异形性。它是在某种刺激（如理化、生物的）因子作用下，引起组织与细胞的生理性或病理性变化。一旦刺激因子去除，可恢复到正常状态。被覆上皮：上皮组织增厚，细胞增多。间叶组织：细胞增多，排列紧密等。

（4）不典型增生（atypical hyperplasia;dysplasia）：

属于癌前病变。指上皮细胞的异型增生，即增生的细胞大小、形态、排列等方面均有异于其正常的成熟细胞，尤以细胞核的异形性最突出。其处于一种不稳定状态，在某种因素继续作用下可转变为恶性肿瘤;如去除某些因素，又可恢复至正常状态。上皮组织不典型增生分为3级包括Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级。

（5）原位癌（carcinoma in situ）：

又称上皮内癌、浸润前癌、本位癌等。重度不典型增生的上皮细胞已累及上皮全层，但未侵犯基底膜。其是最早期的癌，是不可逆转的。癌细胞核形不规则，核膜增厚，染色质增粗，核仁突出，核浆比例增大，有丝分裂增多。癌细胞DNA分析主要为增殖倍体及较多非整倍体。

（6）分化（differentiation）：

在肿瘤病理学中是指肿瘤细胞与其发生部位的成熟细胞的相似程度。肿瘤细胞分化越好，与其相应的起源组织越近似;分化越差，成熟程度越低，则偏离正常越远;反映在形态学上与相应的起源组织差异越大，肿瘤的恶性程度越高。分化与肿瘤的生长增殖潜能和恶性程度成反比。

（7）间变（anaplasia）：

在肿瘤病理学中指细胞缺乏分化，与其起源的正常细胞差异很大，表现为显著的异形性、幼稚性和生长活跃性。间变为一种分化未成熟且同时伴有异常分化，即间变的肿瘤细胞不仅原始幼稚分化低，而且在分化过程中偏离常轨，发生了质的变化。

（8）隐匿癌：

指原发癌非常小，临床上未能发现，首先发现的是转移性癌。如：甲状腺隐匿性乳头状癌，直径<1cm，但40%病例术前已有颈部淋巴结转移。

（9）化生（metaplasia）：

通常指一种组织或细胞，在某些因素作用下，由一种组织转变为另一种组织。一般认为，组织的化生通常为器官或组织的保护性反应，如子宫颈管柱状上皮或腺上皮的鳞状上皮化生、支气管假复层纤毛柱状上皮的鳞状上皮化生、胃黏膜上皮的肠上皮化生。

（10）早期癌：

指原位癌伴有早期浸润（微灶浸润），可伴有或不伴有淋巴结转移。早期胃癌（EGC）：局限于黏膜层或黏膜下层的胃癌，伴或不伴有转移。

（11）微小癌（micro-cancer）：

指体积很小的癌。各种器官的微小癌的标准不一，如肝微小癌指单个癌结节或相邻两个癌结节的直径之和≤3cm，小肝癌的直径<5cm，两者临床上多无症状，又称亚临床肝癌。胃微小癌的直径<0.5cm，小胃癌的直径<1.0cm。

（12）交界性肿瘤（borderline tumor）：

又称交界病变，为一种非独立性病变。是介于良性与恶性肿瘤之间的一大类病变，更多指的是瘤样增生与恶性肿瘤之间的一种病变。在某种因素作用下，病变可继续发展，有可能转变为恶性肿瘤。

（13）癌前疾病（precancerous disease）：

是一个临床概念，为一种独立的疾病。其在某种因素作用下，可以变成癌症。如胃癌前疾病、慢性胃溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃息肉等，其他如着色性干皮病等。

（14）癌前病变（precancerous lesion）：

是一个病理学概念，指各种上皮组织细胞的不典型增生，是具有癌变潜能的良性病变。通常泛指任何肿瘤的前驱病变，也包括肉瘤的前驱病变。如胃黏膜不典型增生、子宫内膜不典型增生、乳腺导管上皮不典型增生等。

（15）肉瘤前病变：

白血病前期、淋巴瘤前驱等。

（16）浸润（infiltration）：

某些物质或细胞在质或量方面异常地分布于组织间隙的现象称为浸润。这些物质包括外来的或体内代谢产生的，如炎性细胞或肿瘤细胞。肿瘤浸润是恶性肿瘤的生长特征之一，是肿瘤细胞和细胞外间质在宿主多种因素调节下相互作用的结果，是肿瘤转移的前奏。肿瘤的浸润和转移共同构成肿瘤的播散。

（17）扩散与转移（spread and metastasis）：

指肿瘤在生长过程中向邻近或远处的蔓延，包括向周围组织的直接蔓延和远处播散。转移为播散的一种方式，即肿瘤细胞脱离“母体”，通过某种渠道（如血道、淋巴道、腔道等）运转到与原发组织或器官不相连续的部位，在那里生长出同样一种类型的肿瘤，称为转移。扩散与转移是两个不同但互相有关的概念。

5.肿瘤的组织发生及基本形态特征

（1）肿瘤的组织发生

1）上皮组织：

外胚层如皮肤;内胚层如胃肠道;中胚层如泌尿生殖器官。

2）间叶组织：

纤维、脂肪、脉管、肌细胞、骨组织、软骨组织、黏液组织、软组织等。

3）淋巴造血组织：

淋巴结及全身淋巴网状组织、骨髓等。

4）神经组织：

神经纤维、神经母细胞、神经胶质细胞、神经节、神经鞘膜、APUD（神经外胚层）。

5）胚胎残余组织：

脊索瘤、肾母细胞瘤、肝母细胞瘤、肺母细胞瘤等。

6）组织来源未定：

腺泡状软组织肉瘤、透明细胞肉瘤、上皮样肉瘤、颗粒细胞肌母细胞瘤等。

（2）肿瘤的组织结构

1）肿瘤的实质（parenchyma）：

指肿瘤细胞，为具有特征性的部分，为判断肿瘤类型和命名及分类的主要依据。机体内几乎任何组织都可发生肿瘤，故肿瘤实质的形态也是多种多样的，与组织来源和分化程度密切相关。

2）肿瘤的间质（mesenchyma;stroma）：

由结缔组织和其中的血管淋巴管等构成，对肿瘤起支架作用，并供给肿瘤营养和运走代谢产物。肿瘤藉间质与宿主机体维持联系。间质不具有肿瘤性特征，各种肿瘤的间质基本相同，但在数量、分布及间质中各成分的比例上有所差别。

3）常见的肿瘤分级法：

高分化、中分化、低分化和未分化。肿瘤分化越高，恶性度相对较低;分化越低，恶性度越高。

（二）病理学诊断的研究技术

1.常规HE病理诊断

通过组织HE染色观察组织形态的改变，是病理学诊断的最基本和最主要的方法，它包括取材、固定、脱水、包埋、切片、染色、封片及阅片等几个主要步骤。

2.免疫组化

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的方法。免疫组化方法有直接法和间接法;按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

（三）分子诊断技术

通过从分子水平上完成DNA、RNA或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断技术，常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测。

1.基因诊断

用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法。基因诊断不仅能对某些疾病作出确切的诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。基因诊断的主要技术有核酸分子杂交（原位杂交、southern杂交、northern杂交、斑点杂交等）、PCR和生物芯片技术。

2.肿瘤标志物检测

是指肿瘤细胞和组织由于相关基因或异常结构的相关基因的表达所产生的蛋白质和生物活性物质，在正常组织中不产生或产量甚微，而在肿瘤患者组织、体液和排泄物中可检测到。此外，在患者机体中，由于肿瘤组织浸润正常组织，引起机体免疫功能和代谢异常，产生一些生物活性物质和因子，虽然这些物质和因子特异性低，但与肿瘤发生和发展有关，也可用于肿瘤辅助诊断。肿瘤标志物分别有：原位性肿瘤相关物质、异位性肿瘤相关物质、胎盘和胎儿性肿瘤相关物质、病毒性肿瘤相关物质、癌基因、抑癌基因及其产物等。肿瘤标志物测定方法包括：生物化学法、免疫组化法、单克隆抗体法。

（四）电镜技术

由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1μm以下的薄片才能适用，这种薄片称为超薄切片，切片的制作过程基本上和石蜡切片相似。组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象，容易出现人为假象，此外，还可能由于组织干燥脱水、微生物污染等使细胞的超微结构受破坏。因此标本取材时必须要做到快、小、冷、准等四大基本要求。电镜分透射电镜和扫描电镜，两者标本的制备各有不同。

二、免疫组化在肿瘤病理诊断中的应用

免疫组织（或细胞）化学技术是免疫学与组织化学两种技术的结合，它的基本原理是应用抗原与抗体的特异性结合，再用显色剂显色达到标记细胞的某种抗原物质的定性与定位检测技术，是一种方法简单且有效的肿瘤标记技术。当前在免疫组化技术围绕着提高敏感性与特异性不断改进和发展，但它仍有其局限性——应用于蛋白水平，敏感性与特异性不足，故应与其他组织化学、电镜及分子生物学技术相结合。

（一）免疫组化在诊断中的应用原则

1.防止假阳性与假阴性，防止操作中的污染，规范操作，设阳性与阴性对照。

2.选用2种以上同类抗体

目前肿瘤均为相关抗原，特异性不足，多种同类抗体可提高阳性率。

3.正确评价免疫组化的结果

其结果受抗体、特异性与质量、操作、标本固定等多种因素影响。

4.合理地选择抗体

即要符合设计的要求，价廉物美，分1、2、3线抗体。

5.待检标本抗原保存要好

要求快速、新鲜、充分地固定，合适固定剂，甲醛溶液固定标本要修复抗原。

（二）肿瘤诊断中免疫组化常用标记

1.上皮性肿瘤标记

（1）角蛋白（keratin）：

一种中间丝蛋白，分：①表皮角蛋白（epidermal keratin，EK）——鳞状上皮或高分化鳞癌标记;②细胞角蛋白（cytokeratin，CK）——低分子角蛋白，对腺癌、移行细胞部及低分化鳞癌标记。一般用广谱型角蛋白抗体为好，常用。

（2）上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）：

这亦是常用的上皮细胞标记抗体，细胞膜阳性，用Zanker's、Bouin或B5固定液中固定为好。其在低分化和未分化上皮中表达好，但亦可在间变性大细胞淋巴瘤、恶性横纹肌样瘤中表达。

（3）桥粒蛋白（desmoplakin）：

主要标记上皮桥粒，DesmoⅡ仅表达于复层上皮。

（4）癌胚抗原（carcinoembrgonic antigen，CEA）：

是从结肠癌中分离而得一种球蛋白，定位于细胞膜上，对肠、胃、肺、胰、肝、乳腺等腺癌标记阳性，但个别非上皮肿瘤也可阳性。

（5）甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）：

由胎肝细胞提取的一种酸性糖蛋白，细胞质和膜上表达，它对肝细胞癌、卵黄囊癌的特异性标记。

2.间叶源性肿瘤免疫组化标记

间叶组织包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、血管、骨、软骨及外周神经等，间叶组织肿瘤往往由多向分化的原始间叶细胞产生，存在共性，标记抗体特异性不足，有交叉反应。

（1）波纹蛋白（vimentin，Vim）：

是一种细胞中间丝蛋白抗体，在多数软组织肿瘤均可表达，但纤维细胞较明显，在一些上皮性肿瘤也有阳性反应。常用作间叶源与上皮源肿瘤的第一线鉴别抗体。

（2）结蛋白（desmin，Des）：

平滑肌、横纹肌均可阳性。

（3）肌动蛋白（actin）：

平滑肌、血管内皮、肌上皮细胞标记，HHF35特异。

（4）肌球蛋白（myotlobin），肌红蛋白（myosin）：

对横纹肌标记较好。

（5）第Ⅷ因子，CD34：

对血管内皮细胞肿瘤标记较特异。

（6）S-100蛋白：

是一种周围神经雪旺细胞特异标记抗体，后发现对脂细胞、朗格罕氏细胞、肌上皮细胞、黑色素细胞及其肿瘤均可阳性。

（7）酸性或碱性磷酸酶：

对骨与软骨肿瘤标记好。

3.双向分化肿瘤标记

即有上皮与间叶两种细胞分化的肿瘤的标记，如滑膜肉瘤、间皮肉瘤、脑膜瘤、癌肉瘤、上皮样肉瘤等，一般采用CK、EMA标记上皮，Vim等标记间叶细胞。另外有一种恶性纤维组织细胞瘤，由纤维细胞、肌纤维母细胞和组织细胞混合组成的恶性肿瘤，故应用Vim和组织细胞标记来诊断。

4.神经细胞、胶质细胞及神经内分泌肿瘤标记

（1）神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）：

神经元肿瘤标记。

（2）胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillaly acidic protein，GFAP）：

脑胶质细胞特异性标记抗体。CD34+F8血管。

（3）神经内分泌肿瘤标记：

包括类癌、胰岛、垂体瘤、甲状腺髓样癌、皮肤Merkel细胞癌、原始神经外胚层瘤（PNET）等，目前应用NSE、嗜铬蛋白颗粒A（CgA）及触突素（Syn）三种抗体同时或两种一起用，因NSE不够特异。

5.淋巴网状组织肿瘤（淋巴瘤）标记

（1）B细胞标记抗体：

CD20（L26）、Ig重链（IgG、M、A、E）、轻链（λ、κ）、PAX5、CD79a。

（2）T细胞标记抗体：

CD45RO（UCHL-1）、CD3。

（3）组织细胞标记抗体：

Mac387、CD14、抗溶菌酶（lysozyme）、抗糜蛋白酶（α-1 antichymotrypsin）等。

（4）霍奇金淋巴瘤（hodgkin's lymphoma，HL）R-S细胞（reed-sternberg cell）标记抗体：

CD15、CD30。

（5）白细胞共同抗原（leucocyte common antigen，LCA）：

它对淋巴网状细胞均为膜阳性，作第一线抗体为好。

6.肿瘤细胞增殖活性与细胞凋亡标记抗体

瘤细胞增殖指数反映细胞增殖活性，是瘤细胞新生（恶性）状况的客观指标，与凋亡指数呈反比关系，常用抗体有：

（1）增殖细胞核抗原（proliferative neuclear antigen，PCNA），核阳性。

（2）Ki-67：

核阳性，可用于石蜡切片标记。

（3）细胞凋亡（apoptosis）标记抗体：

开始发现细胞凋亡发生于正常细胞受基因调控性自然性死亡。后发现肿瘤细胞亦可发生，而且某些药物放、化疗亦可诱发细胞凋亡，故成了研究肿瘤发生、发展、治疗的热点。其标记抗体有：

1）凋亡抑制基因蛋白抗体：

bcl-2、bcl-xl、mtp53。

2）促凋亡基因蛋白抗体：

fas/fasl系统、wtp53、bax、bcl-xs、fas等。tunel标记。

7.癌基因与抗癌基因，促转移与转移抑制基因蛋白抗体标记。

目前应用很多，因方法比分子生物学技术简单，但是这种结果不能直接反映肿瘤基因的活性，只能间接反映肿瘤基因代谢活性，要注意正确评价它的价值。

（三）免疫组化在恶性肿瘤治疗中耐药预后评估的应用

1.常见恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记，全套4项

P-gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67。多药耐药基因蛋白（P-Gp）起到药泵作用，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、VCR、紫杉醇。谷胱苷肽S转移酶（GSTπ）起到解毒作用，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、DDP、氮芥、环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、瘤可宁。拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）起到靶点作用，阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26阳性率高者对VP16尤其有效。

2.乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项

P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，C-erbB-2。雌激素受体（ER）为性激素作用，阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。孕激素受体（PR）也为性激素作用，阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。C-erbB-2为癌基因产物，阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。ER、PR阳性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效果不好。Ki-67作为细胞增殖标志，阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。Ki-67为细胞增殖的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA（增殖细胞核抗原）（图1-4）。

图1-4　免疫组化组织病理形态

三、分子病理诊断在肿瘤中的应用

近十余年，分子诊断已由实验室逐步进入应用阶段，分子病理学诊断的特点是灵敏度高、特异性强、适用范围广，取材一般不受组织或时相限制，具有广泛的应用前景，在肿瘤分子病理研究中正展示其重要价值。

（一）分子诊断在肿瘤研究中的意义

1.肿瘤易感基因的检测

肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛检具有实用价值，已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有Rb1（视网膜母细胞瘤）、WT1（肾母细胞瘤）。p53（li-fraumeni综合征）、APC（家族性腺瘤性息肉病）、HNPCC（遗传性非息肉病性结肠癌）、NF1（神经纤维瘤病）、VHL（vonHippel-lindau综合征）、PTEN（bannayan-riley-ruvalcaba综合征）、BRCA（家庭性乳腺癌、卵巢癌）等。除了检测高危人群的易感基因外，有方法也应用于正常人群肿瘤易感性检测，如检测Ret基因突变用于诊断Ⅱ型多发性内分泌肿瘤，通过分析GST基因型以判断个体暴露于致癌物时的致癌危险性等。

2.肿瘤的分类

判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源，应用RFLP分析免疫球蛋白或T细胞受体基因重排，具有鉴别诊断作用，且这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。对Bcr区基因重排的检测，可对慢粒和急粒进行鉴别诊断。N-myc和C-myc扩增和表达的检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值，因前者N-myc明显扩增，而后者则为C-myc明显扩增。

3.肿瘤的早期诊断

K-ras基因突变是一种胰腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤中发生率较高的分子事件，突变集中在第12、13和61编码子。应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌的第12编码子变突，检出率可达100%，应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中的Ras基因突变，其检出率与瘤组织中相似，可用于高危人群的筛选。

4.肿瘤的预后判断

肿瘤基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关，如P53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关，nm23的状态则与肿瘤转移相关。研究发现从分子水平上判断肿瘤的生物学行为及预后具有较高的准确性。如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化，提出了结肠癌癌变和演进的分子模型，阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征。此外，文献中对胃癌、肝癌、肺癌等也提出了类似的分子模型。

5.肿瘤的预后监测

分子诊断在肿瘤的监测方面也具有重要的作用，如临床治疗缓解期内白血病的白血病细胞仍达1011，用细胞遗传学方法检出率约为1～5%，应用核酸杂交技术灵敏度可达0.15%～0.05%，而PCR技术则可使检出率达到10-6左右。提高了对肿瘤转移、复发监测的准确性，有助于及时采取适当的治疗措施。

6.为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据

肿瘤发生、发展的不同时期，可能涉及不同基因的不同变化形式，而基因的变化及基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关，如能在分子水平对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺癌中存在Ras基因的激活，50%左右的肿瘤有p53基因不同形式的突变，这些基因的异常，使肿瘤对某些放疗或化疗的方法具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放、化疗的敏感性。

（二）分子诊断在肿瘤研究中的应用

1.基因过表达的检测

癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中的关键因素。癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为重要形式之一，可表现为mRNA和蛋白质量的增加，此外，基因扩增可表现为基因拷贝数的增加，这些基因表达的异常，均可加以检测。

（1）表达产物的检测：

蛋白质水平基因表达产物的检测最常用的方法为免疫组化技术，也可应用酶联免疫吸附和Western蛋白印迹法。新一代测定方法为流式细胞仪法（flow cytometry），更新的影像细胞测试法（image cytometry）则可应用特定波长的光密度进行积分，进行特定蛋白质的定量分析。

（2）基因扩增的检测：

基因扩增主要表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，经典方法为DNA和RNA和印迹杂交。但应用更普遍的为组织细胞原位核酸分子杂交，包括原位杂交、荧光原位杂交、对比基因组杂交。近年发展较快的荧光原位杂交和对比基因组杂交在肿瘤分子诊断中具有重要的应用价值。原位PCR技术作为一种敏感性高、特异性强、能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的研究方法，在分子诊断中发挥了重要作用，其灵敏度比原位杂交高出2个数量级，是形态学和分子生物学前沿交叉的产物，对前沿研究和学科发展起着巨大作用。Anderson曾在1994年生动地指出“原位PCR使光学显微镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸”。

2.基因突变的检测

癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生中出现频率较高的分子事件，不仅在肿瘤细胞中可检测到突变基因，在一些癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存在不同形式和程度的基因突变，基因突变的检测对研究肿瘤发生机制、诊断和鉴别诊断、预后评估及治疗方案选择等都有重要价值。基因突变形式主要有点突变、基因缺失（1～2个碱基缺失，一个片段或一个外显子缺失）、基因易位或重排、基因插入、甲基化及染色体非组蛋白改变等。

基因突变及其检测方法研究已成为生命科学研究的热点。1985年以前，主要应用southern杂交，可筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式，对于不能用该法检测的突变，也可用NDA序列测定分析，但复杂费时。促进了基因突变检测技术的发展，目前大部分基因突变检测技术都是以PCR为基础，已达20余种，比较成熟的技术包括PCRSSCP法、杂合双链分析法、突变体富集PCR法、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶反应、等位基因特异性扩增法、RNA酶A切割法、荧光原位杂交、寡核苷酸引物原位DNA合成法、比较基因组杂交法和DNA序列分析等。

3.限制性酶切片段长度多态性分析

通过对DNA分子的分析识别特定基因组区域的丢失及扩增，其中较重要的一种研究为应用同一个体的正常体细胞（血细胞或瘤旁正常组织）及肿瘤细胞的DNA，检查DNA多态性座位上等位基因的不平衡性，当两个等位基因的相关性密度在正常与肿瘤细胞之间出现显著性差异时，就提示肿瘤细胞中多态性序列座位处出现突变，当DNA序列的差异发生在限制性酶识别位点或当DNA片段插入、缺失或重复，可使基因组DNA经限制性内切酶水解发生片段长度改变，在不同个体间可出现不同长度的限制性片段类型，故称为限制性酶切片段长度多态性（RFLP）。RFLP技术可直接分析癌组织中某些基因在染色体上的变异及其与肿瘤发生的关系，精确位点的RFLP分析还是发现新的肿瘤基因的有效手段。目前能用于RFLP分析的肿瘤基因探针和基因位点探针已有数百种，覆盖了人类23对染色体，是肿瘤分子诊断的重要方法之一。

4.微卫星不稳定性分析

微卫星不稳定性检测是基于数量可变串联重复序列（VNTR）的发现，细胞基因组含有大量碱基重复序列，一般将6～70bp的串联重复称为小卫星DNA或VNTR，1～4bp的串联重复称为微卫星DNA或简单重复序列（SRS），SRS为新的DNA多态性标志之一。微卫星不稳定性（MI）是指SRS的增加或丢失，特别是在DNA错配修复系统缺损的肿瘤基因组中，常显示大量MI。MI仅在瘤细胞中发现，目前已发现存在于肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤组织。检测MI方法为PCR扩增及电泳分析，如结合显微切割技术，则可使检测目的更为明确。

5.端粒酶及其检测

端粒酶与肿瘤关系的研究是近年来十分活跃且发展迅速的领域之一，近年的研究表明，人类肿瘤中85%左右的肿瘤细胞存在端粒酶活性表达，对端粒酶的研究有可能为肿瘤的发生发展、诊断、预后等提供指标，并可能以抑制端粒酶表达为手段作为肿瘤治疗的新方法。

端粒酶活性检测经典方法为端粒重复扩增技术（TRAP），TRAP法分析结果是非线性的，样品间的比较和定量比较困难，且操作复杂，也不适用于小样品，而且由于有些组织中含有Taq酶抑制物，会出现假阴性结果，目前不少研究者致力于端粒酶检测方法的改进，有人应用接近闪烁分析技术，在96孔板上进行TRAP操作，可用作大规模临床样本及端粒酶抑制剂的筛选。ELISA法是利用端粒酶在生物素标记的引物上加入多个6核苷酸端粒重复序列，反应产物用生物素标记的引物进行PCR扩增，与地高辛标记的探针杂交，再与抗生物素蛋白包被的微量滴定板结合，该法省时且无放射性污染，可减少假阴性。原位杂交法检测端粒酶活性也有报道，有可能通过原位杂交区分正常和肿瘤细胞，但仍有待于进一步的成熟，稳定。

（三）肿瘤分子诊断的发展前景及其标准化

分子诊断技术是肿瘤分子病理研究具有划时代意义的检测手段，拓宽了病理学研究的范围，使我们对肿瘤发生发展、形态特征、生物学行为的认识进入分子水平，分子诊断的大部分技术已日趋成熟，但目前还主要用于研究领域，真正用于临床检测的技术开展得还比较少，费用昂贵、操作复杂是重要原因，分子诊断技术也不能完全取代许多目前使用的行之有效的实验室诊断方法。肿瘤病理诊断仍应坚持以形态学为基础的原则，分子诊断只是这些方法的补充、改善和提高。

分子诊断目前仍存在一些问题，由于其技术一般都具有敏感性高的特点，特别是PCR技术，结果影响因素较多，最大的问题为技术性假阳性和假阴性，PCR技术本身已比较成熟，要使检测技术具有高敏感性，又要确保检测结果的高特异性和重复性，质量控制至关重要，关键在于建立标准化的实验操作程序和标准化的分子诊断实验室，除诊断技术方面的标准化外，诊断指标也要实行标准化，这样才有可能对肿瘤的诊断、鉴别诊断、浸润转移、临床治疗方案的选择及生物学行为的评估等方面提供有意义的指标，这将是每位病理学家所面临的机遇和挑战。