第五节 细胞的放射敏感性
细胞存活率或存活曲线及相应参数，是表达体外培养细胞放射敏感性最为直接和准确的方式，最简单的存活率指标是2Gy照射后的存活率（SF2），不同细胞的SF2可在0.01~0.9区间变动。细胞凋亡率也是判断细胞放射敏感性的简便指标，但值得注意的是，细胞自噬死亡（autophygic cell death）和有丝分裂灾变死亡（mitotic catastrophe）等也是放射损伤细胞死亡的重要类型。
早在1906年，法国科学家Bergonié J和Tribondeau L就发现增殖活跃细胞，以及形态和功能上尚未“成型”（未分化）细胞容易受到X射线损伤的现象，随即提出了一个“组织细胞的辐射敏感性与它们的增殖能力成正比，而与它们的分化程度成反比”的定律，即Bergonié和Tribondeau定律，这是人类揭示的放射线作用于生物体产生效应的第一个定律（规律），尽管其有一定的局限性，但其科学意义是毋庸置疑的，有不少的细胞类型符合此规律，如小肠上皮细胞、骨髓细胞、生殖细胞都是增殖活跃、更新很快的细胞，它们对放射线有较高的敏感性；肝脏、肌细胞、神经节细胞、骨细胞等分裂增殖能力很低而分化程度很高或不再分裂增殖的细胞，它们对放射线敏感度较低。但也不尽然，如小淋巴细胞是已分化细胞，也不分裂，但有很高的放射敏感性。
不仅不同组织来源细胞的放射敏感性存在差异，同一细胞所处细胞周期的不同阶段，其放射敏感性也有明显不同。对大多数细胞而言，G1期有一定放射抗性，但对G1期时程较长的细胞，随着向S期的推进，放射敏感性有所上升、到G1/S期边界点时敏感性上升到一个最高点；进入S期后开始变得不敏感即放射抗性上升，到晚S期抗性最高；进入G2和M期，细胞又再度向敏感性表型转变，M期是细胞对放射最敏感期。关于细胞周期不同时相放射敏感性差异的机制提出了多种学说，如内源性放射防护物质水平的波动，S期遗传物质的倍增，细胞在DNA合成或凝集状态下染色质DNA结构的变化等，看来主要是和细胞修复DNA损伤的能力和机会有关。
在20世纪80年代，研究人员为了探讨细胞放射敏感性的决定基因和相关机制，通过诱变技术在实验室人工培养建立了一系列放射敏感性细胞。通常采用啮齿动物细胞株如CHO细胞，用化学诱变剂诱变，然后从突变体中筛选出敏感株。由于存在突变缺陷，因此敏感性增高的程度大大高于天然细胞。用细胞互补实验，将细胞分成不同的遗传互补组，每一个互补组意味着存在一种特有的遗传学机制和缺陷基因，可供实验研究应用。最为直接的用途是分析DNA损伤修复机制，将人的基因组或cDNA转染这些敏感突变株修补辐射敏感表型，进而克隆人类DNA修复基因等。研究最为广泛的有XRCC互补组及X射线交叉互补组（X-ray cross complementing group）系列，其中XRCC5、XRCC6、XRCC7分别为DNA双链断裂修复蛋白DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）复合物中的3个亚基Ku80、Ku70和催化亚基DNA-PKcs。
另一类高度辐射敏感的细胞系来自一些特殊的遗传疾病患者。这些患者对电离辐射高度敏感，在接受放射治疗时出现过度敏感的辐射损伤反应。已经鉴别出属于这类的遗传疾患有23种之多，但由于病例稀少，或者纯合子缺失时胚胎死亡，许多病症不能得到充分鉴定。目前了解较多的为对电离辐射致死效应敏感性增高的疾患，如共济失调性毛细血管扩张症（ataxia telangiectasia，AT）和Nijmegen染色体断裂综合征（Nijmegen breakage syndrome，NBS）等。
共济失调性毛细血管扩张症（AT）是一种人类常染色体隐性遗传疾患，发生率很低，仅为十万分至数十万分之一。但作为一种典型的辐射敏感疾病受到放射生物学家的重视。其临床主要特征为小脑共济失调，步履蹒跚；眼及颜面部位有经常性的小血管和毛细血管扩张；常有免疫缺陷；癌发生率很高，主要是淋巴瘤和白血病。AT患者的细胞（成纤维细胞）在X射线照射后存活率明显低于正常细胞，其敏感性平均为正常细胞的2.7倍。血细胞染色体畸变的频率很高，有的在染色体7与14间有自发的染色体易位。ATM（AT mutated）蛋白是一个非常重要的细胞DNA损伤反应蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，属于磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）家族，其作用底物包括有H2AX、Chk2、KAP-1、p53等DNA损伤反应蛋白。AT细胞在细胞周期控制方面有异常，照射后缺乏G1阻滞，抑制DNA合成的能力弱，被称为辐射抗性的DNA合成。在DNA修复方面，初期的研究没有发现其DNA双链断裂重接修复率缺陷，只发现其修复忠实性较低。但是近来用精细的方法测到AT细胞也具有DNA修复缺陷，只是不那么明显，但仍然是导致细胞放射敏感性增加的因素之一。
Nijmegen染色体断裂综合征是一种稀有的常染色体隐性遗传疾病，它的辐射敏感、免疫缺陷、基因不稳定性及癌症倾向都与AT相似，但没有运动失调和毛细血管扩张。临床表现为小头畸形、发育迟缓。患者细胞对电离辐射敏感，T淋巴细胞培养中染色体畸变也多发生在7号和14号染色体上。NBS1与RAD50和MRE11组成MRN复合物，在DNA损伤早期被募集到DNA损伤位点，参与DNA双链断裂损伤修复的早期信号调节反应。MRN复合物还具有维持端粒稳定性的功能。
此外，Bloom综合征、Fanconi综合征、Werner综合征等也属此类遗传疾患。患者有明显的癌症倾向，其细胞对电离辐射及多种DNA损伤剂敏感，并有很高的自发染色体畸变率。
由于DNA双链断裂是与细胞死亡关系最密切的一种损伤，在20世纪八九十年代，双链断裂损伤修复与细胞放射敏感性之间的关系是放射生物学中最受人注意的一个领域。至于与细胞放射敏感性关系最为密切的是初始DNA双链断裂损伤量还是细胞DNA修复效率，不同研究者采用不同的细胞模型，提出了不同的观点。所谓初始DNA双链断裂损伤是指在照射后即刻、尚未发生修复前细胞内的DNA双链断裂损伤量的总和，它与照射剂量间存在线性依赖关系。哺乳动物细胞γ射线照诱发的DNA双链断裂损伤的修复是一个双相的动力学曲线（图1-5-1），即早期的快速修复相，在照射后30~40分钟内能修复50%~70%的双链断裂量，和随后的慢速修复相，能持续到照射24小时甚至更长的时间。同时还可以看到不同细胞的放射敏感性差异，有的修复缺陷是出现在快速修复相如SX-10细胞，有的是出现在慢速修复相如A2780细胞。
对人类不同细胞的放射性感性的研究显示，DNA双链断裂修复效率而非初始损伤量是细胞放射敏感性的一个决定因素。DNA双链断裂的修复效率与细胞放射敏感性关系已得到公认，即修复缺陷的细胞，放射敏感性都是高的，并有考虑将双链断裂修复测定应用于细胞放疗敏感性预测。细胞受照射后经过一定时间的修复，其残留的DNA双链断裂水平即残留损伤，是上述初始损伤和修复效率两个因素的综合，被认为是一个更加理想的反映或预测细胞放射敏感性的生物学指标。通过比较不同组织来源、甚至不同种系来源的细胞系受照射后修复2小时的双链断裂的残留损伤量，发现与SF2（图1-5-2）和D0值（图1-5-3）有良好的相关性。与DNA双链断裂修复的还有一个衡量指标，即修复忠实性。错误的重接不能恢复DNA的正确结构，也会影响细胞活存或引起突变。部分放射敏感细胞是由于其修复忠实性较差造成的，AT细胞就是一个例子，检测其DNA双链断裂的重接修复速率并没有显著降低，但其修复忠实性降低。同样，还有一些敏感细胞株中检测不到明显的DNA重接修复率的缺陷，这意味着还存在影响敏感性的其他机制，其中就包括细胞凋亡机制的异常。
与DNA损伤修复有密切关系的另一因素是真核细胞的染色质结构。DNA与蛋白质的结合状况对损伤形成及修复都有影响。在细胞核内，DNA超螺旋形成环状区（loop），以30~60kbp的间隔，通过一段特殊序列与核基质相结合。这种结构使染色质分隔成独立的区域，对DNA复制、转录、修复的立体控制有很重要的作用。而且，在不同区域中重接修复动力学可能不同。有学者提出假设：与核基质结合的区域有两种类型，一种结合较松（对蛋白酶敏感），发生断裂时不仅影响断裂所在的环状区，而且还影响邻近环区的重塑；另一种结合牢固，不易脱开，断裂只影响本环状区。辐射抗性细胞可能有更多的，或均匀分布的牢固结合点。
通过对各种辐射敏感细胞株的遗传学互补组分析和生化研究，定位和克隆出了多个受累及的基因，大大增加了我们对细胞放射敏感分子机制的认识。当一个新的基因被克隆后，通过序列比较、同源性分析，便能获得其编码产物性质和功能线索，再通过基因剔除、基因转染和基因沉默等技术又能对其在细胞内的功能有更加细致了解。从已知情况分析，参与决定细胞敏感性的基因为数极多，因为参与DNA修复、周期调控、细胞凋亡等基因都应该包括在内，如PARP1、DNA-PKcs、ATM、HDAC、EGFR、AKT等。这些基因的功能状态与放射敏感性密切相关。
p53蛋白被誉为基因组的“护卫者”，具有调节细胞凋亡和周期检查点等多重生物学功能，p53对细胞的放射敏感性有着重要的影响。辐射引起的DNA断裂损伤信号激活p53的上游分子如ATM，后者磷酸化激活p53蛋白，使其半衰期得到短暂的延长（从几分钟到几小时），并在核内蓄积。活化的p53能激活Gadd45及WAF1/CIPI基因，后者编码的p21蛋白是细胞周期激酶的抑制剂，导致细胞周期阻断在G1/S检查点。理论上，阻滞在G1期的细胞可赢得更多的时间修复DNA损伤，有利于改善细胞存活。近年来的研究进一步认识到p53还参与细胞的G2/M检查点调控。单从细胞周期检查点功能来看，p53野生型细胞在受到照射后，其细胞活存理应比p53突变细胞高。但多种p53突变细胞的辐射抗性比野生型细胞更高，这主要归咎于p53的细胞凋亡功能。因此p53在调节细胞的放射敏感性的作用和机制是比较复杂的。很显然，凋亡抑制基因如survivin的缺失会导致细胞的放射敏感性增加。