第二节 分子标志物的形成机制
肿瘤治疗的目的是防止肿瘤扩散，因此治疗终点与克隆形成密切相关，而肿瘤细胞的失活、微环境和系统效应也可能在其中发挥作用。相类似，在放疗早反应机制中，正常上皮等组织的特征是细胞不断更新。正常情况下，干细胞不对称分裂产生临时扩增细胞（transit-amplifying cell，TAC）前体细胞，同时保持在壁龛（niche）中的干细胞数目。严格的细胞生成调控与终末分化细胞丢失（脱落或凋亡）之间的平衡保证了组织稳态。而辐射诱导的克隆形成细胞失活对早反应组织非常重要。在小肠陷窝和绒毛中，干细胞niche由4~6个干细胞组成，被保护在陷窝里，产生TAC，使得小肠黏膜细胞通过扩增和分化保持不断更新。如果一个或部分干细胞丢失，则剩余的干细胞会暂时进行对称分裂，直到丢失的干细胞被补充替换。然而，如果4~6个干细胞全部丢失，因为细胞的更替率很高，绒毛就会在几天内消失了。如果陷窝中干细胞数目为n，在辐射剂量D后的细胞存活分数为SF，则失活的细胞数等于（1-SFD）n。因此，因此SFD=0.01的照射剂量可使全部4~6个干细胞失活的可能性为94%~96%。通过辐射事故和动物实验的研究表明，剂量D≥10Gy的照射对小肠是致命的。此外，除了干细胞的靶向失活，基质效应也可能参与其中。高剂量的单次照射15Gy或更高剂量可诱导微血管内皮细胞凋亡，这是由于酸性鞘磷脂酶释放第二信使神经酰胺所致。当剂量约为20Gy及以上时，新合成的神经酰胺可能通过诱导神经酰胺合成酶而促进凋亡。虽然内皮细胞凋亡的作用一直存在争议，但小肠毛细血管的损伤会导致陷窝内干细胞的间接死亡。另一个研究较好的早期反应系统是小鼠舌上皮。分次照射研究表明，干细胞在分次照射的早期会慢慢耗尽。然而，当耗竭达到一定水平时，干细胞的数量对上皮细胞的更新至关重要，一些干细胞从不对称细胞分裂转变为对称细胞分裂，使得在分次照射剩余的时间里，细胞更新速度能够与细胞丢失率相匹配。上述两个例子表明，即使是细胞快速更替的早反应组织，克隆细胞失活的作用在辐射毒性方面也可能被其他生物过程所改变，例如通过不对称干细胞分裂向对称干细胞分裂的转变、或凋亡通路之间的变化等。此外，由活性氧（ROS）和细胞死亡碎片引起的炎症反应，以及细胞因子和免疫细胞介导的炎症反应在早期反应中也发挥重要作用。而免疫细胞会产生ROS，从而在正常组织中、甚至在照射区域以外的细胞中产生进一步的氧化DNA损伤。
近来通过生物信息学方法，基于炎症和免疫细胞在肿瘤和正常组织照射后的反应，鉴定出一个由24个基因组成的分子网络，这些基因在肿瘤和正常组织中有共同的差异表达。编码NF-κB家族成员和其他转录因子的基因，细胞因子的激活，细胞因子受体、趋化因子、细胞因子、生长因子、信号分子和细胞黏附分子参与了免疫细胞向受损组织的募集。正常组织照射后差异调节的基因包括辐射反应和细胞周期基因TP 53、CDKN1A和CCND 1，这几个基因参与细胞因子表达和信号转导，也包括促凋亡和抗凋亡基因，以及编码Ⅰ型胶原链和Ⅲ型胶原链的基因。大多数基因是通过对人外周血或在动物实验对脑组织的照射来鉴定的，其表达谱与细胞因子和免疫细胞在正常组织反应中的作用以及淋巴细胞对中等剂量电离辐射的凋亡反应一致。然而，NF-κB不仅限于血细胞和大脑组织。辐射诱导NF-κB的表达、激活或易位在不同的细胞和组织参与调控大量的促炎基因、趋化因子、趋化因子受体和细胞黏附分子的表达。
晚反应组织对细胞更新的依赖要比早反应组织少得多，最常见的是累及结缔组织或器官造成纤维化。成纤维细胞在照射后不容易发生凋亡，但会造成细胞周期的永久停滞，并在较长的时间内继续具有代谢活性。虽然辐照后的成纤维细胞常被称为衰老（senescent），但过早的终末分化（premature terminal differentiation）可能是更加合适的术语。随着细胞外基质蛋白合成增多，引起基质金属蛋白酶（MMP）的表达下调和MMP组织抑制剂（TIMP）的表达上调，导致蛋白质分解活性降低。此外，部分细胞分化为收缩性肌成纤维细胞，表达α-平滑肌肌动蛋白。虽然真正的间充质干细胞可能只存在于骨髓中，但TAC室中的混合祖细胞，包括早期残留增殖能力较高的细胞，可以从生长的皮肤样本分离。由于祖细胞成纤维细胞的分化是沿着一个长的TAC分化谱系、呈指数扩张，因此少数的干细胞或早期祖细胞分裂就足以维持体内平衡。
很多研究表明不同的正常组织反应终点在放疗患者中并不总是密切相关。因此，乳腺癌患者放疗后的皮肤毛细血管扩张发生风险与红斑和真皮下纤维化的发生风险无关。然而，最近的一项更大规模的研究显示，尽管总体上发生纤维化的风险远低于毛细血管扩张，乳腺癌放疗后伴毛细血管扩张的患者，其发生纤维化的风险亦显著增加。在RAPPER研究中（radiogenomics：assessment of polymorphisms for predicting the effects of radiotherapy），剑桥乳腺IMRT（调强放疗）试验共纳入778例乳腺癌放疗患者，相关系数普遍较低，尽管在几个终点（如乳房收缩与其他6个终点之间，以及乳腺硬化、水肿和毛细血管扩张之间）之间存在显著的相关性，但乳腺硬化与毛细血管扩张之间无显著相关性。不同终点之间缺乏密切的相关性，尤其是辐射诱导的纤维化与毛细血管扩张之间缺乏密切的相关性，这一观点支持了在不同终点的发病机制上存在差异的观点。因此，纤维化晚期反应被认为是由不同类型的细胞间复杂的相互作用引起，涉及炎症和纤维化反应，细胞因子和免疫细胞的共同参与。
伤口愈合是研究最为充分的纤维化过程，包括三个不同的时相：炎症期、增殖期和重塑期。电离辐射诱导表达炎性细胞因子和趋化因子，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6。导致血管扩张，损伤组织肿胀，免疫细胞（特别是巨噬细胞和中性粒细胞）的聚集。此外，直接照射免疫细胞可诱导炎症小体（inflammasome）的表达。在急性炎症期，受损的细胞外基质（ECM）成分发生蛋白降解。随后是增殖期，表现为T辅助淋巴细胞通过Th2细胞应答而发生分化，以及细胞因子的表达，包括转化生长因子-β1和血小板源性生长因子（PDGF）等。成纤维细胞通过沉积新合成的ECM蛋白（如Ⅰ型和Ⅲ型胶原）修复创面，分化成纤维细胞收缩伤口。在重构阶段，通过蛋白质水解和ECM沉积的动态过程对初始沉积的ECM进行修饰调整。纤维化发展时这些过程是不平衡的，有利于ECM的沉积。然而，炎症似乎并不是诱导纤维化形成的绝对先决条件，在某些情况下，巨噬细胞分泌的转化生长因子-β1被认为通过上皮细胞的上皮间充质转化（EMT）而发挥作用。
活性氧产生的炎症因子相互作用形成细胞因子网络，被认为对辐射应答发挥关键作用。辐射引起的乏氧被认为在纤维化反应的发展中起重要作用。因此，在某些形式的纤维化中观察到血管的消失。目前认为不同组织中的放射性纤维化的形成和进展，其分子机制可能不同。目前认为TGF-β1是一种分子开关，通过Smad3途径被过度合成的胶原和其他ECM蛋白激活。然而，在放射性肠病，纤维化反应被发现是由Rho/ROCK介导的TGF-β1的靶基因——CCN2（结缔组织生长因子，CTGF）激活。
癌症治疗的进展使得更多患者得以长期生存，因此除了上述确定性终点外，目前越来越多的证据显示涉及基因改变（突变或恶性转化）的随机终点也非常重要。最近的Meta分析估计，成人放疗后发生第二癌症的相对风险为1.2，而儿童的风险可能更大。基因组不稳定性被认为是辐射诱发癌症的重要危险因素。对电离辐射极度敏感的患者，可能由于存在ATM基因等罕见突变，而非常见变异。对于绝大多数接受放疗的患者来说，可能存在多种机制和途径参与决定个体的不良反应风险。因此，在描述患者的“放射敏感性”时必须谨慎，因为发生特殊的正常组织反应的风险可能取决于特定的终点。事实上，“放射敏感性”一词意味着定量测量患者个体的剂量-效应关系，通常是不可能的。如果不同终点的机制、细胞和途径各不相同，而外部因素，如剂量或分次剂量，可能进一步混淆这些机制，则基于单一遗传或功能研究的方法一般不适用于某个特定环境之外。一方面可以认为，对通过遗传变异进行无偏倚的筛选可以确定相关基因；另一方面，特定的细胞系统和功能分析可能需要更密切地反映有关终点的机制。