第五节 基于组学的新型生物标志物
现有的有关正常组织放射性损伤的生物标志物往往基于单个或少数指标，缺乏对辐射损伤发生发展规律的综合性认识和系统性评价，因而往往较难做出精准判断。得益于分子生物学理论及新一代高通量测序技术的发展，目前已能从基因组、转录组、蛋白组、代谢组等水平对个体进行快速、精准检测，而利用生物信息学手段对上述测序数据进行整合、分析，往往能揭示疾病的发病机制及发生发展规律。因此，基于多组学的新型生物标志物系统可以满足临床放疗中对正常组织放射性损伤进行早期诊断、精准分类的要求。
血液蛋白质组（proteome）是指人体血液中所有的蛋白质，相应的，多肽组（peptidome）则对应于人体内所有内源性的肽。而蛋白质组学（proteomics）则致力于分析人体血液中的蛋白质组与多肽组，由于蛋白质是器官对治疗所做出的应答的最广泛的反应，因而理论上来说蛋白质组学具有预测正常组织放射性损伤风险的生物标志物的巨大潜能。血液中蛋白质组学的检测手段主要依赖于质谱（mass spectrometry，MS），其中，最为常见的一种类型为基质辅助激光解吸离子化技术（matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI），而这方面的开创性临床试验来自于加拿大多伦多PMH的Menard及其同事，他们入组了68例经病理学确诊的恶性肿瘤患者，在放疗前后抽取每位入组患者的血清，随后他们应用以质谱为基础的高通量方法建立这些患者血清样本中的蛋白质组学，而研究结果不仅揭示了包括白细胞介素6前体蛋白在内的23种潜在的蛋白质碎片/多肽组，更证实了使用基于质谱的方法建立放疗后患者血清中蛋白质组的可行性（该方法区分未照射以及照射后的灵敏度以及特异性均高于90%）。然而，该开创性研究还存在一些不足，例如，其入组患者之间的异质性较大（包含18种来源于9种不同解剖学部位的肿瘤，且外照射放疗剂量从1.5~86.4Gy）。
后续开展的一项临床试验旨在通过入组更同质性的肿瘤患者以进一步鉴定出一套由多种蛋白质/多肽组成的，能特异性反应正常组织放疗反应的“指纹系统”，在该临床试验中，研究者入组了46例接受根治性放疗的喉鳞癌患者，其总照射剂量从51~72Gy，他们分别在放了前、放疗开始后2周，以及放疗结束以后4~6周抽取患者的外周血样本，随后通过基于质谱的方法检测患者外周血样本中低分子量（2000~13 000Da）的蛋白质组，检测结果表明虽然与放疗前相比，放疗开始后2周患者外周血样本中的蛋白质组表达基本相似，但放疗结束后4~6周时患者血样本中蛋白质组表达与较早两个时间点有较大不同：在已经注册的312个肽离子（peptide ions）中，有41个的表达水平发生了显著的改变，包括纤维蛋白原α链（fibrynogen α chain）、β2微球蛋白（β2 microglobulin）、半胱氨酸3（cystatin 3）以及上文中讨论过的具有潜在预测口腔唾液腺放射性损伤的淀粉酶βA4（amyloid β A4）与淀粉酶α（amyloid α）等等，并且其中的绝大多数肽离子与肿瘤及急性期炎症反应相关，虽然该研究入组的样本量较少（只有46例），因而得出的结果并不具备很强的统计学意义，然而，这项先导临床试验仍然首次揭示了使用基于质谱的方法检测患者放疗后血样本中多种肽成分组成的“签名（signature）”用于正常组织生物剂量计的可行性。
另一项前瞻性临床试验入组了72例接受根治性调强放疗的头颈部鳞癌患者，研究者在放疗前、放疗中以及放疗结束以后1月及1年等时间点上分别抽取患者的血样本，随后同样通过基于质谱的方法检测这些样本中小分子量（800 ~ 14 000Da）蛋白质组的表达水平，研究结果发现分子量在该范围内的319个肽离子中，绝大多数的表达水平在放疗后早期（放疗中以及放疗结束后1月）的时间点上出现了较大的变化，而部分肽离子表达水平的变化在放疗后晚期（放疗结束以后1年）的时间点上逐步消失，上文中已经提及，放射性急性口腔黏膜炎是头颈部肿瘤患者接受放疗后最常出现的正常组织毒性反应，研究者还发现放疗后患者血样本中这些肽离子表达水平的变化与患者急性放射性口腔黏膜炎的发生与严重程度相关，进一步提示基于患者血样本中的蛋白质组学预测正常组织放射性毒性反应风险的可行性，值得注意的是，考虑到与传统放疗技术不同，调强放疗的特点是有较大体积的正常组织会受到较低剂量照射，该试验的研究者还发现放疗后这部分肽离子表达水平的改变与患者受较低剂量照射的较大体积正常组织相关，而非局部受较大剂量照射的治疗靶点，提示外周血中蛋白质组学的改变可能更反应了患者全身对放疗的系统性反应。
除了头颈部肿瘤以外，有一项临床试验还入组了126例接受根治性外照射放疗的前列腺癌患者，其最高照射剂量达到了76Gy，研究者分别在放疗前、放疗中、放疗结束立即以及结束后3~4周等5个不同时间点上连续采集这些入组患者的外周血样本，并同样通过基于质谱的手段检测这些外周血样本中低分子量（2000 ~ 16 000Da）蛋白质组的表达，结果表明，与放疗前的基准相比较，放疗结束后3至4周患者血标本中蛋白质组的表达改变最为显著，在所有218个被检测出的肽离子中，有27%（58个）肽离子的表达水平显著改变，接下来，研究者按急性放射性毒性反应的严重程度将入组的患者分为轻度（患者未发生高于1度的放射性毒性反应）以及中/重度（患者至少发生一次高于1度的放射性毒性反应）两组，而统计学分析未能发现两组患者血样本中的蛋白质组表达水平存在显著差异，究其原因，作者认为虽然外周血中蛋白质组学的表达改变可以反应机体正常组织对放疗的反应，然而，由于与头颈部鳞癌患者放疗相比，前列腺癌患者对放疗相对较为耐受，正常组织急性放射性损伤发生率及严重程度均较低（对于所有入组的218例患者，放疗后仅有6例发生了3度的胃肠道/泌尿道放射性损伤），因而该临床试验的研究结果未能发现放疗后血液中蛋白质组表达改变与正常组织放射性损伤的严重程度相关。
尽管基于基质辅助激光解吸离子化技术的质谱方法能迅速检测出样本中蛋白质和（或）肽的大致分布，然而该方法却并不能为这些被检测出的蛋白质/肽成分提供精确地信息。而液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）则是目前精确鉴定样本中蛋白质/肽组成的“金标准”。一项入组了20例头颈部鳞癌患者以及20例前列腺癌患者的前瞻性临床试验使用液相色谱-串联质谱法检测放疗前后患者血液标本中大约450种蛋白质的表达水平，所有入组患者均接受根治性外照射放疗，对于头颈部鳞癌患者组，有22种蛋白质的表达水平在放疗后显著增加，而这些蛋白质大多与急性期炎症相关，此外，该研究还发现有33种蛋白质的表达水平在放疗后显著降低，这些蛋白质大多参与脂质运输、代谢以及血液凝固，并且这些血液中蛋白质表达水平的改变与患者口腔黏膜炎等正常组织急性放射性损伤相关，然而，前列腺癌患者放疗前后外周血中蛋白质表达水平未发生显著改变，与上文中讨论过的基于基质辅助激光解吸离子化技术质谱检测的临床试验结果相一致。在另一项使用液相色谱-串联质谱法测定血浆中蛋白质组学的临床试验中，研究者从57例接受外照射放疗的非小细胞肺癌患者中，入组了其中20例肿瘤分期配对的患者，其中有6例发生了至少为2度的放射性肺炎，而其余入组的14例患者未发生放射性肺炎，研究者在放疗开始前，放疗开始后第2、4、6周，以及放疗结束后第1、3月等时间点分别抽取患者血浆样本，随后通过色谱串联质谱检测血浆中蛋白质组的表达水平变化，在鉴定出的100多种表达水平改变较大的蛋白质中，76种在至少两个时间点上表达水平都发生了显著改变，因而被认为具有初步的预测潜能，这些蛋白包括补体C3（complement C3）、玻璃粘连蛋白（vitronectin）等。
脂质组学（lipidome）是指人体血液中所有脂质的总和，同样使用基于质谱的检测手段可以定量患者放疗对患者血清中脂质组学表达水平的影响。在2014年，有研究者率先开展了临床试验以验证外照射放疗对患者血清中磷脂（phospholipid）表达水平的影响，该临床试验入组了66例接受根治性放疗的头颈部肿瘤患者，研究者分别在放疗开始之前、放疗中以及放疗结束后大约1个月等时间点上分别抽取患者外周血样本，随后通过基于质谱的检测手段定量患者血样本中脂质的表达水平，与上文中提及的研究蛋白质组学的临床试验结果不同，结果发现，脂质组学表达水平的较大差异存在于放疗前与放疗中两组之间，而表达水平变化较大的卵磷脂（phosphatidylcholine）以及溶血磷脂胆碱（lysophosphatidylcholine）均在放疗开始后显著降低，而在放疗结束后则逐渐升高，提示放疗对血液脂质组学表达水平的影响要快于蛋白质组学，值得注意的是，该研究同样发现患者血液样本中这些磷脂表达水平改变的强度与患者接受较低剂量照射的较大体积正常组织相关。后续开展的另一项临床试验进一步研究了根治性调强放疗对头颈部鳞癌以及前列腺癌患者血清中脂质组学表达水平的影响，结果同样发现放疗能引起患者磷脂代谢的异常。这些研究结果初步证实外周血样本中磷脂的表达水平可能是可以用于预测患者辐射暴露的新型生物标志物。