第三节 影响酶促反应速度的因素
影响酶促反应速度的因素包括底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等。研究各种因素对酶促反应速度的影响不仅可以提供有关酶促反应的有关信息，还可作为选择酶作用的最佳条件、某些药物设计、代谢性疾病防治的理论依据，因此具有重要的理论和实践意义。
在探讨某种因素对酶促反应速度的影响时，其他因素保持稳定。
一、底物浓度的影响
在酶浓度及其他因素不变的情况下，酶促反应速度（V）与底物浓度（[S]）的变化作图，呈矩形双曲线关系（图4-10）。
图4-10 底物浓度对酶促反应速度的影响
在酶浓度恒定情况下，酶促反应的速度主要取决于底物的浓度。当底物浓度很低时，游离的酶多，故随着[S]增高，酶与底物结合产生的中间复合物（ES）量也随之增高，反应速度V随[S]增高而呈直线上升，两者呈正比关系；随着底物浓度的进一步提高，反应速度增加的幅度逐渐下降；继续加大底物浓度，反应速度不再增加而达到极限最大值，此时酶已经被底物饱和形成中间复合物，反应速度达到最大值，称最大反应速度（Vmax）。
（一）米氏方程式
1913年Leonor Michaelis和Maud L．Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米-曼氏方程（Michaelis equation）：
式中，V为在不同底物浓度时的反应速度；[S]为底物浓度；Vmax为最大反应速度（maximum velocity）；Km为米氏常数（Michaelis constant）。当底物浓度很低（[S]＜＜Km）时，反应速度与底物浓度成正比；当底物浓度很高（[S]>>Km）时，V≌Vmax，反应速度达到最大速度，再增加底物浓度不影响反应速度。
（二）Km和Vmax的意义
1. Km的意义
（1）当反应速度为最大速度的一半时（V＝1/2Vmax），根据米氏方程整理得：Km＝[S]。由此可见，Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度，单位：mol/L或mmol/L。
（2）Km是酶的特征性常数，其大小只与酶的结构、底物、反应环境有关，与酶浓度（[E]）无关。大多数酶的Km值在10－6～10－2mol/L。
（3）在一定条件下，Km可表示酶和底物的亲和力。Km值越大，酶和底物亲和力越小；Km值越小，酶和底物亲和力越大。
2. Vmax的意义
Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。Vmax不是酶的特征性常数。
二、酶浓度的影响
在底物浓度足够大的情况下（[S]>>[E]），酶促反应速度与酶浓度的变化成正比（图4-11）。
图4-11 酶浓度对酶促反应速度的影响
三、温度的影响
随着温度的升高，一般化学反应的速度加快，但酶是蛋白质，蛋白质对温度的变化极为敏感，因此温度对于酶促反应速度有双重影响（图4-12）：提高温度，一方面加快酶促反应速度；另一方面也加速了酶的变性。当温度在较低范围内，随着温度的升高，酶的活性也增加，化学反应速度加快；但温度升高到50℃以上时，酶的活性开始降低；继续升高温度达60℃以上时，绝大多数酶已经变性；在80℃时绝大多数酶的变性已经不可逆转。酶促反应速度最大时的环境温度称为酶促反应的最适温度（optimum T）。哺乳动物体内酶的最适温度为35～40℃。
图4-12 温度对酶促反应速度的影响
酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间及环境条件有关。酶在短时间内可耐受较高的温度，即反应时间短最适温度较高，反之，延长反应时间，最适温度降低。低温可使酶活性降低，但一般不会使酶失活。当温度回升后，酶活性也恢复。临床上利用酶的这种性质，采用低温麻醉，以减慢组织细胞代谢速度，提高机体对氧和营养物质缺乏的耐受性。实验室利用低温保存菌种、酶制剂；生化实验中测定酶活性时，需要严格控制反应液的温度等都基于这一原理。
四、pH的影响
酶对pH的影响极为敏感，每种酶只能在一定pH范围内有活性，在不使酶变性的pH条件下，反应的速度对pH作图，可得到一钟形曲线（图4-13），从曲线可以看出，在某一pH下，反应速度可达到最大，这一pH称为酶的最适pH（optimum pH）。偏离最适pH，酶的活性即受抑制；pH过高或过低都会导致酶变性失活。人体内多数酶的最适pH接近中性，多在6.5～8。也有少数酶例外，如胃蛋白酶的最适pH约为1.8，胰蛋白酶的最适pH为7.8，肝精氨酸酶最适pH为9.8。
图4-13 pH变化对某些酶活性的影响
最适pH不是酶的特征性常数，其受酶的来源、底物浓度、缓冲溶液、作用时间及温度等因素的影响。pH主要通过影响酶分子上极性基团的解离、底物与辅酶的解离，而影响酶的活性。酶分子的极性基团在不同pH条件下解离状态不同，所带电荷的种类和数量也不相同，酶活性中心的某些必需基团仅在某一解离状态才最容易同底物结合或具有最大的催化作用；许多具有可解离基团的底物与辅酶的解离状态也受pH改变的影响，从而影响它们对酶的亲和力。此外，酶活性中心的空间构象也受pH的影响，从而影响酶的活性。
★ 考点提示：底物浓度、酶浓度、温度、pH对酶促反应速度的影响；Km的意义
五、激活剂的影响
能使酶从无活性变为有活性或使酶从低活性变为高活性的物质称作酶的激活剂（activator）。大多数金属离子激活剂对酶促反应是不可缺少的，这类激活剂称为必需激活剂（essential activator）。例如，Mg2＋是多种激酶和合成酶的激活剂。缺乏必需激活剂则酶无活力。有些激活剂不存在时，酶仍有一定的催化活性，这类激活剂称为非必需激活剂（non-essential activator）。缺乏非必需激活剂时，酶有活力但活力较低，如Cl－是唾液淀粉酶的非必需激活剂。
六、抑制剂的影响
凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂（inhibitor，I）。抑制剂多与酶的活性中心内或活性中心外必需基团相结合，从而抑制酶的催化活性。酶抑制与酶失活是两个不同的概念，抑制剂虽然可使酶失活，但并不明显改变酶的结构，即酶尚未变性，去除抑制剂后酶活性可恢复。根据抑制剂与酶结合紧密程度的不同，酶的抑制作用分为不可逆性抑制和可逆性抑制。
（一）不可逆性抑制作用
有些抑制剂能与酶活性中心的必需基团以共价键相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法去除抑制剂，这种抑制作用称为不可逆性抑制作用（irreversible inhibition）。通过化学等方法可解除抑制作用，抑制程度取决于抑制剂浓度及酶与抑制剂的接触时间。
有机磷农药1605、敌百虫、敌敌畏等特异性抑制与神经传导有关的胆碱酯酶的活性，通过与该酶活性中心丝氨酸残基的羟基（—OH）共价结合，形成磷酰化胆碱酯酶，使胆碱酯酶活性受到抑制。机体正常情况下神经兴奋时，神经末梢释放的乙酰胆碱发挥作用后，被胆碱酯酶水解为乙酸和胆碱。有机磷农药中毒后胆碱酯酶被抑制，神经末梢分泌的乙酰胆碱不能被及时分解而积聚，引起胆碱能神经的毒性兴奋状态。临床上用解磷定和氯磷定治疗有机磷农药中毒。解磷定和氯磷定可将有机磷化合物从酶分子上取代下来，解除其对胆碱酯酶的抑制作用。
砷化合物（如路易士气）、重金属盐类（Ag＋、Hg2＋、Pb2＋）等，可与巯基酶的活性巯基（—SH）进行共价结合而导致酶失活。这种类型的巯基酶中毒可通过加入过量的巯基化合物解除抑制，使酶恢复活性，如解毒剂二巯基丙醇（british anti-lewisite，BAL）、二巯基丙磺酸钠、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等常被称为巯基酶保护剂，可被用作砷、重金属等中毒的解毒剂（图4-14）。
图4-14 路易士气对巯基酶的抑制作用及解毒
★ 考点提示：不可逆性抑制作用的概念；有机磷农药中毒、重金属中毒的机制
（二）可逆性抑制作用
抑制剂以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物可逆性结合，使酶活性降低或失活，可以通过透析或超滤方法除去，使酶恢复活性，这种抑制作用称为可逆性抑制作用（reversible inhibition）。可逆性抑制作用主要有竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种类型。
1．竞争性抑制作用
竞争性抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物竞争酶活性中心的同一结合部位，阻碍酶与底物结合成中间复合物，使反应速度下降，这种抑制作用称为竞争性抑制作用（competitive inhibition）。这种抑制作用的程度取决于抑制剂和底物的相对浓度及二者对酶的相对亲和力，增加底物的浓度，可降低甚至解除抑制剂的抑制作用。如丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用即竞争性抑制，增大底物琥珀酸（丁二酸）的浓度，可减弱此抑制作用。竞争性抑制作用模式为：
磺胺类药物就是根据竞争性抑制作用的原理设计产生的。对磺胺类药物敏感的细菌在生长繁殖时，不能直接利用环境中的叶酸，必须在细菌体内二氢叶酸合成酶的催化下，以对氨基苯甲酸（para-aminobenzoic acid，PABA）、二氢蝶呤和谷氨酸为底物合成二氢叶酸，进一步还原生成四氢叶酸，四氢叶酸是核苷酸合成中必需的辅酶。磺胺类药物的化学结构与对氨基苯甲酸相似，是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，可抑制细菌二氢叶酸的合成，进而造成细菌的核苷酸与核酸合成受阻而影响其生长繁殖，从而达到抑菌作用（图4-15）。人类能直接利用食物中的叶酸，因此不受磺胺类药物的影响。根据竞争性抑制的特点，服用磺胺类药物时必须保证血液中药物的高浓度，以确保其发挥有效的竞争性抑菌作用。
图4-15 磺胺类药物、甲氨蝶呤对四氢叶酸合成的抑制作用
许多抗代谢物类药物都是通过酶的竞争性抑制发挥作用的。如甲氨蝶呤（MTX）、氟尿嘧啶（5-FU）、巯嘌呤（6-MP）等都是酶的竞争性抑制剂，分别通过抑制四氢叶酸、脱氧胸苷酸和嘌呤核苷酸的合成，而抑制肿瘤细胞的生长。
★ 考点提示：竞争性抑制作用的概念、特点及应用
2．非竞争性抑制作用
非竞争性抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，不影响酶与底物的结合，而酶与底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合。底物和抑制剂之间无竞争关系，但酶-底物-抑制剂形成的三元复合物（ESI）不能进一步释放出产物而使酶的催化活性降低，这种抑制作用称为非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition）。非竞争性抑制剂作用于酶活性中心外的部位，其抑制作用取决于抑制剂的浓度，不能通过增大底物浓度的方法减弱抑制。如亮氨酸对精氨酸酶的抑制、哇巴因对细胞膜Na＋，K＋-ATP酶的抑制都属于非竞争性抑制。其作用模式为：
3．反竞争性抑制作用
反竞争性抑制剂也是作用于酶活性中心外的部位，但其不与游离的酶结合，仅与酶-底物复合物（ES）可逆结合，使中间产物的量下降，导致酶促反应的速度降低，这种抑制作用称为反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）。这种抑制作用由于IES的生成，使ES的量减少，进而促进底物与酶的结合。其作用模式为：
★ 考点提示：非竞争性抑制与反竞争性抑制的概念、特点