1.9 结合常数的测定
在溶液相中，一般用结合常数Ka（association constant或binding constant）和相应的自由能变化ΔG来表示氢键的稳定性。在分子识别研究中，一般需要定量研究的氢键都是多氢键体系，可以人为地用主体H和客体G表示形成氢键的两个组分。对于结合计量比为1:1的体系，可以用方程式（1-2）表示结合过程，其Ka和ΔG用方程式（1-3）和式（1-4）表达。
（1-2）
（1-3）
ΔG○=-RTln（Ka） （1-4）
一些文献详细介绍了结合常数的测定方法［33，34］。早期发展的一些线性回归方法都是基于一定的假设或近似。如Benesi-Hildebrand方程假设，加入的过量的客体（变量）的浓度等于没有配合的游离的客体的浓度［35］。由于计算机程序的普及，现在已经没有必要再使用这些过时的方法［34］，尽管这些近似方法仍然在文献中经常被应用。目前广泛应用的是非线性回归方法。这些方法适用于所有通过非共价键作用力驱动形成的超分子体系，前提是结合在动力学上是快速的，能够很快的达到热力学平衡。因此，这些方法也适用于氢键驱动的结合过程。以下总结利用不同实验技术测定结合常数的公式。
1.9.1 异体1:1配合物
对于由两个不同组分形成的配合物，等温滴定实验是应用最广泛的测定结合常数的方法。这种方法固定一个组分H（设为主体）的浓度，在保持温度和体积恒定的条件下，滴加另一个组分G（设为客体），测定选定的一个探针Yobs随客体浓度增加的变化。对于核磁、吸收光谱（增强或减弱）、荧光（增强或猝灭）和圆二色谱滴定等，探针ΔYobs对应于相应的化学位移变化（Δδ）、吸光度变化（ΔA）、荧光变化（ΔF）和圆二色谱信号强度变化（ΔA），该值无论增加或减小，皆取变化绝对值。把所取得的数据组代入到方程式（1-5），通过非线性回归，即可获得结合常数Ka和饱和配合物（主体全部转化为配合物）的探针最大变化ΔYmax。在方程式（1-5）中，［H］为主体组分的固定浓度，［G］为客体（变量）的已知浓度。
（1-5）
等温滴定量热法（Isotherm titration calorimetry，ITC）提供了另一个高度灵敏和准确的方法，测定溶液相结合的热力学参数。不同于上述波谱、光谱技术，一个系列的自动化的ITC实验可以同时给出Ka、ΔG、ΔH和ΔS四个参数。在一个典型的滴定中，一定量的客体G的溶液加入到固定量的主体H的溶液中，释放的热通过温度变化而测定，随着客体的不断加入，热量释放越来越少，最后趋于0而达到结合饱和。释放的热量总和对应于ΔH，而放热曲线形状作为主/客体比例的函数可以提供Ka，从而进一步导出ΔG和ΔS。由于量热检测的灵敏性，ITC能够更直接更准确地获取热力学数据，特别是ΔH，并且避免了使用范特霍夫方程（van't Hoff's plot）带来的ΔH随温度变化引起的误差等。方程式（1-6）是相应的非线性回归方程，其中Q（=［H·G］VΔH）代表释放的总热量，V代表样品池的体积，［H］和［G］代表主体和客体的浓度。随着客体溶液的增加，整个样品体积会有所增加。但现代仪器能产生Q对［H］/［G］的相关图，校正这一体积变化带来的浓度变化。ITC能够测量的Ka的范围跨越5L/mol到109L/mol，比通过核磁共振和吸收光谱方法测定的范围广，但利用ITC测定的前提是结合不能是焓中性的，即要有热量释放。
（1-6）
1.9.2 同体1:1配合物
对于同体配合物，即两个相同分子形成的配合物，可以使用方程式（1-7）求取Ka。其中ΔYobs和ΔYmax的含义同方程式（1-5）。利用核磁和荧光实验测定相应氢键同体二聚体的结合常数较为常见。对于前者，ΔYobs即为Δδobs，指某一浓度下的探针化学位移与未形成配合物的游离单体的探针化学位移之间的差值，大多选择NH信号。确定游离的探针的化学位移是关键，其准确性决定了ΔYobs的准确性。对于稳定性较低的二聚体（Ka<104L/mol），不发生二聚的单体浓度相对较高，测定其探针的化学位移并不困难。但若二聚体的稳定性较高，单体浓度很低时仍有部分形成二聚体，则不能准确测定其位移，从而给Ka的确定带来偏差。尽管可以使用外推法得到无限稀释时的探针化学位移，但这一方法并不总是有效的。在这种情况下，可以选择增加溶剂的极性，如在低极性的氘代氯仿中加入一定量的强极性的氘代二甲亚砜，降低二聚体的稳定性。还可以选择其它方法，如荧光稀释，其灵敏度更高，但需要在单体上引入荧光探针［36］。如果在单体上引入探针，通过测定形成的二聚体内两个荧光基团形成的激基缔合物的强度随浓度的变化，求取Ka值［36］。在此，ΔYobs为ΔF，即激基缔合物的发射强度。
（1-7）
1.9.3 异体1:2配合物
若设想一个主体H和两个客体G结合，形成1:2的配合物，其形成HG和HG2的结合常数K1和K2由方程（1-8）和方程（1-9）表达。方程式（1-10）是核磁滴定实验对应的非线性回归方程，其中［H］是常量，滴定中浓度保持不变，Δδobs、ΔδHG和
分别是探针化学位移变化、配合物HG的探针化学位移变化和配合物HG2的探针化学位移变化。ΔδHG和
通过非线性回归求取。理论上存在着这样的1:2配合物，通过核磁滴定可以求得K1和K2。对于这样的三组分配合物，另一种常用的简化处理方式是求取1:1配合物的表观结合常数。即简单地把主体浓度加倍，因为主体分子中存在两个结合位点。
（1-8）
（1-9）
（1-10）
1.9.4 竞争实验方法
利用核磁滴定或稀释得到的氢键稳定的配合物的结合常数一般上限为104～105L/mol。对于结合常数更高的氢键配合物［HGA，式（1-11）］，可以利用竞争方法测定，即引入另一个已知的结合常数较低的配合物［HGB，式（1-12）］。这样两个氢键体系的Ka（A）和Ka（B）即存在式（1-13）的关系。如果单体和配合物的结合在核磁时间尺度上较慢，单体和配合物的探针信号可以分别出现，对其积分可计算出各自的浓度，从而求出Ka（A）。
（1-11）
（1-12）
（1-13）
（1-14）
（1-15）
（1-16）
若一个单体H可以与另一分子单体G形成异体二聚体HG［式（1-14）］，又可以形成同体二聚体HH［式（1-15）］。当其中一个二聚体的结合常数已知时，也可以通过类似方法求取另一个二聚体的结合常数［式（1-16）］。前提仍然是各个物种在核磁谱图中产生可分离的高分辨的探针信号［37］。当单体和配合物之间快速交换时，探针信号实际上是一个平均值或变宽乃至消失，上述方法即不成立。但对于配体-生物大分子相互作用，使用ITC的竞争方法已经确立［38］。