2.2.2 高产溶栓酶菌种的鉴定
2.2.2.1 个体形态鉴定
将M64菌株的斜面菌株进行革兰氏染色后显微镜观察。首先进行涂片固定；然后采用草酸铵结晶紫初染1min，自来水冲洗；加碘液覆盖媒染约1min，水洗，用吸水纸吸去水分；然后用95%酒精数滴，轻轻摇动进行脱色20s后水洗，吸去水分；最后番红染色液（稀）染2min后，自来水冲洗，干燥，用显微镜油镜镜检。
图2-1 M64菌株个体形态
由图2-1可以看出，M64菌株细胞为杆状，革兰氏阳性，有芽孢，芽孢呈柱状或椭圆形，端生。
2.2.2.2 菌落特征观察
将M64菌株的斜面菌种接种于营养肉汤琼脂培养基表面上，37℃，培养18～24h，测量菌落大小并观察菌落的形态、颜色、是否有光泽、透明程度、边缘是否整齐等特征。
将M64菌株的斜面菌种接种于营养肉汤琼脂培养基表面上，培养后，菌落特征见图2-2。
图2-2 M64菌株菌落特征
由图2-2可以看出，M64菌株菌落大小为1～2mm，白色，呈规则的圆形，无光泽，表面干燥、多褶皱，不透明，边缘不整齐。
2.2.2.3 生理生化鉴定
采用以下方法对M64的生理生化特性进行鉴定。
（1）在厌氧条件下的生长情况
将菌种M64涂布到加有氧化剂的营养肉汤固体培养基表面，在厌氧培养箱中37℃培养2～3天，观察菌种生长情况。
（2）过氧氢酶试验
将菌种M64接种于营养肉汤培养基斜面上37℃培养24h，取1～2环菌体涂布于洁净的载玻片上，向上面滴加过氧化氢溶液（浓度15%），若无气泡产生则为不能产生过氧化氢酶，有气泡产生则为能产生过氧化氢酶。
（3）产H2S试验
将菌种M64的新鲜培养物接种于营养肉汤液体培养基中后，用已灭菌的镊子夹取乙酸铅纸条，并悬挂在试管内。乙酸铅纸条的下端接近营养肉汤液体表面而不接触液面。将试管的上端用棉塞塞紧。然后将试管置于37℃培养，纸条变黑为阳性反应，即能产生H2S。
（4）精氨酸产氨试验
将3滴灭菌的配制好的精氨酸溶液（pH值7.0）加至3mL的PY培养基中。
将菌种M64接种于含精氨酸的培养基中，并同时将菌种M64接种于不含精氨酸的培养基中作为空白对照。一起放置于37℃培养箱中培养1～2d。
取少量生长好的菌种M64培养液，放置于比色盘中，添加奈氏试剂数滴，当产氨时会出现黄褐色或橙黄沉淀。
（5）V-P试验
将菌种M64接种于PYG液体培养基中，取1mL生长2d的菌种M64的新鲜培养物，在其中加入0.2mL的6%α-萘酚-乙醇溶液和40%的氢氧化钾溶液，置于不加盖的试管中混合，振荡30min后观察。如果显示红色为阳性反应，否则为阴性反应。
（6）糖醇发酵试验
以PY培养基为基础培养基，在其中分别加入各种糖类和醇类，浓度为0.5%或1%不等，然后再加入溴甲酚紫指示剂（1.6g/L）。接种菌种M64培养物后37℃培养1～2d，观察菌种M64是否产酸。若培养后培养液为黄色则表示菌种产酸为阳性反应。
（7）氮源利用实验
将需要测定的氨态氮（如磷酸氢二氨）、氨基酸及硝态氮（如硝酸钾）加入到氮源利用基础培养基中，使其终浓度为0.05%～0.1%，如果测定的菌不能利用葡萄糖为碳源，则需要用其他碳源代替（碳源的终浓度为0.2%～0.5%）。另外做一份不加氮源的培养基作为空白对照，调pH值为7.0～7.2，分装于试管中，每管装量为4～5mL，112℃灭菌20min，制备出的培养基要求无沉淀。接种菌种M64培养物后37℃培养1～2d，观察菌种的生长情况。
（8）淀粉水解实验
采用PY为基础培养基，加入淀粉（0.5%，m/v），在121℃，灭菌15min。取已生长好的菌种M64新鲜培养液少许放置于比色盘中，同时取未接种的M64的培养液作为空白对照，然后分别向其中加入路哥氏碘液，如果不显色表示菌种能水解淀粉，如果呈现蓝黑色或蓝紫色，表示菌种不水解淀粉或淀粉水解不完全。
（9）七叶（苷）灵实验
以PY为基础培养基，加入七叶苷使其最终浓度为5g/L，然后在121℃，灭菌15min备用。取少量在上述制备的七叶苷培养基中生长好的菌种M64，置于比色盘中，同时取未接种的菌种M64培养液作为空白对照，分别在其中加入柠檬酸铁试剂（5～10g/L柠檬酸铁或柠檬酸铁铵溶液），如果呈现黑色表示为阳性反应，如果不显色则为阴性反应。
（10）马尿酸钠水解
取装有马尿酸钠培养基的试管，于试管外壁上的液面处画一横线标记液面高度，然后将菌种M64培养物接入试管内，置于42℃培养48h。如果观察到培养基液面降低，需要用蒸馏水补足至原体积，然后离心，沉淀菌种M64的菌体，用无菌吸管吸取培养液的无细胞上清液0.8mL，加入到一个空试管内，然后在其中加入三氯化铁试剂（0.2mL），立即混合。如果10～15min后出现红褐色沉淀，则马尿酸水解试验为阳性反应，否则为阴性反应。
（11）明胶液化实验
将菌种M64培养物接种于明胶基础培养基后37℃培养，将已接种菌种M64的培养物和未接种菌种M64培养物的对照试管放置于冰箱中，在对照管凝固后，观察实验结果。如果对照管凝固时，接种菌种M64培养物的试管液化为阳性反应，如果两个管同时凝固或液化则为阴性反应。
（12）石蕊牛奶
准确称取8g石蕊在30mL40%乙醇溶液中研磨，吸取上清液，然后继续添加40%浓度的乙醇溶液到总量为100mL，然后煮沸1min，吸取用上清液制成石蕊溶液。
将石蕊溶液4mL加入到100mL的脱脂牛奶中制成石蕊牛奶。将石蕊牛奶分装试管，每管的高度为4～5cm。然后采用113℃高压蒸汽灭菌15～20min后待用。
将菌种M64培养物接种于石蕊牛奶中后37℃培养1～2d，观察其产酸和凝固反应情况。
（13）运动性试验
将菌种M64培养物以穿刺方式接种于半固体琼脂培养基中，37℃培养1～2d后，观察记录菌体生长结果，如果菌种M64只在穿刺线上生长，边缘十分清晰，则说明菌种M64无运动性，如果菌种不由穿刺线生长，而是向四周呈云雾状扩散，则表示菌种M64有运动性，即为阳性。
（14）产生吲哚试验
将菌种M64培养物接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养1～2d，观察实验结果，取培养好的菌种M64试管，加入约0.5mL的乙醚，振摇后，使其静置分层，然后再沿管壁加入约0.5mL的吲哚试剂，如果试剂呈玫瑰红色则为吲哚试验阳性，否则为吲哚试验阴性。
（15）生长温度试验
将菌种M64菌体接入营养肉汤液体培养基中，在不同温度下进行培养，观察菌种的生长情况。
（16）耐盐性试验
在营养肉汤液体培养基中加入3%，6%，9%的NaCl，接入菌种M64培养物后37℃培养24h，观察菌悬液的混浊程度来判断菌种M64耐盐性。
表2-2 生理生化鉴定结果
结果表明M64菌株能产生β-半乳糖苷酶、过氧化氢酶及卵磷脂酶；在厌氧条件下不能生长；能运动；能耐受10%的食盐，根据菌种的个体形态、群体形态，和生理生化特征，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》，可将M64菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种。