遗传学是研究遗传和变异的学科，从1865年孟德尔发表豌豆杂交实验结果到20世纪40年代前发现的“遗传核心是染色体”的经典遗传学理论，确立了遗传学的三大定律：分离律、自由组合律和连锁交换律。20世纪40年代进入现代遗传学阶段，揭示了DNA为遗传物质，对基因的结构、功能、调控等方面进行了深入探索。

医学遗传学由遗传学与临床医学结合而成，主要研究人类疾病与遗传的关系，目前已发展为多分支的综合性学科。主要分支为：细胞遗传学（研究染色体畸变与疾病的关系）、生化遗传学（研究基因、蛋白质与遗传病的关系）、分子遗传学（基因水平的疾病研究，如基因诊断、基因治疗等）、群体遗传学（研究基因频率的分布、变化规律）、发育遗传学（研究发育过程中的基因表达和调控）、肿瘤遗传学、免疫遗传学、药物遗传学、优生学等。

遗传性疾病是指因人体生殖细胞或受精卵的遗传物质发生异常改变所导致的疾病，包括基因病和染色体病。基因病分为单基因病和多基因病，染色体病分为常染色体病和性染色体病。近几十年来随着医学的发展，烈性传染病和营养不良疾病得到控制，遗传性疾病则成为威胁人类健康的重要疾病。目前已知的染色体病为100余种，单基因病达6000种以上，多基因病为100余种，其中高血压、冠心病等成为当今人类致死的主要原因。

人类基因组计划是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程，其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。截止到2005年，人类基因组计划的测序工作已经完成。人类基因组研究的目的不只是为了读出全部的DNA序列，更重要的是读懂每个基因的功能，每个基因与某种疾病的种种关系，对生命进行系统地科学解码，从此达到从根本上了解认识生命的起源、种间、个体间差异的原因，疾病产生的机制以及长寿、衰老等困扰人类的最基本生命现象为目的。后基因组计划是完成人类基因组计划（结构基因组学）以后的若干领域，实际上是指完成顺序后的进一步计划，其实质内容就是生物信息学与功能基因组学，其核心问题是研究基因组多样性，遗传疾病产生的原因，基因表示调控的协调作用，以及蛋白质产物的功能。

人类通过生殖过程实现性状的遗传，经过减数分裂形成的父本和母本的配子（精子和卵子）相互结合，继承来自父母的性状。这一过程遵循三大定律。

生物体的遗传性状由成对的遗传基因决定，这对基因一个来自父本，一个来自母本，控制同一种性状，称为等位基因。生物体形成配子，等位基因分离，分别进入不同的生殖细胞。

机体的基因组成称为基因型。当决定某一性状的一对基因由相同的基因组成，称为纯合子；反之，由不同基因组成称为杂合子。杂合子状态下显示表型的基因为显性基因，仅在纯合子时才表现出性状的基因为隐性基因。显性基因控制的性状或疾病为显性遗传，隐性基因控制的性状或疾病为隐性遗传。

分离律对疾病的遗传分析具有重要指导意义。如，5α-还原酶缺乏症为常染色体隐性遗传，基因位于2号染色体。隐性致病基因用a表示，正常基因用A表示，基因型为AA或Aa者表现型正常，基因型为aa者发病。当基因型为Aa的两个携带者婚配，根据分离律，配子形成时父母双方的等位基因Aa分离，精子和卵子的A和a等量，精子与卵子随机结合，子女的基因型可能为AA、Aa和aa，比例为1∶2∶1，子代完全正常的可能性为25%、携带者为50%，患者的概率为25%。

分离律揭示了等位基因的遗传规律，对于非等位基因而言，非同源染色体两对或两对以上基因的分离相互独立，以随机组合方式分别进入配子。

人眼的颜色棕色（A）对蓝色（a）是显性，手的癖性右利（B）对左利（b）是显性，这两对等位基因位于非同源染色体。棕眼右利的两个杂合子（AaBb）婚配，等位基因Aa分离，Bb分离，非等位基因随机组合，精子和卵子形成AB、Ab、aB、ab四种。配子随机结合后形成9种基因型和4种表现型，组合比例为9∶3∶3∶1（图2-1）。

位于同一染色体的两对或两对以上基因常伴随共同传递至下一代，这种现象称为连锁。减数分裂过程中同源染色体发生基因互换，称为交换。

人类有22对常染色体和XY两种性染色体，雄激素受体基因位于X染色体，与X染色体上的其他基因共同传给下一代，此为连锁遗传。正常个体46，XY，精子形成的减数分裂过程中发生假常染色体基因交换，若交换超出假常染色体区，位于Y染色体上的睾丸决定因子（ SRY基因）将交换至X染色体，带有 SRY的X染色体精子与正常卵子结合，患者为XX男性综合征，表现型为男性，染色体核型则为46，XX。

单基因病由一对等位基因控制，遗传规律遵循孟德尔定律。单基因病根据患病家系的系谱分析可分为5种：

特点：①垂直、连续传递；②患者的双亲中必有一人患病；③患者子女或同胞的患病率为50%；④患者的正常子女所生育的后代正常；⑤该性状的传递与性别无关。

理论上，常染色体显性遗传杂合子（Aa）与纯合子（AA）具有相同的表现型。实际上，由于各种复杂因素影响，杂合子可表现出不同的表现型。完全显性遗传，与显性纯合子表现完全相同；不完全显性遗传，介于显性纯合子和隐性纯合子之间；不规则显性遗传，有时表现为显性，有时表现为隐性；延迟显性遗传，个体发育晚期，显性基因才表现；共显性遗传，两种等位基因的作用均完全表现。

如，睾丸功能早熟GnRH非依赖性睾丸功能亢进症（testoxicosis）、真两性畸形和假性特纳综合征（ Noonan syndrome）均为常染色体显性遗传。

特点：①家系表现为散发病例；②患者双亲均为杂合子，无临床症状；③性状传递与性别无关；④近亲婚配后代发病率明显增高。

常染色体隐性遗传病临床表现比较一致。患者与正常纯合子交配，后代为杂合子，表现型均正常；与杂合子婚配，后代发病率为50%；两个杂合子婚配，1／4后代为患者，1／4为正常纯合子，1／2为表现型正常的杂合子。

如，CYP21、CYP11、CYP17和HSD3B2缺乏症和46，XX单纯性性腺发育不全症等均为常染色体隐性遗传。

疾病由X染色体上的显性致病基因决定，特点：①家系连续遗传；②患者双亲一人患病；③女性患者约比男性多一倍；④男性患者的女儿均为患者，儿子全部正常；⑤女性患者生的女儿和儿子各有50%发病。

如，46，XY单纯性性腺发育不全为X连锁显性遗传。

特点：①家系不连续性明显，父亲不会传给儿子；②男性发病率远高于女性；③性状由女性携带者传递；④患者的兄弟、外祖父、舅父、外甥、姨表兄弟和外孙可能是患者，其他亲属均不是患者。

如，睾丸女性化为X连锁隐性遗传。

因控制疾病的基因位于Y染色体，遗传表现为家族中男性患者连续遗传，不遗传女性。如，外耳道多毛症为Y连锁遗传病。

线粒体DNA是唯一存在于人细胞质中的DNA分子，编码氧化磷酸化复合物体系中的多肽链，相对独立于细胞核染色体进行复制和转录。受精卵中的线粒体DNA大都由母亲的卵子提供，线粒体DNA突变导致的遗传性疾病均主要由母亲传递，少量亦可由父系传递，不遵守孟德尔遗传方式，如Leber遗传性视神经炎、糖尿病等可表现为线粒体遗传。

高血压、糖尿病等家族多发的疾病由多对微效基因控制，每对基因对表型影响较小，但呈现累积效应，在环境因素作用下发病，以这种方式遗传的疾病称为多基因遗传病，特点：①发病风险与致病基因的作用密切相关。作用越大，患者一级亲属的发病率越高。②发病频率随亲缘疏远而减低。③家系中患者越多，病情越重，家庭成员发病风险越高。④患病率存在性别差异时，性别比例少的亲属，患病率较高。多基因遗传病每对基因的遗传性状符合孟德尔定律，但性状由多对基因共同决定，表现远较单基因病复杂。⑤环境因素影响致病基因的表达。

又称基因组印记，指来自双亲的基因或染色体存在功能上的差异，子女中来自父本与母本的基因表达不同，双亲中仅特定一方传递致病基因才发病。由于生殖细胞在生成过程中受到不同程度修饰，印记基因的表达受到抑制。如，脆性X综合征、视网膜母细胞瘤等属于此类疾病。

染色质是遗传物质的载体，由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成（图2-2）。一级结构是DNA环绕组蛋白形成的核小体，核小体螺旋状压缩形成螺线管和超螺线管的二级和三级结构。细胞进入分裂期，染色质进一步折叠形成染色体。有丝分裂中期，染色体结构最典型，是分析染色体的最佳时期。此期染色体含有两条染色单体，以着丝粒为界分为长臂和短臂两部分（图2-2）。

人类体细胞的染色体为二倍体，含有22对常染色体和两条性染色体。减数分裂过程中同源染色体分离，非同源染色体随机组合进入不同配子，同源染色体上的等位基因可发生交换，是三大遗传定律的细胞学基础。根据染色体长度和着丝粒的位置，22对常染色体分为7组，顺次编为1～22号。A组有1、2、3号染色体，为最大的一组染色体；B组包括4、5号，为近中着丝粒染色体；C组有6～12号染色体和X染色体；D组为13、14、15号，是较大的近端着丝粒染色体；E组有16、17、18号；F组包括19号和20号，是最小的中央着丝粒染色体；G组为21、21号常染色体和Y染色体，是最小的近端着丝粒染色体。（图2-3）。

常染色体上有众多与性别决定和发育相关的基因，如2号染色体有类固醇5α-还原酶2基因，类固醇生成因子1基因位于9号染色体，17β-羟化酶基因位于17号染色体等。

人类的性染色体有X染色体和Y染色体两种，正常男性染色体为46，XY，女性为46，XX。生殖细胞在第一次减数分裂之前进行XX或XY染色体配对，第二次减数分裂之后形成23，X或23，Y精子和23，X卵子。受精后性染色体为XY的合子发育为男性，XX合子发育为女性。

Y染色体属于G组的近端着丝粒染色体，一般较21、22号常染色体大。其短臂顶端有一个X染色体同源区，减数分裂时发生交换，称为假常染色体区。紧邻假常染色体区为性别决定区，含有睾丸决定因子基因，目前认为是 SRY（性决定区Y基因）。长臂靠近着丝粒区有影响精子发生基因、H-Y抗原基因等，远端尚未发现有遗传活性，其长度在人群中变异较大。不管有多少条X染色体，只要 SRY存在将启动未分化性腺向睾丸发育。如果在减数分裂过程中XY染色体交换发生异常，将 SRY由Y染色体交换至X染色体，则含有 SRY的X精子与正常卵子结合可产生46，XX男性，而不含 SRY的Y精子则可产生46，XY女性。

X染色体所含结构基因远较Y染色体多，与性别决定和分化相关的有雄激素受体基因、卵巢功能影响基因、Kallmann综合征（KAL-1）基因、DAX-1（X染色体DSS——先天性肾上腺皮质增生关键区基因）等。此外还有红绿色盲、血友病、肌营养不良等超过130种基因，这些疾病表现为伴性遗传（图2-4）。

正常卵巢发育需要两条X染色体，不论体细胞有多少条X染色体，仅有1条具有转录活性，其余X染色体发生异固缩，分裂间期细胞核膜内侧形成直径约1μm的巴氏小体，其数目等于X染色体数减1。Y染色体长臂远端为无转录活性的异染色质，分裂间期成为Y小体，数目与Y染色体数目一致。因此，检测颊黏膜上皮细胞等体细胞，可初步确定性染色体组成。

染色体核型为有丝分裂中期染色体组的表型。将一个细胞的全部染色体制成图像，排序并加以分析即为核型分析。制备染色体标本最常用外周血淋巴细胞，体外培养时加入植物凝集素刺激其进行有丝分裂，秋水仙碱处理，使细胞停留在分裂中期，经吉姆萨染色可得到非显带染色体标本。常用羊水细胞和绒毛细胞进行产前检查。

近年来发展出多种染色体显带技术，每条染色体可呈现出特异的带，从而被准确识别和鉴定。目前使用最广泛的为G显带，可在中期染色体中显示出320余条带纹。高分辨率显带技术可显示更多的带纹，能检测出更细微的染色体结构异常。G带的命名遵循ISCN命名体制。每条染色体以着丝粒为标志区分长臂（q）和短臂（p），由着丝粒开始从臂上较明显的界标向末端依次分区。每区包含几条带，按由近及远的原则编号。所有条带均以4个连续的符号表示，分别为染色体序号、臂符号、区号和带号。如2p23表示2号染色体短臂2区3带。进一步细分带，需在原编号后加小数点，再加数字表示，如17q24.3。

染色体异常包括染色体数目和结构的异常，染色体病根据受影响染色体的类型分为常染色体病和性染色体病。异常可自发产生，也可由于电离辐射、诱变剂等理化因素和病毒等生物学因素引起。染色体异常多发生于生殖细胞减数分裂，也可发生于受精卵早期有丝分裂，或通过遗传获得。染色体异常多是由于多基因受影响造成。

人类体细胞染色体数目为二倍体，在此基础上成倍增加或减少称为整倍体异常，只增加或减少一条或数条染色体为非整倍体异常。若体内染色体核型为两种或更多则构成嵌合体。

整倍体发生的机制可能为双雄受精（两个精子同时与一个卵子受精）、双雌受精（卵子为二倍体）和核内复制（细胞在有丝分裂前复制了两次）。三倍体染色体总数可达69条，四倍体为92条，由于易于发生自发流产而少有胎儿存活。

非整倍体异常包括单体型（缺少一条染色体，2n-1）、三体型（多出一条染色体，2n+1）、多体型（某号染色体有4条或4条以上），常为细胞分裂过程中同源染色体不分离或染色体丢失所致。常见的有21三体综合征（47，XX或XY，+21），特纳综合征（45，X），克莱费特综合征（47，XXY）等。

嵌合体常发生于性染色体，不同染色体数目的细胞群起源于同一合子者称为同源嵌合体，来源于两个以上合子者为异源嵌合体。45，X／46，XX，45，X／46，XY，46，XY／47，XXY等核型均常见。

染色体结构异常多由于染色体断裂、丢失和重新组合不当造成。常见的有缺失、易位、插入、重复、环状染色体、等臂染色体、双着丝粒染色体等。

染色体结构异常可用简式或详式两种方式描述。简式描述由染色体总数、性染色体组成、结构异常类型、染色体序号、断裂点区带号等5部分组成，如特纳综合征患者一条X染色体短臂缺失可表示为46，X，del（Xp）。详式则具体描述畸变染色体带的组成，如21三体综合征核型可为46，XX，-14，-21，+t（14q21q），表示染色体总数为46，性染色体组成为XX，14号染色体和21号染色体缺失，新的畸形染色体由14号染色体长臂和21号染色体长臂构成。

基因是编码多肽链或RNA所必需的核酸片段，具有稳定性、特异性、自我复制性和可变性的特点。

DNA的基本单位是脱氧核苷酸，由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）—RNA中为尿嘧啶（U）—四种碱基之一和磷酸、脱氧戊糖各一个分子组成。四种脱氧核糖核酸以一定顺序连接构成DNA的一级结构，具有5′端到3′端的方向性。两条反向平行的DNA链围绕同一轴心缠绕，按G-C、A-T互补配对的原则构成双螺旋二级结构。DNA在此基础上进一步扭曲，形成超螺旋等三级结构。

DNA中编码序列并非连续排列，而是被不编码的插入序列隔开。直接编码RNA或蛋白质的部分称为外显子，插入序列称为内含子。编码区5′上游和3′下游的非编码序列称为侧翼序列，包含转录所必需的调控序列，如启动子、增强子、终止子等。

基因所携带的遗传信息最终以蛋白质的形式发挥生理功能，其过程为：DNA以其自身为模板转录为信使RNA（mRNA），以mRNA为直接模板翻译成为氨基酸序列。mRNA上每三个相邻的核苷酸编码一种氨基酸，称为密码子。密码子均由5′到3′方向连续不重叠编码，共有64个。其中AUG既是甲硫氨酸的密码子，又是转录开始的信号，称为起始密码子，UAG、UAA、UGA不编码任何氨基酸，是翻译终止的信号，称为终止密码子。天然氨基酸只有20种，每种氨基酸至少有一个密码子，最多可有6个密码子，编码同一氨基酸的密码子称为同义密码子。这种现象称为密码的简并性。

基因组泛指一个细胞或病毒的全部遗传信息，既包括编码序列，也包括大量存在的非编码序列。人类基因组中编码蛋白质的基因只占基因组总DNA量的2%～3%，多数基因的功能不明。根据基因的序列和出现频率可将DNA序列分为以下几种：①单拷贝序列：在基因组中仅出现一次或少数几次，大多数结构基因为单拷贝基因。②中度重复序列：重复次数为数万至数十万，如Alu家族、KpnⅠ家族等，可能参与基因调控。组蛋白基因、tRNA基因等也属此列。③高度重复序列：出现频率＞10 ⁵。其中重复序列在9～24bp者称为小卫星DNA，2～6bp者为微卫星DNA，可作为遗传标记而用于基因诊断。④多基因家族：是一组来源相同、结构相似、功能相关的基因。若这些基因串联排列在一条染色体上则称为串联重复基因，如rRNA基因、珠蛋白基因等。多基因家族中某些成员与有功能基因结构相似，但不产生有功能的基因产物，称为假基因。如类固醇5α-还原酶2基因位于2号染色体短臂（2p23），而在X染色体长臂（Xq24-qter）有一个假基因。

基因的碱基组成或排列顺序上的改变称为基因突变。这将导致该基因编码的多肽链氨基酸序列发生改变，影响蛋白质的结构和功能甚至个体表型。基因突变可以自然发生，也可以在理化因素诱导下发生，可以发生在体细胞中也可发生在生殖细胞而遗传给后代。一方面基因突变对生物体是有害的，是导致衰老和疾病的原因；另一方面它为自然选择提供了材料，是生物进化的前提。

基因中单个或少数几个碱基的改变产生的DNA一级结构改变称为点突变，是最常见的突变类型。根据突变对氨基酸序列的影响可分为以下几类：①同义突变：突变密码子与原密码子所编码的氨基酸相同，两种密码子为同义密码子；②错义突变：突变密码子所编码的氨基酸与原密码子不同，导致蛋白质结构和功能的异常；③无义突变：突变密码子为终止密码，肽链的翻译提前终止，产生无活性的片段；④移码突变：DNA片段中插入或缺失的碱基对不是3的整数倍，造成下游氨基酸序列完全改变；⑤延长突变：终止密码子发生突变，产生过长的氨基酸编码；⑥非编码区突变：如启动子、剪接部位或加尾信号的点突变导致mRNA的质和量的异常。涉及多个碱基的基因片段可发生缺失、重复和插入，也可发生一段染色体的倒位、易位、插入等重排。

20世纪末是分子生物学技术飞速发展的时期，大量基因分析新技术问世，并朝着商品化、标准化、自动化方向发展，使这项过去只能在少数顶尖实验室完成的工作用于临床实践。下面简单介绍几种目前常用的基因分析技术。

限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。如果待测DNA序列中发生的突变使某一限制性内切酶的识别位点发生改变，则经该酶水解后的片段大小和数目将发生改变。对限制性内切酶谱中特定DNA片段的存在和分布情况的分析可检测目标DNA是否正常。

个体基因间的差异称为基因多态性，如果这种多态性发生在限制性内切酶识别位点上，用该酶水解DNA时会产生长度不一的片段，称为限制性片段长度多态性（RFLP）。RFLP按孟德尔方式遗传，可作为一种遗传标志。如果致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，可通过对RFLP的检测推测致病基因的存在。

核酸分子杂交是用已知序列的DNA或RNA片段（探针）按碱基互补配对原则与待测样品核酸序列杂交，对其进行定性或定量的检测。用于杂交的探针可以是基因组DNA、cDNA、RNA、cRNA或人工合成的寡核苷酸。探针预先使用示踪物标记，杂交后经放射自显影或显色等方法检测。常用的杂交方法有：①Southern印迹杂交：将待测DNA样品纯化，经限制性内切酶酶切、电泳分离及变性处理后，再转移到固体支持物上杂交检测。用于研究DNA；②Northern印迹杂交：研究对象为RNA，方法与Southern印迹杂交相似；③斑点杂交：将样品点到硝酸纤维素膜上烘烤固定后进行杂交，是一种快速检测微量核酸的方法；④原位杂交：在保持细胞基本形态情况下使探针进入细胞内杂交，可用于确定特定核酸序列在细胞、组织内的分布和表达水平。

体外核酸扩增技术是近年来发展起来的新兴技术，可在体外使待测基因于较短时间内扩增数十万到数百万倍，经电泳分离后即可观测结果，极大简化了基因分析操作，缩短检测时间，提高检测灵敏度。目前最常用的是聚合酶链反应（PCR）技术。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，以待测DNA为模板，合成的一对寡核苷酸链为引物，在特定DNA聚合酶的催化下，经多次变性、退火、延伸的循环，使微量目标DNA得以大量扩增。

传统的PCR方法因其实用性和高效性而获得广泛应用。在此基础上又发展了许多新的PCR方法：①反转录PCR（RT-RCR）：以RNA为模板，先反转录生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，可检测出单个细胞中少于10个拷贝的RNA，也可对mRNA进行定量分析；②彩色PCR：用多种荧光标记不同的PCR引物，同时进行PCR，扩增后的产物带有不同的染料以检测突变位点；③不对称PCR：用两种不同浓度的引物进行PCR，得到单链DNA；④原位PCR：使引物、DNA聚合酶等进入细胞，在细胞内进行PCR反应，使靶序列与特定细胞联系起来；⑤反向PCR：用于扩增已知序列两侧的未知序列。

PCR产物的分析方法有：①凝胶电泳分析：是分离、纯化和鉴定DNA的首选方法，常用琼脂糖和聚丙烯酰胺两种介质，不同浓度的介质构成大小不同的分子筛孔，将不同分子量的DNA分离；②DNA序列测定：可将PCR产物装入测序载体，也可直接测序。目前自动测序仪已经得到广泛使用；③PCR-SSCP：SSCP（单链构型多态性）是指单链DNA在非变性凝胶中的泳动速度由其碱基顺序决定，长度相同单个碱基不同的单链DNA电泳迁移率不同。将待测DNA片段进行PCR扩增后变性为单链，或进行不对称PCR得到单链DNA，再通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测基因突变。该法是一种快速经济的检测手段；④PCR-ASO探针杂交：ASO是等位基因特异性寡核苷酸的缩写。根据已知的突变基因合成长度约20个脱氧核苷酸的正常和突变序列的寡核苷酸探针，分别与PCR产物杂交检测点突变；⑤等位基因特异性PCR：PCR引物的3′端与模板碱基互补时，反应可向下游延伸，反之则不能进行。如果已知特定位点上的基因突变，可根据突变序列设计引物扩增出突变片段而正常片段不能扩增，从而将两者区分开来；⑥PCRRFLP：对含有限制性长度多态性的序列进行PCR扩增后进行RFLP分析，比传统RFLP更方便快捷，灵敏度更高。

除了PCR反应，还有自动维持序列扩增（3SR）、链替代扩增反应（SDA）、连接酶反应（LCR）等核酸体外扩增技术。这些技术极大方便了基因分析工作，但与体内DNA复制相比仍比较复杂（需要变性、退火、延伸等温度循环，而体内37℃恒温），效率不高（需数小时而体内仅以分秒计）。因此发展更为简便高效的体外核酸扩增技术也是分子生物学的研究重点之一。

基因打靶又称为基因剔除，是20世纪80年代后半期发展起来的定向改造真核生物基因组的新技术。活细胞染色体DNA与外源性DNA的同源序列互补结合时，结合区的相应片段可发生交换，称为同源重组，这种重组细胞可稳定遗传。基因打靶就是利用这一性质将外源基因引入染色体DNA的特定片段上，对宿主细胞的染色体基因进行精细改造，被引入的基因可随染色体DNA稳定复制。

1.构建基因打靶载体　将目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子重组到带有标记基因的载体上。根据打靶载体的设计不同，同源重组可在靶基因位点造成插入、置换或缺失，目前常用的设计策略有插入型载体策略、置换型载体策略、“打了就走”策略、双置换法和基于重组酶的系统等5种。

2.将载体转入重组细胞内　包括化学方法（磷酸钙共沉淀和DEAE介导法等）、物理方法（电穿孔法和显微注射法等）和生物方法（脂质体和病毒载体等）3种。其中物理方法的重组效率较高。

3.筛选已击中的细胞　哺乳动物细胞中外源性DNA随机插入基因组的频率要比同源重组高，采用有效的方法筛选出同源重组的细胞克隆是必需的。常用的有PCR和Southern杂交分析等物理筛选法和启动子缺失筛选法、Poly A缺失筛选法、正负选择法等遗传筛选方法。

4.观察击中细胞的生物学特性

通过定点改造基因组中的特定基因研究其功能和调控机制，从定点突变干细胞获得突变基因模型，可了解基因的胚胎发育和生理功能。

可用正常基因替代异常基因，纠正或补偿基因功能，也可阻断基因的过量表达而达到基因治疗的目的。

可克服物种遗传壁垒的局限，将外源基因直接导入受精卵，获得新的品系。

将基因打靶技术用于胚胎干细胞，并使之发育繁殖而获得的动物为转基因动物。最早的转基因动物是转基因小鼠，这种小鼠模型为阐明基因的功能及其在发育和疾病过程中的作用提供了最直接的途径。例如， Wt1基因剔除小鼠，其性腺在胚胎发育第11天之前是正常的，此后性腺上皮显著变薄，第12天开始凋亡，表明 Wt1对性腺分化是必需的。为研究DAX-1基因功能，将其插入XY胚胎，发现高水平外源性DAX-1基因表达对正常 SRY等位基因小鼠起着延迟睾丸分化的作用，而在 SRY等位基因较弱时将导致完全的性反转，表明这两种基因是相互拮抗的。基因缺陷动物模型也可用于药物筛选，检验体细胞基因治疗的效果。

继转基因小鼠成功后，人们开始培育畜牧业的转基因动物。利用转基因牛或羊的乳汁生产某些治疗用的蛋白质，谓之动物药厂。我国已用转基因羊生产凝血因子Ⅸ。

基因诊断是运用现代分子生物学和分子遗传学的方法检查基因的存在、分析基因结构变异及表达状态，从而对疾病作出诊断。该法仅需要微量标本即可在临床症状出现之前及妊娠早期作出诊断，具有高度特异性和灵敏性，但现阶段尚存在操作复杂、费用昂贵和可能出现假阳性结果等缺点。迄今为止，能用基因诊断的遗传性疾病已超过200种。

基因诊断的途径主要包括三种：①直接检测基因突变，适用于已知致病基因的疾病。常用的技术有核酸杂交、PCR等；②基因连锁分析，适用于致病基因未知的疾病。通过对RFLP进行家系连锁分析，区分双亲的两条染色体中哪条结构异常，监测家族成员中是否携带致病基因；③mRNA检测，可定量分析，发现剪接加工缺陷和外显子的变异。常用RT-PCR或Northern方法。

基因芯片是近年来出现的热门技术，该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。关键技术包括探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术以及激光共聚焦显微技术。由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。最终有望用一滴血在一块芯片上完成所有实验室分析，提供标准、快速、准确的基因诊断。

基因治疗是将治疗基因通过合适的载体导入靶细胞，使之在体内有效表达以治疗疾病。在遗传疾病的基因治疗中所采用的策略主要有2种：①基因置换：利用同源DNA片段的交换将基因定点导入受体细胞基因组中，用正常的基因替换缺陷基因。这是最理想的策略，但同源重组效率较低，距实用还有较大差距。②基因增补：将正常基因导入患者体内表达，以补偿基因功能，但并未纠正缺陷基因。这是目前最常用的技术。

基因治疗的三大关键技术是获得目的基因、选择合适的靶细胞和有效的基因转移方法。获得目的基因的前提是明确基因的功能及其表达调控。随着人类基因组计划的实施，人类必将更深入地了解基因与疾病的关系，获得更多可用的目的基因。用于治疗的基因可以是基因组DNA，也可以是cDNA，可由基因组DNA文库、cDNA文库克隆或PCR获得，也可直接人工合成。靶细胞可分为生殖细胞和体细胞两种，需根据疾病本身的特点、目的基因的种类、转移途径和方法等决定选择何种靶细胞。由于生殖的复杂性和伦理道德因素的制约，人体生殖细胞基因治疗受到严格禁止，目前的基因治疗均选择体细胞。常用的体细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、肝细胞等。将目的基因导入体细胞有两种途径：一种是直接途径，直接在体内转移到靶细胞；另一种为间接途径，将细胞取出体外培养，导入目的基因使之表达后回输体内。基因转移技术有物理法、化学法、膜融合法、病毒载体系统、质粒DNA直接转移法等多种，其中病毒载体是主要的转移载体，但转染效率仍不能满足临床需求。

目前单基因遗传病的基因治疗已取得一定成功，如1990年美国进行的人类第一例临床试验是给一名腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者导入正常ADA基因获得成功，我国对乙型血友病的基因治疗也初见成效。肿瘤的基因治疗也是目前的研究热点。我国有三个基因治疗项目已通过国家药审，即将进入临床试用。这三个项目分别是血友病治疗、脑瘤自杀基因治疗和喉癌基因治疗。

基因治疗是一种很有前景的治疗方法，但目前治疗程序繁琐、花费昂贵、效果不尽如人意。今后还需要改进技术条件，评估治疗的安全性和对伦理道德的影响，才可能广泛应用于临床。

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