第十三章实验室检查_郭应禄男科学（第2版）-QQ阅读男生历史网

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第十三章　实验室检查

第一节　精液分析

精液由精浆和精子组成。精子由睾丸生精细胞产生，在附睾内成熟，通过输精管运输。精浆主要由前列腺、精囊腺和尿道球腺等附属腺体分泌。在射精过程中，精子和精浆构成精液。有研究通过比较输精管切除术前后的精液体积，结果显示约90%的精液量是由附属性腺的分泌液组成，主要为前列腺和精囊腺液，少量为尿道球腺和附睾分泌的液体。精液有两个主要的可量化属性：①精子总数，反映睾丸的精子生成量和睾丸后附睾及输精管道的通畅性。②各个附属性腺分泌的液体总量，其反映附属性腺的分泌功能。精子的性状（存活率、活力和形态）和精浆的成分对于精子功能来说是同样重要的。在性交过程中，射出精液的初始部分是富含精子的前列腺液，与延伸至阴道内的宫颈黏液相接触，其余的精液则储存在阴道内。与此不同，在实验室环境场所中，整份精液采集在一个容器里，精子被束缚在精囊腺所分泌的蛋白形成的凝胶状物胶冻样凝块中，随后胶冻样凝块在前列腺蛋白酶的作用下液化，液化期间精液渗透压升高。有证据表明，精液标本的质量会因为诱导射精方法的不同而不同。在实验室附近的房间中，通过手淫诱导射入容器的精液质量，可能低于在家性交时使用不含杀精子剂避孕套获取的精液质量。这种差异可以反映出不同的性唤醒方式，手淫取精所需时间的长短，反映了射精前精液溢出的程度，也会影响精液质量。

在特定采集条件下，精液质量通常取决于不能被改变的因素，如睾丸精子生成量、附属性腺分泌量和近期患病情况（尤其是发热），以及其他的因素，例如禁欲时间，这些因素都应该被记录下来并在分析结果时予以考虑。

精液质量的实验室测定结果取决于以下因素：采集标本是否完整。射精时，射出的初始部分精液主要是富含精子的前列腺液，而后面部分的精液则主要是精囊液。因此，如果射精时丢失了富含精子的初始部分，对精液检测结果的影响将远远大于丢失后面的部分。在射精的时，附属性腺分泌的液体将附睾中高浓度的精子进行稀释。由于受到其他生殖器官功能的影响，衡量睾丸精子生成量的直接指标不是精子浓度，而是射出的精子总数（精子浓度×精液量）。例如，年轻人和老年人精子浓度可能相同，但精子总数可能不同，因为随着年龄的增加，精浆量和精子生成量都会降低，至少一部分人如此。上次射精后，如果一段时间内不射精，蓄积在附睾内的精子就会溢出，然后溢入尿道，随尿液流出。禁欲时间的长短不会影响精子的存活率和染色质，除非附睾的功能发生了变化。人一次射精不会将附睾内的精子全部射出，留存于附睾内的精子会影响到下次射出精子的质量，但是这种影响的程度很难确定，也就很少考虑在内，睾丸的大小影响着每次射出精子的总数。睾丸大小不仅能反映了精子活力，也能影响精子的形态。精液质量很大程度上的不同是上述很多因素的影响，因此要求所有精液检测尽可能的精确。

从精液检查的各项指标来确定男子的生育能力是比较可靠的。常规的精液检查包括精液量、液化时间、pH、黏稠度、精子计数、精子活力、精子活率、精子形态等。若需进一步了解精子功能，还应观察精子穿透宫颈黏液的能力等。近年来，由于男科学的发展，男子生育、不育和二胎政策的迫切要求，精液检查就显得更重要。

一、精液的采集与分析方法

（一）精液标本的采集和运送

1.采集精液标本的时间

精液的采集是精液检查的一个重要步骤，禁欲的时间和方法各家报道不一。Levin等报道20例18～25岁男子健康志愿者，每日手淫收集精液1次，连续21天，测定每份标本的精液量、精子数、精子活力和活率。结果发现射精频度与精子密度、精子活率等无显著性差异。商学军等报道17例自愿供精者，年龄21～42岁，9天内供精7次，即间隔24小时供精1次，共5次，间隔48小时供精1次，共2次。测定每份标本的精液体积、密度、精子总数、液化时间等。经方差分析结果认为禁欲时间与精子密度、活率无明显差异（ P＞0.05）（表13-1）。同时也报道精浆果糖含量与禁欲时间无显著性差异（ P＞0.05）。精子总数与禁欲时间有关，禁欲时间越长，精子总数越多。Warg等曾报道禁欲时间与精液量、精子密度及精子总数呈正相关，而与精子活力呈负相关。商学军等的研究结果除精子总数与Warg等报道的相似外，其他几项指标均与禁欲时间无关。

表13-1　禁欲时间与精液质量分析

《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册（第5版）》建议检测精液禁欲时间应该为2～7天。如果需要多次采集标本，每次禁欲天数均应尽可能一致。为了避免精液处于温度波动的环境和为了控制从采集到检测的时间，应该安排受检者在实验室附近的私密房间内采集标本。检测报告单上应该记录以下资料：受检者姓名、出生日期、个人编码代码数字、禁欲时间、标本采集日期和时间、标本的完整性、获取标本遇到的任何困难、标本采集与开始精液分析的间隔时间。

2.采集精液标本的次数

由于精液分析受多种因素（环境、温度等）影响，不能仅凭1次精液结果做出判断，一般应间隔1～2周进行复查2～3次。

3.采集精液的方法

一般采用手淫法采集标本，如果有困难可用取精器采集。禁止用性交中断的方法采集精液，因为这种方法会失去精液的初始部分，而这一部分精液中精子密度最高。

精液射入清洁的广口玻璃或塑料容器内，确保该批次容器对精子无毒性（选择数份精子浓度高和活力好的精液标本，将每份标本的一半放在已知无毒性的容器内（对照组），另一半放在待检测的容器内，在4小时内、室温或者37℃下每间隔1小时重复评估1次精子活力。如果每个时间点在对照组与测试组之间没有差异（配对 t检验， P＞0.05），即可认为待检测的容器对精子是无毒性的，达到精液采集的要求。不能用乳胶或塑料制品的避孕套来采集精液，因避孕套内的滑石粉可影响精子活力。如果未收集到射出的全部精液，或运送的时间过长（超过2小时），或盛精液的容器有溢漏，此类标本均不能作精液分析。如果标本不完整，应该在禁欲2～7天后重新采集标本检测。

标本容器应该放在20～37℃环境中，以避免精子射入容器后，由于较大的温度变化对精子产生影响。在冬季转送标本时最好放在内衣口袋内，并应防止瓶子倒置。若低于20℃或高于37℃则影响精子活力（率）。容器上必须标记受检者姓名、编码、采集日期、具体时间及禁欲时间。

精液液化期间，标本容器放置在实验台上或者孵育箱内（37℃）。如果标本不完整，尤其是富含精子的初始部分丢失时，要在检测报告上注明。

4.用于辅助生殖的精液无菌采集

根据诊断目的而进行相应的精液采集方法，标本容器、移液器吸头和混匀用的吸液管必须是无菌的，确保操作过程的每一个环节都是无菌的。

5.用于微生物学分析的精液无菌采集

在这种情况下，必须避免非精液来源的微生物污染（例如，来自皮肤的共栖微生物），标本容器、移液器吸头和混匀用的吸液管必须是无菌的。

受检者须排尿。用肥皂清洗双手和阴茎，减少来自皮肤共栖微生物所致的标本污染的风险。冲洗掉肥皂沫。使用一次性无菌的毛巾擦干手和阴茎。精液射入无菌容器。从精液标本采集到开始在微生物学实验室进行检测的时间应在3小时以内。

6.在家采集精液

在特殊情况下，例如在门诊不能够通过手淫获取标本，或者实验室附近没有合适的房间，可以在家采集精液标本。应该给予受检者关于精液标本采集的清晰书面和口头指导，应该强调精液标本采集必须完整，即采集包括富含精子的初始部分在内的所有精液，以及受检者要报告精液标本任何部分丢失的情况。如果标本不完整，应该记录在检测报告中。给予受检者一个预先称重的、标记上其姓名和编码的标本容器。受检者应该记录获取精液的时间，并在采集后的1小时之内将标本送至实验室。在运送至实验室期间，标本应该保持在20～37℃。

检测报告应该记录标本采集的场所，是在家采集的或者是在实验室外面的其他场所采集的。

7.使用避孕套采集精液

仅在特殊情况下，例如不能通过手淫成功获取标本，可以在性交时将精液射入避孕套来采集标本。仅可使用专门为采集精液设计的无毒性避孕套，市场上可以买到这种避孕套。应该告知受检者，如何使用及封闭避孕套，以及怎样将避孕套送至实验室等事项。受检者应该记录获取精液的时间，并在采集后的1小时之内将标本送至实验室。在运送至实验室期间，标本应该保持在20～37℃。检测报告应该记录精液采集是使用专用的避孕套，在家里或者在实验室外面的其他场所。普通的乳胶避孕套不能用于精液采集，因为它含有损害精子活力的物质。

性交中断法是不可靠的精液采集方法，因为精子含量最多的初始部分精液或许会丢失。此外，标本可能受到细菌的污染，以及低pH值的阴道分泌液可能对精子活力有不良影响。如果受检者不能提供精液标本，性交后实验或许可以提供其精子的一些信息。

精液标本可能含有危险的传染性病原体，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）、肝炎病毒或者单纯疱疹病毒，因此应视为生物危险品处理。如果标本用于生物检测、宫腔内人工授精（intra-uterine insemination，IUI）、体外受精（in-vitro fertilization，IVF）、卵母细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）或者进行精液培养，处理标本过程中必须使用无菌物品和无菌技术。并严格遵守以下安全指南：不允许任何人在男科学实验室进食，吸烟，化妆或存放食物。不允许用嘴吹吸移液管。应当用机械移液装置进行液体的操作。实验室所有人员在实验室内应当穿着实验室工作外套或者一次性工作服，并在离开时脱下。实验室人员应当佩戴一次性手套（橡胶、乳胶或乙烯树脂材质，有或无干粉），尤其是在操作新鲜的或冷冻精液或精浆或其他生物样本和任何接触过这些样本的容器时。当工作人员离开实验室或使用电话、电脑时，必须摘下并丢弃手套。手套不能重复使用。实验室人员应当经常洗手，尤其是离开实验室之前、处理样本之后以及脱下实验服和手套之后。

实验室人员应采取预防措施防止由那些可能被精液污染的尖锐器械造成的意外伤害，并且避免精液接触到裸露的皮肤、破口、擦伤或病变部位。应当采取措施防止并在必要时清除精液、血液或尿液样品的溢漏。

所有用过的尖锐物品（针头、刀片等）应放进一个有标记的容器里。该容器不等完全装满就加以密封，并以处理实验室其他危险品同样的方式处理掉。所有潜在的危险品（手套、精液容器）应收集到一起以适当方式处理。所有实验室人员在进行可能产生气雾或飞沫的操作时应戴面罩或医用口罩，例如，在对敞口容器涡旋混匀或离心时。不要强行排出移液管内最后残留的精液样本，因为这样可能造成飞沫或气雾。在必要的时候，实验室成员应当穿戴安全防护眼镜、绝缘手套和防护鞋。

完成分析后的日常工作：用消毒剂清洗工作台面，如0.1%（1g／L）次氯酸钠或类似的消毒剂，处理至少1小时（或过夜），然后用清水冲洗。把计数板和盖玻片浸泡在0.1%（1g／L）次氯酸钠或类似消毒剂中过夜处理。用清水冲洗掉消毒液即可。样本溢出后：如果装样本的容器外面被污染了，要用消毒剂清洗，如用0.1%（1g／L）次氯酸钠或类似的消毒剂，然后用水冲洗。溢出发生后立即用消毒剂清洗工作台，如用1.0%（10g／L）次氯酸钠或类似消毒剂，至少处理4小时再用水冲掉消毒剂。必要时，可用以下方法对精液收集管内的HIV病毒进行热灭活：在170℃（340℉）干热消毒至少2小时。加热前用铝箔纸包裹容器，待冷却后再取出。在121℃（250℉），101kPa（15psi或1个标准大气压）以上，蒸汽消毒至少20分钟。持续煮沸20～30分钟。

（二）精液的外观及物理学检查

1.外观

精液是一种半流体状的液体，有一定的黏度。用玻璃棒挑动黏丝长度3～5cm，倾倒时则可成为滴流。黏度过高或过低，均反映精液质量不佳。精液的颜色，难以做出确切判断。一般认为刚射出的精液为灰白或灰黄色，自行液化后则为半透明的乳白色或灰黄色。长时间未排精的人射出的精液略带淡黄色。老年男子精液呈暗黄色。有的精液为棕红色或带血，则称血精，应考虑可能有精囊腺炎、前列腺炎等生殖系统疾病。白或黄色清亮的精液提示无精症，有些药物也可使精液带有颜色。

2.气味

无确切的描述，正常精液标本具有刺激性气味，有时类似石榴花的特殊腥味，精液的这种气味是由前列腺分泌液产生。

3.pH

用精密pH（5.5～9.0）试纸检测，正常精液为7.2～8.0。当附属性腺或者附睾有急性感染性疾病时，精液的pH可以大于8.0。而在慢性感染性疾病时，精液pH可以是7.2或低于7.2。已知前列腺液的pH为6.65±0.44，前列腺炎时，前列腺液pH升高。当输精管道阻塞或先天性精囊腺缺如，均可导致精液pH下降。分析射出的第一部分精液，因大部分为前列腺液，所以pH偏低。当前列腺液缺乏时精液pH偏碱。细菌污染和含有死精子的精液，可能会产生氨（NH ₃）从而使精液pH呈碱性。测定精液pH应在精液液化后立即测定，因为精液放置时间较长会影响pH测定结果。

4.精液的液化

刚射出的精液呈稠厚的胶冻状，因含有前列腺分泌的蛋白酶，在其作用下15分钟后精液便从凝固状态转变成液体状态，这称为精液液化。通常室温下几分钟内，精液开始液化（变得稀薄），此时精液中可见异质性混合团块。随着液化的继续，精液变得更加均质和十分稀薄，在液化最后阶段仅存留少量小凝团。在室温下，通常在15分钟内，精液标本完全液化，很少超过60分钟或更长时间。精液的凝固蛋白由精囊腺分泌，而液化因子则由前列腺分泌。精液暂时凝固及逐渐液化是正常生理现象。在精液分析时，精液呈不凝固状态，可能是先天性精囊腺或射精管缺陷所致。若在室温25℃下1小时不液化，应视为异常。这可能是前列腺分泌的液化因子功能低下，导致蛋白水解酶缺乏。在家中或使用避孕套收集精液标本，当将标本送到实验室时，一般已经液化。正常液化的精液标本可能含有不液化的胶冻状颗粒（凝胶状团块），这不代表任何临床意义。然而，黏液丝的存在可能会干扰精液分析。有时候精液可能不液化，这使得精液评估变得困难。在这种情况下，需要另行处理，可能必须进行机械混匀或酶消化。一些标本通过加入等体积的生理培养液，如Dulbecco磷酸缓冲盐水（用10IU／ml的菠萝蛋白酶液与等体积的精液（1+1）进行稀释（1∶2），用移液管吸头的尖部搅拌，37℃孵育10分钟。）在进一步分析之前充分混匀精液。这些处理可能影响精浆的生化、精子活力和精子形态，使用它们必须作记录。当计算精子浓度时，必须考虑1+1加入菠萝蛋白酶液使精液按1∶2稀释，并且用加样器反复吹打，可使其液化。

5.精液量

通常用刻度离心管（10ml）测定精液全量，尽量注意在吸取时不要丢失。精液量正常为2～6ml，平均为3.5ml，如受检者3天不排精液，1次射出精液量仍少于1.5ml，应视为不正常。发现精液量少时，应注意鉴别是否有逆行射精、睾丸分泌雄激素低下、副性腺功能障碍或收集方式不当、射精管阻塞或先天性双侧输精管缺如（CBAVD），以及精囊腺发育不良等因素。精液大于8ml／次，称为精液量过多，精液量过多可以是禁欲时间较长，或者是附属性功能亢进，或是附性腺活动性炎症情况下的活跃分泌。精液量增加，可以造成精子密度降低，而且精液过多使阴道内的精液大量流出并带出大量精子，干扰精子在女性生殖道内运行导致不孕。精液主要由精囊腺和前列腺的分泌液构成，包括少量来自尿道球腺和附睾分泌的液体。由于要计算精液中的精子总数和非精子细胞，所以，精确测量精液体积是任何精液评价的基础。

最好通过称重收集量器中的精液来测量精液体积。用一个预先称重、干净、处理过的容器收集精液。称重盛有精液的容器。减去容器的重量。由精液的重量计算出精液体积。精液体积也可以直接测量。将精液标本直接采集到一个改良的广口带刻度玻璃量杯中，现在市场上可购到这种量杯。直接从刻度上读取精液体积（精确到0.1ml）。

不推荐将精液从量杯中吸到移液管和注射器，或倒入量筒中来测量体积，因为不能完全将精液回收，因此会低估精液体积。丢失的体积一般在0.3～0.9ml之间。

（三）精液的显微镜检查

在做显微镜检查前，应将精液标本充分调匀，避免抽样误差影响精子活力及计数结果。将混匀的精液取一滴在玻片上（液滴的直径为2～3mm），通常在低倍光学显微镜下粗略观察有无精子，是活动精子还是不活动精子。若遇无精子症，应将标本离心沉淀后重复检查一次。精液标本的显微镜初步检查是在总倍数为100倍（也就是10倍的物镜和10倍的目镜）视野下观察标本制片的情况。显微镜初检可以对标本作一般观察，能够显示：黏液丝的形成；精子的聚集或凝集；除精子外存在的细胞，精液中还混有多种细胞成分，如细菌、上皮细胞、红细胞、白细胞和不成熟生精细胞、单独的精子头或尾，都应如实描述。标本制片应在200倍或400倍的总放大倍数下观察（20倍或40倍物镜配上10倍目镜）。这样可以用于：评估精子活力；确定用于精确测量精子数目所需的精液稀释倍数。精液的液化状态影响代表性取样精液分析的结果。如果精液混匀不充分，两次分别取样的精子的活力、存活率、浓度和形态学分析结果都可能出现显著差异。为确保获得可重复的数据，在取样用于检测之前，应充分混匀标本。当重复取样的结果一致时才能认可此测定值。在进行精子显微镜检查前应该制备湿片，制备湿片的步骤如下：①充分混匀精液标本；②混匀后立即取精液样本，使精子没有从悬浮液沉降的时间；③在取出重复精液样本前，再次充分混匀精液；④取出的精液体积和盖玻片的规格必须标准化，以便于在固定深度约20μm）的制片上进行精液分析，这样精子可以自由泳动；⑤取一定标准体积的精液，例如，10μl，置于洁净的载玻片上；⑥盖上盖玻片，例如，10μl精液采用22mm×22mm的盖玻片，形成一约20μm深的池，盖玻片的重量使标本散开；⑦小心尽量避免在盖玻片和载玻片之间形成气泡；⑧一旦制片内精液不再漂移，立即评估新鲜制备的湿片。

1.精子活率分析

精子活率指精子总数中活精子所占比例。精液标本一旦液化应该立即检测精子存活率，最好在30分钟内，任何情况下不能超过1小时，以防止脱水或温度变化对精子存活率产生有害影响。检查时，取液化混合精液1滴，滴在玻片上或专门用于精液分析的计数板上立即进行观察。需避免室温过低，防止精液干燥。最好将精液放在有室温调控的显微镜下观察，或置25℃恒温箱内观察。随意计数5～10条精子中活动精子的数目即为精子活率，所有尾部有运动的精子都是活动精子。

精子的存活率通过检测精子膜的完整性来评价，可以常规检测所有标本的存活率，但对于前向运动精子少于40%的精液标本特别重要。这个试验能够核查活力评估的准确性，因为死精子的百分数不应超过（在取样误差中）不活动精子的百分数。活精子百分率正常是超过活动精子百分率的。阐明不活动精子是活精子还是死精子具有重要的临床意义。同一份精液标本的存活率结果应该与活力结果一起综合评价。活的但不活动的精子占有很大比例可能提示精子鞭毛有结构缺陷；高百分率的不活动精子和死精子（死精症）可能提示附睾病理改变。

通过染料拒染法或低渗膨胀试验来鉴别细胞膜完整的精子，从而得出活精子的百分率。染料拒染法基于损伤的细胞膜，例如在非活的（死）细胞上的膜，允许非透过膜性染料进入膜内染色。低渗膨胀试验假设只有细胞膜完整的细胞（活细胞）能够在低渗溶液中发生膨胀。

在精液中不动的精子并不一定都是死精子。这与精子膜的损伤程度有一定的关系，死精子其头部膜受损，染色液可以渗到细胞内使细胞着色，而活精子有完整的细胞膜，染色液不易渗入，精子不着色。通过这一方法将死活精子区分开来。常用有以下方法：①伊红Y或锥虫蓝法——取1滴精液加等量的50g／L伊红Y或20g／L锥虫蓝（0.15mol／L pH 7.4磷酸盐缓冲液配制）于玻片上混匀，2分钟后推成薄片，空气中自然干燥片刻。镜下死精子呈红色或蓝色，活精子不着色。生育男子（60例）活精子为（86.0±7.2）%；不育男子（171例）活精子为（65.0±19.6）%；二者之间相差非常显著（ P＜0.01）。②伊红-苯胺黑的精子存活率试验法，苯胺黑形成了黑色背景，使淡染的精子更易分辨。用亮视野显微镜观察，活精子头部呈白色，死精子头部呈红色或暗粉红色。头部呈淡粉红色的精子认为是活精子。如果染色只限于颈部区域，头部的其余区域未染色，这种情况考虑是“颈部膜渗漏”，这不是精子死亡和整个细胞膜破裂的征象信号，这些精子应被评估为活精子。③低渗膨胀的精子存活率试验法，低渗膨胀试验可以用来评估精子的存活率。当必须避免精子染色的时候，这种方法是有用的，例如，为ICSI选择精子的时候。膜完整的精子在低渗溶液中5分钟内发生膨胀，在30分钟之内所有尾部的形状是稳定的，因此，作为常规的诊断，孵育30分钟；但是当精子处理用于治疗用途时，孵育5分钟。发生膨胀的精子通过精子形状的改变来辨别，如显示尾部卷曲。通过精子尾部卷曲来辨别活精子；评定所有尾部膨胀类型的精子为活精子。精子存活率（膜完整的精子）的参考值下限是58%。

2.精子活力评估（活动精子百分率）

精子活力即精子的运动能力。标本液化后，应尽快检测精子活力，最好在30分钟内，任何情况下都应在射精后1小时内检测，以避免因脱水、pH值或温度变化对精子活力的有害影响。检查时，充分混匀精液标本，混匀后立即取精液样本，使精子没有从悬浮液沉降的时间。在取出重复精液样本前，再次充分混匀精液，对于每份重复样本，制备一个大约20μm深的湿片，等待湿片内精液样本停止漂移（在60秒内），在200或400倍数的相差显微镜视野下观察玻片，为评估不同精子活力级别百分率，每份重复样本计数200个精子，比较两个重复样本值，核查两值的接近程度是否可以接受。如果可以接受，计算百分率；否则，制备新样本再作检测。精液活力检测应在室温或带有加热37℃载物台的显微镜下进行检查，每个实验室的操作程序需标准化。例如在37℃评估精子的活力，这个标本应该在同样温度下孵育，并使用预热的载玻片和盖玻片制备样本。推荐使用带有网线和网格的目镜，以限制观察区域。这样使得两次评估时观察的是载玻片上相同的区域。首先评估前向运动的精子，然后是非前向运动精子和不活动精子。对观察区域作了限制，因此也限制了区域内所检测的精子数目，这样可以保证制片的几个区域内精子活力得以检测。

WHO精液分析第5版推荐使用一个评估精子活力等级的简单系统，将精子分类为前向运动、非前向运动和不活动的精子。每个精子的活力按以下分级（表13-2）：前向运动（PR）：精子主动地呈直线或以较大半径行圆周运动，不管其速度如何。非前向运动（NP）：所有其他非前向运动的形式，如以小圆周泳动，尾部动力几乎不能驱使头部移动，或者只能观察到尾部摆动。不活动（IM）：没有运动。

表13-2　精子活动级别WHO（2010）

前向运动精子应分类为快速和慢速运动，37℃时速度＞25μm／s界定为a级。然而，技术人员很难无偏差地精确界定前向运动。当讨论精子活力时，重要的是确定总的精子活动率（PR+NP）或前向运动（PR）的精子活动率。精子总活力（PR+NP）的参考值下限是40%（第5个百分位数，95%可信区间是38～42）。前向运动精子（PR）的参考值下限是32%（第5个百分位数，95%可信区间为31～34）。

精子活力可受时间、温度、精液的液化程度等影响，对精子活力各家报道不一。Glezerman和Bartoou报道精子活力：射精后1小时＞50%，3小时＞40%。江鱼报道射精后1小时为70%，3小时为60%，7小时为50%。

Jenks等将精子活力分为0-Ⅳ级。

［0］无活动精子；［Ⅰ］精子尾活动，但不能前向运动；［Ⅱ］缓慢的波形前向运动；［Ⅲ］有快速运动，但波形运动的较多；［Ⅳ］活跃快速前向运动。

南京军区南京总医院（现中国人民解放军东部战区总医院）根据精子前向运动能力，分类为无活动能力、活动能力差、活动能力良好、活动能力很好。无活动能力表示精子无任何活动；活动能力差表示精子前向运动能力差，有的只在原地旋转移动；活动能力良好表示精子可以前向呈直线运动，但不活跃；活动能力很好表示精子很活跃地前向呈直线运动。精子活率和活力的关系为：正常精液精子活率为射精后1小时＞60%、3小时＞50%、6小时＞30%；精子活力射精后1小时无显著差异，6小时活力良好的精子占20%左右。若6小时活动力良好的精子降至5%以下，则可直接影响生育。

3.精子密度

精子密度就是每毫升精液内的精子数目，也称精子计数或精子浓度。精子总数表示全部射出精液量的精子总数目，即精子密度（亿／ml）乘以精液量（ml）。

（1）精子密度的粗略估计法：

将液化精液混匀直接涂片，用普通光学显微镜（40×）观察5个视野，取其平均数乘以10 ⁶，即为大概的精子数。如5个视野的平均数为60，则精子计数大约为60×10 ⁶／ml。

（2）精子密度精确计算法：

20世纪80年代以前通常采用计算血液白细胞的方法，使用血细胞计数器来检验。现在常采用Makler精子计数板、Microcell精子计数池、计算机辅助的精液分析（CASA）精子图像分析仪等来检验。详见本节计算机辅助的精液分析。

（3）常用精液稀释液配方：

①NaHCO ₃5g，36%的甲醛1ml，蒸馏水加至100ml。为了增加观察时精子的清晰度，可在上述100ml溶液中加甲紫饱和水溶液0.5ml；②尿素40g，蒸馏水100ml；③0.1mol／L pH 7.4磷酸盐缓冲液100ml（内含0.1mol／L磷酸氢二钠81.0ml，0.1mol／L磷酸二氢钠19.0ml）加36.5%甲醛1.0ml，Tritonx-100 0.1ml。

（4）方法：

用血红蛋白吸管吸取液化精液20μl，加380μl精子稀释液；或取10μl精液，加190μl精子稀释液。稀释液破坏精液黏稠性并固定精子。精液与稀释液混匀后滴入计数池内，静止5分钟左右，让所有细胞沉积下来，然后进行计数。

（5）计算方法：

标准血细胞计数器为5个大格，中间一个大格为25个小方格，在计算精子数时仅计数中间大格中的4个角和中央1个小格。应该评估血细胞计数板的两个计数池内的精子数目。如果两个计数池得出的数值十分一致，可以认为取出的样本可以代表精液标本。

（6）结果：

精子计数=5个小方格内精子数×50 000×稀释倍数（习惯上稀释20倍即1∶20）。每毫升精子计数等于观察到的5个小方格内的精子数加上6个0。注意计数时只计算正常精子（具有尾部的、成熟的、形态正常的精子），以精子头作计数范围，精子头不在格内的不计。

（7）正常值与临床意义：

加拿大学者Fahim和Wang报道正常精子计数平均为1.14×10 ⁸／ml；芬兰学者Vierula等报道正常精子计数平均为1.34×10 ⁸／ml；Glezerman和Bartoou报告，正常精子计数在3×10 ⁷～2.5×10 ⁸／ml，差异较大。国内江鱼报道，精子密度在1×10 ⁷～1.3×10 ⁸／ml之间；王信心等报道为2.9×10 ⁷～1.67×10 ⁸／ml。南京军区南京总医院（现中国人民解放军东部战区总医院）的检验结果，精子密度在1.1×10 ⁷～2.6×10 ⁸／ml。美国Carlsen教授等研究了1938年到1991年间发表的有关男子精液质量的61篇论文（表13-3），15 000名年龄18～25岁健康男子精液的数据表明，精子密度均值由1940年的1.13×10 ⁸／ml下降到1990年的0.66×10 ⁸／ml。后来美国的Harry Fisch等教授对这61篇论文进行认真分析发现，1970年以前的数据源于美国，且80%来自纽约，他们认为精子密度可能存在地理差异。这些数据的差异，可能与地区和采精的季节有关（表13-4）。一般认为，＜2×10 ⁷／ml易发生生育能力低下，甚至不育（表13-5）。但临床工作中发现，＜2×10 ⁷／ml也有受孕者。相反，精子计数＞1×10 ⁸／ml的也有不育者。因此，估计一个男子的生育能力不能只凭精子计数，还需考虑其活力、形态以及血清及精浆中是否存在抗精子抗体，精浆中免疫抑制物质是否含量正常等因素。

表13-3　生育男子平均精子密度

表13-4　我国各地区正常男子精液分析

表13-5　精液特性的参考值下限（WHO，2010）

续表

二、精液参数分析的几种方法

精液常规检查是判断男子生育能力的最基本的手段。经典的方法是用血细胞计数板计数精子的密度，再用涂片估算精子的活动力和活动精子百分率。这种方法不但结果误差大，不同实验室以及不同操作者之间缺乏可比性，而且只能分析精液有限的几个参数指标。近年来，随着男科临床与基础研究的不断发展，精液分析方法的不断改进，用于精液检测的工具也在不断更新。

（一）血细胞计数板

血细胞计数板，又称牛鲍板，用于精液分析已有50余年的历史。目前仍然是我国大多数单位用于精液分析的主要工具。国际上血细胞计数板被认为是精子计数的“金标准”。此外还有一种改良的诺氏血细胞计数板也可用于精子密度分析。对于血细胞计数板是否为精子计数的“金标准”，不同学者的实验结果反映不一。血细胞计数板的不足之处在于精液需要稀释，而稀释后的精子丧失了运动能力，因此不能用来分析精子的活动力和活动率等运动功能指标。这两项指标传统的检测方法是通过涂片粗略估算，即便是十分有经验的检验员，检验结果也相差甚远。

血细胞计数板的结构：血细胞计数板底板由一块厚玻璃底板与专用盖玻片组成，底板中央有两个计数池，深度为0.1mm。每个计数池为3mm×3mm平分成9个大方格，中间一个大方格用双线分为25个中方格，每个中方格又用单线分为16个小方格（图13-1）。盖玻片为血细胞计数板专用，厚度为0.4～0.7mm。盖上盖玻片后，每个中方格占有的体积为0.2mm×0.2mm×0.1mm=4×10 ^-3mm ³。

图13-1　改良Neubauer型

1.常用精子稀释液

2.操作方法

取液化精液10μl，加190μl精子稀释液，充分混匀后注入计数池中，一般加5μl左右，刚好充满整个计数池，如果加量过多，可使盖玻片与计数池之间的间隙增加而引起误差。加样后静止5～8分钟以上，待精子完全沉入计数池底部后再在镜下观察，计数中间大方格内4个角和中央1个中方格内的精子数。这5个中方格所占有的体积（mm ³）为5×4×10 ^-3=2.0×10 ^-2，最后按照稀释倍数换算成×10 ⁶／ml。由于计数池深达0.1mm，精子相互重叠而不处于同一焦平面上，计数时需要不时调整焦距以避免遗漏。为使计数结果准确，不同密度的精液需作不同倍数的稀释。精子密度＜20×10 ⁶／ml时用1∶10或1∶5稀释，密度在（20～100）×10 ⁶／ml时用1∶20稀释，当密度＞100×10 ⁶／ml则可稀释50倍或50倍以上。

3.计数原则

精子头部全部或1／2以上在计数方格内时为有效计数。同一份标本应计数血细胞计数板的2个计数池并计算平均值，两个计数池计数结果的CV值应＜10%，如＞10%应重新加样计数。

为减少取样误差，必须计数足够数量的精子（最好至少计数400个精子，每个重复样本计数大约200个精子）。

评估精子数的精确性取决于所数的精子数目。在Poisson分布中，计数的标准误（SE）是计数（ N）的平方根（ N），一定体积精液中精子数目的95%可信区间（CI）大约是 N±1.96× N（或 N±大约2× N）。

如果计数100个精子，标准误是10（100），95%可信区间是80～120（100±20）。如果计数200个精子，标准误是14（200），95%可信区间是172～228（200±28）。如果计数400个精子，标准误是20（400），95%可信区间是360～440（400±40）。

取样误差可以方便地表示为计数的一个百分率（100×（ N／ N））。

如果计数精子数目太少，得出的结果将会不可靠，这将影响到临床的诊断和治疗。如果精子用于治疗目的和精子数目少，出现不确切结果是难以避免的。

（二）Makler精子计数板

针对血细胞计数板用于精液分析的不足，1978年以色列学者Makler发明了专用于精液检测的计数板—Makler精子计数板（简称Makler板）。它的特点是简便、快速；精液不需要稀释；准确性高，精确度好。一次加样不但可计数精子密度，还可分析精子的活动力和活动百分率。此外，如果在相差显微镜或暗视野显微镜下配以显微照相，还可以拍摄下精子的运动轨迹，并可从照片上分析精子的运动速度和运动方式。Makler板也是精液自动分析仪中常用的计数板。但由于Makler板的价格十分昂贵，外形也不便于在普通显微镜下操作和观察，因此在国内很少有单位使用。南京军区南京总医院黄宇烽教授和南京金陵男科医院徐元诚院长领导的科研小组，历经3年多的攻关，研制成适合于我国广大基层单位使用的国产精子计数板——LJJB-Ⅰ型精子计数板，也称Macro板（Macro为其商标名）。除具有Makler板的一切优点外，还具有价格低，可在普通显微镜下使用的特点，便于在我国普及，有助于推广使用专用的精液分析工具，建立我国精液分析的标准化。

Makler及Macro精子计数板的结构：

1.Makler板的结构

Makler板由底盘和盖板二部分组成，底盘是一块金属圆板，中央为光学玻璃载物平台。载物平台四周有4根石英圆柱体支柱（图13-2），支柱高出平台10μm，石英具有很强的耐磨性。盖板为四周镶嵌了金属的玻璃，具有很好的平整度。其中央刻有100个0.1mm×0.1mm的小方格，当盖上盖板后，盖板与载物平台之间的间隙正好为10μm，恰好能容纳一层精子而又不影响精子在水平方向上的自由运动。10个小方格所占有的体积均为0.1mm×0.1mm×0.01mm×10=1.0×10 ^-3mm ³=1.0×10 ^-6ml。

图13-2　Makler精子计数板的结构

2.Macro板的结构

Macro板的基本原理同Makler板，即载物平台四周的支柱高出平台10μm，盖上盖板后两者之间的间隙保持在10μm。Macro板也由底板和盖板二部分组成（图13-3）。底板为一块75mm×35mm的长方形玻璃，与显微镜的载物平台相匹配，移动灵活，便于镜下迅速找到目标。中央的载物平台比Makler板缩小了面积，这样增加了单位面积上精液所受盖板重力产生的压强，使盖板与支撑柱紧密接触，减少误差。载物平台四周为3个抛光宝石圆球，使支柱与盖板的接触为点与面的接触，更好地克服了精液的张力，确保载物平台与盖板之间的间隙为10μm。盖板的盖玻片厚度有1mm和0.4mm两种，前者适合于在20×或25×物镜下观察，后者还可在普通显微镜40×物镜下观察。计数网格一般刻在载物平台中央，为100个0.1mm×0.1mm的小方格。也有将网格刻在盖板中央或不刻网格。未刻有计数网格的计数板可在网格目镜下计数。

图13-3　Macro精子计数板的结构

3.操作方法（Makler板和Macro板）

（1）精子密度计数：

取液化后充分混匀的精液0.2～0.5ml置于65℃水浴灭活5～10分钟，再取一小滴（约5μl）滴加在载物平台上，轻轻盖上盖板，随机计数10个小方格内的精子数乘以10 ⁶／ml，即为精子的密度。若精子密度＜20×10 ⁶／ml，应计数更多的小方格，避免因为精子分布不均匀造成的误差。对于精子计数十分熟练的检验人员，可用没有灭活的精液在镜下直接计数。计数时快速移动显微镜操作平台，只计数进入小方格内的精子。需要指出的是这种方法可能会带来一定的误差，应反复实践，熟练掌握。

（2）精子活动百分率计算：

同上计数精子密度，再计数10个小方格内不活动精子数（也可计数活动精子数），按下列公式计算精子活动百分率：

（3）精子活力的评价：

由于检查平台和盖板之间只有10μm的间隙，只允许精子在无重叠的情况下运动，这样能清晰地观察到精子的活动情况，参照WHO的4级分类法来评价精子的活力。

（4）精子运动轨迹图像分析：

取液化精液1滴（约5μl）滴加于计数板载物平台，盖上盖板，置于20×负高反差相差物镜下观察，选择一定的视野，调整好照相装置，调节光源的强度使曝光时间固定（一般选择3秒），拍摄下精子运动3秒留下的轨迹。胶卷选用ISO 100／21°黑白全色胶卷。拍摄完后用D-76显影液显影12分钟，水洗3次，再用酸性定影液定影10分钟，流水冲洗5分钟后自然干燥，冲洗好后的胶片再在暗室放大成照片。放大时根据底片的厚薄程度调整光圈和曝光时间进行曝光，显影液选用D-72，显影1分钟左右使成像清晰，流水漂洗后再定影10分钟，流水再漂洗5分钟，烤干即可，具体操作可参考有关摄影专业书。照片一般放大200倍，从照片上可以很直观地观察到精子运动轨迹的图像，随机测量10～20条前向运动精子的轨迹长度，取其平均值，按下列公式计算精子的平均前向运动速度：

同样也可以从照片上分析精子的密度和精子的活动百分率。方法：随机计数10个小方格内的精子数（活动的和不活动的分别计数），精子的运动轨迹50%以上在小方格内的为有效计数，乘以10 ⁶／ml即为精子密度，活动精子数／精子密度为精子活动百分率。在照片上不活动的精子可清晰地看到完整的精子图像，而运动精子只能看到留下的轨迹（图13-4）。此外，从照片上还能反映出精子的运动方式。精子的运动轨迹也可以通过单点多次曝光方法在暗视野显微镜下拍摄。

图13-4　精子运动轨迹图像

（5）精子运动试验：

精子运动轨迹图像分析需要有一定的设备条件，基层单位要创造条件开展。精子活动力的判断受主观因素影响较多，精子运动速度可将活动力的指标量化，减少主观误差。

取液化精液1小滴置于计数板载物平台，盖上盖板，在20×或25×物镜下观察，任意选择一个小方格的一条边作为固定线段，计数100条精子从不同角度和方向通过100μm×10μm=1000μm ²=0.001mm ²面积所需的总时间，用以下公式计算出精子平均速度：

V：精子的平均运动速度（μm／s）；D：精子密度（×10 ⁶／ml）；Q：0.001mm ²；T：100条精子通过固定面积所需的总时间；N：100（统计的精子数）；cos 45°：0.707。

（6）利用屏幕显示测定精子的运动速度：

加样同前，利用彩色显像系统在大屏幕上观察运动精子。将透明玻璃纸粘在彩色电视机的屏幕上，用记号笔记录下运动精子的起止点（尽可能利用网格线条），同时用秒表记下该精子的运动时间，再用记号笔将起止点连接起来，并在线段上标记上序号。如此记录20～100条活动精子的运动线段，根据公式计算出精子的平均运动速度：

V：精子平均运动速度（μm／s）；S1-Sn：屏幕上各精子运动的线段长度（μm）；T1-Tn：对应精子的运动时间（s）；M：统计的运动精子总数；δ：放大系数。

（7）注意事项：

①计数板每次使用前后务必将盖板和载物平台擦拭干净。可以直接用水冲洗后晾干；或用干净长纤维纱布轻轻擦干，再用洗耳球吹去可能有的尘埃等微小物质。连续使用可用无水乙醇与乙醚的混合液（3∶7）擦拭。②每次加样不要超过5μl，否则会增加液体的表面张力，使盖板与载物平台之间的间隙＞10μm，影响计数结果的准确性，因此最好使用细吸管或小玻璃棒加样。盖上盖板后不应有气泡，如有气泡，应清洗计数板后重新加样。③计数板为精密仪器，不可用硬器碰撞，也不可用擦镜纸或普通布块硬行擦拭，以免磨损或留下划痕。④计数板不用时可将其置于培养皿内，垫上大小合适的海绵，防止意外损坏。

（三）Microcell计数池

随着AIDS病等各种性病的蔓延，给从事精液分析的检验人员和科研工作者带来了潜在的危险。另外Makler板操作时如不严格，任何细微的误差都可能影响最终的结果。而且Makler板经多次反复擦洗后，也可能会影响其测量精度。1990年，Ginsbury和Armand发明了一次性使用的Microcell计数池专用于精液分析。

1.Microcell的结构

Microcell是在一块载玻片上用环氧树脂粘上一层一定厚度的疏水性材料，上面覆上盖玻片（图13-5）。载玻片与盖玻片之间有固定的距离（有3种规格：12μm、20μm和50μm，其中以20μm最为常用）。每块Microcell有2个计数池，可分析2份标本。

图13-5　Microcell精子计数池的结构

2.操作方法

取液化精液3～5μl从盖玻片的边缘注入计数池（有→标记），疏水性材料通过毛细作用将精液充满载玻片与盖玻片之间的间隙，并将其中的空气排出。人工分析时，用网格目镜计数，根据不同的放大倍数乘以一定的系数（根据网格目镜放大倍数）换算成×10 ⁶／ml。其他分析方法基本同Makler板。Microcell主要应用于精液自动分析仪中。由于计数池的深度已经固定，避免了操作带来的不必要的误差，计数结果比血细胞计数板和Makler板具有更高的精确性，目前被认为是最佳的精液分析工具。因为不能重复使用，成本高。据了解国内已有单位在研制开发国产的一次性使用的精子计数板。

同Microcell类似的产品还有称为Cell-vu的计数板。所不同的是计数板上刻有100个0.1mm×0.1mm的小方格，可在镜下直接计数，不需要使用网格目镜。

（四）计算机辅助的精液分析

传统的精液分析往往带有很大的主观性，不同的检验人员分析的结果有时相差甚远，对精子运动能力的判断缺少严格的量化指标。利用Makler板（或Macro板）进行精子运动轨迹图像分析，计算精子的平均直线运动速度，操作流程多，工作量大。计算机辅助的精液分析（computer-aided semen analysis，CASA）是20世纪80年代发展起来的新技术，除可分析精子密度、活动百分率等指标外，在分析精子运动能力方面显示了其独特的优越性。

1.CASA系统中的主要参数术语

（1）轨迹速度（VCL）：

也称曲线速度，即精子头部沿其实际行走曲线的运动速度。

（2）平均路径速度（VAP）：

精子头沿其空间平均轨迹的运动速度，这种平均轨迹是计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来的，可因不同型号的仪器而有所改变。

（3）直线运动速度（VSL）：

也称前向运动速度即精子头部直线移动距离的速度。

（4）直线性（LIN）：

也称线性度，为精子运动曲线的直线分离度，即VSL／VCL。

（5）精子侧摆幅度（ALH）：

精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度，可以是平均值，也可以是最大值。不同型号的CASA系统由于计算方法不一致，因此相互之间不可直接比较。

（6）前向性（STR）：

也称直线性，计算公式为VSL／VAP，也即精子运动平均路径的直线分离度。

（7）摆动性（WOB）：

精子头沿其实际运动轨迹的空间平均路径摆动的尺度，计算公式为VAP／VCL。

（8）鞭打频率（BCF）：

也称摆动频率，即精子头部跨越其平均路径的频率。

（9）平均移动角度（MAD）：

精子头部沿其运动轨迹瞬间转折角度的时间平均值。

（10）运动精子密度：

每毫升精液中VAP＞0μm／s的精子数。

2.CASA系统的基本组成

（1）相差显微镜、恒温装置和专用计数板（Makler板、Macro板或Microcell计数池等）组成摄像系统。

（2）高速、高分辨率的摄像机和电视监视器组成摄像系统。

（3）计算机分析处理系统及打印机打印输出。

3.操作方法

不同厂家不同型号的CASA系统应根据其说明书具体操作。

CASA是近十年来发展起来的新技术，现已逐步应用于男科实验室常规分析。CASA具有客观、高效、高精度的特点，尤其能分析与精子运动功能相关的多种参数。CASA系统识别精子根据人为设定的大小和灰度来判断，准确性受精液中细胞成分和非细胞颗粒的影响。计算精子活动率时，精子只有产生了一定的位移，CASA系统才认为是活动精子，而对原地摆动的精子则判为不活动精子，测出的值低于实际结果。Davis认为CASA系统参数的设置、阈值的设定、视屏取像率等都可以影响最终结果。CASA对精子密度有一定的限制，在（20～50）×10 ⁶／ml范围内检测结果较理想。精子密度过高时，标本需要适当稀释，一般采用同份精浆标本稀释。精子密度过低时应多选几个视野采样。随着软件系统的不断改进，目前新的CASA系统可检测较大精子密度范围的精液标本。用于CASA系统的精子计数板有Makler板和Microcell计数池，Macro计数板也可用于CASA系统，而Microcell可能更适用。

由于CASA系统的设置缺乏统一的国际标准，不同厂商和型号的CASA分析结果可比性差，目前WHO并不推荐在精液常规分析中应用CASA技术，尤其是分析精子密度和活动率。我们认为精液分析的自动化是今后发展的趋势，CASA在分析精子的运动功能指标方面尤其具有优势。目前国内已有多家实验室引进了CASA技术，国产的CASA（如伟力彩色精子质量检测系统）系统也已进入临床使用。随着CASA本身系统的不断改进，其应用前景还是十分广阔的。

4.使用CASA评估精子的活力

CASA分析仪能够识别活动精子，最适宜应用于精子动力学的分析，但评估活动精子百分率是不可靠的，因为后者还需要测定不活动精子的数目，而细胞碎片可能与不活动精子相混淆。很多因素都会影响到CASA分析仪的性能，如标本的制备、帧频率、精子浓度和计数池的深度等。然而，如果操作程序得当还是可以获得可靠和可重复的结果。可参考CASA分析仪的使用指南。在使用CASA分析仪检测精子运动参数时，每份标本至少要分析200个活动精子的运动轨迹，这意味着需要检测更多的精子。如果要把精子按运动方式分类，或打算在一份标本中对结果变异性做其他分析时，至少需要200个，最好是400个活动精子的运动轨迹。每个标本中分析的精子数目应标准化。

CASA分析仪应当连接到那些能进行数据整合和统计学分析的计算机软件。很多运动参数的分布并不是正态的，因此中位数比平均数更适合各变量的集中趋势的描述，对于单个精子的测量值，在做统计分析之前可能需要进行数学转换。

使用前，应先对CASA分析仪进行正确设置和调试，以确保设备良好的工作状态。制造商提供了适宜的参数，但使用者必须检查分析仪运行是否达到了其所要求的重复性和可靠性。必须使用适当的质量控制措施。一些作者已经对一般情况下的CASA设置进行了讨论。

（1）标本的制备：

CASA分析所用精液标本的采集和处理同前所述。因为精子的运动对温度敏感，必须将CASA系统精液标本温度保持在37℃。可以用未稀释的精液检测精子运动特征和浓度。精子浓度为（2～50）×10 ⁶／ml的标本，适宜检测精子活力。精子浓度高的标本（即＞50×10 ⁶／ml）可能会出现高频度精子碰撞，由此可能产生误差。应进行稀释，并且最好使用该标本的精浆稀释。取出一定量精液样本离心（16 000g，6分钟），以获得无精子的精浆。用无精子的精浆稀释最初的精液标本，使精子浓度低于50×10 ⁶／ml。

（2）检测精子活力：

使用20μm深的一次性计数池可获得可靠的结果。这是一种具有双计数池的装置，两个计数池都应被充满样本并进行评估。必须检测几个有代表性的视野：每个计数池检测6个视野（一共12个视野）通常可以得到可靠的结果。每个计数池至少需检测200个精子。采用之前所述的质量控制原则，用于精子活力的标准化评估。标本可以直接分析也可以用视频记录。分析视频记录（如录像带、CD-ROM和DVD）更容易实现标准化和更好地实施质量保证程序。厂家通常会推荐可应用的视频记录设备类型，以及使精子头部和背景产生最大反差的最适宜照明条件。对于获得精确结果所需追踪精子的时间目前尚有争议，但是时间最少1秒应足够用于基本的CASA检测。

5.CASA用于评估精子浓度

虽然使用DNA荧光染色，CASA分析仪可以精确地测定活动精子浓度和精子活动率，但须严格遵守技术规范。例如，如果使用一次性计数池，要从计数池上不同距离的几个位置来检测，因为精子在计数池中的分布可能不均匀。结果的有效性必须要有血细胞计数板来验证。

精子浓度在（2～50）×10 ⁶／ml时，可以直接用于检测，如果标本的精子浓度高于50×10 ⁶／ml，需要进行稀释。CASA分析仪能够检测并计数有荧光的精子头部，但如果不进行显微镜下观察，就无法得知精子是否完整（即精子头是否连有精子尾）。

6.计算机辅助精子形态学计量分析

影像分析具有使精子形态学评估量化、客观性和可重复性获得重要进展的潜力。现在已有商品化的分析系统，可用来定量分析精子头部形态学、中段甚至主段的形态。然而，影响精子运动能力的尾部缺陷可以采用CASA测量精子活力和运动方式来进行更直接的评估。CASA系统一般可以把精子头部和中段分类为正常或者不正常，还可以给出头部和中段尺寸、头部椭圆率和匀称性的均数、标准差和中位数，以及对染色的精子顶体区进行测量。自动分析系统比手工操作具有更好的客观性、精确性和可重复性。自动分析系统的精确性和可重复性可小于7%，优于由熟练操作人员所做的人工评估。然而，方法学上的不一致如聚焦、照明、样本处理和染色等不同，以及正确区分精子头部和精液碎片的技术难度（尤其是精子浓度很低时），都可能会影响计算机辅助精子形态计量分析（computer-aided sperm morphometric assessment，CASMA）结果的可重复性和准确性。自动分析的属性也意味着没有办法弥补样本制备缺陷和人工假象，因此，相对于精子染色背景阴影的细小差异都可能导致不正确的分类，或者不能识别出精子，从而导致结果的偏差。

两项研究已经报道了CASMA结果与生育力评价的终点指标之间的显著相关性；研究发现自动分析的正常形态精子结果是预示体外受精率和妊娠率的有意义指标。研究发现，精液中能与卵透明带结合的、具有某种头部特征的精子百分率（Z%），和直线运动（VSL）的精子的百分率，与一大组亚生育力夫妇的自然受孕率显著相关，Z%和VSL与生育力之间的关系似乎是连续的，并且显示没有临界值，高于临界值，妊娠率也没有进一步增加。CASA应用于分析精子形态学，还需要对大样本人群的生育力结局进行更多的研究。自动分析系统可为质量控制提供数据，但其临床价值需做更多的研究。

（五）SQA精子质量分析仪

CASA系统能快速、客观地分析精子的多种参数指标，但由于价格昂贵，难以广泛使用。国外一种新型的精子质量分析仪（sperm quality analyzer，SQA），通过显示精子活力指数（sperm motility index，SMI）来反映精子的质量。

1.原理

SQA通过光电原理测定精子运动的光密度变化，并将其转化为可读数值，以精子活力指数（SMI）表示。此外，SQA还可以给出总功能精子密度、总精子密度、精子活动率及正常形态精子百分率的参数。

2.操作

用特制的毛细玻璃管吸取少许液化的精液，放入SQA特定槽内，操作机器即可读出SMI等数值。具体可按操作指南进行。SMI值可分3档：1～80为差；81～160为中等；＞160为好。SMI对评估精子质量有一定的临床实用价值。目前，已有30多个国家和地区用于实验室诊断，国内也有部分单位在使用。SQA具有快速、操作简便、价格适中等特点。

（六）彩色精子质量分析系统

1.工作原理

精子形态图像及精子运动图像被CCD摄像头采集后，经视频输出口输入到监视器和计算机图像采集卡中，计算机相应的操作软件根据设定的精子大小和灰度、精子运动的移位及前述的精子运动有关参数，对采集到的图像进行动态分析处理。分析结果打印输出，同时也可将结果储存或将精子运动状态录制到录像带上，以供日后对比分析与研究。

2.系统基本配置

（1）图像采集卡：

PCI高速彩色图像卡。

（2）计算机配置：

Intel Pentium-Ⅱ 350M，4.3G硬盘，32M内存，35cm彩色显示器。

（3）显微镜：

3通生物显微镜。

（4）摄像机：

470线彩色CCD摄像头。

（5）打印机：

通用彩色喷墨打印机。

（6）系统软件：

WLJY-9000 2.0软件包。

（7）操作系统：

Windows 95或Windows 98。

（8）监视器：

53cm彩色电视机。

（9）录像机：

通用家用型。

（10）视频分配器：

单输入4输出。

3.检测项目

（1）精子总数活动精子数曲线运动精子数摆动性WOB。

（2）精子密度活动精子密度直线速度VSL侧摆幅度ALH。

（3）精子活率活跃精子数曲线速度VCL平均移动角度MAD。

（4）畸形率活跃精子密度平均路径速度VAP鞭打频率BCF。

（5）直线运动精子活率直线运动精子数直线性LINa级精子b级精子。

（6）精子直线运动率直线运动精子密度前向性STRc级精子d级精子。

4.操作

（1）接通总电源，依次打开显微镜、监视器、录像机、打印机、计算机显示器及主机电源开关。计算机启动后自动进入精子检测系统，屏幕显示工作环境。

（2）输入被检测对象的相关信息，将液化的精液注入专用的精子计数板中，置于显微镜操作平台上。用鼠标点击“活动显示”菜单，调节好显微镜焦距，此时屏幕显示待测标本的精子运动实时图像。

（3）用鼠标点击“计算分析”菜单，根据精子密度的实际情况选择“计算参数选择”对话框中“中低密度”项或“高密度”项。将灰度和域值大小调整到可将精子全部采集而不采集卵磷脂小体等非精子微小颗粒的环境，开始计算分析。系统进入自动计算分析状态，图像显示区内给出活动的精子分割图像。在此图像上可清楚地看到计算分析过程中哪些精子被分割出来，以及各个精子的运动状况。其中活动精子的实际运动轨迹显示蓝色曲线，平均路径轨迹显示红色曲线。

（4）计算分析结束后可根据需要打印出“精液分析检测报告”（表13-6）、“精子速度分布图”（图13-6）和“精子运动轨迹图”（图13-7），同时也可将分析结果存盘保存。

表13-6　精液分析检测报告

图13-6　精子速度分布图

图13-7　精子运动轨迹图

目前WLJY-9000伟力彩色精子质量分析系统已应用于男科临床与科研，取得了良好的效果，完全可取代进口同类产品，为我国精液分析的科学化、规范化和标准化创造了条件。

第二节　精液的细胞学检查

一、精子顶体染色及精子形态学检查

精子顶体内富含蛋白水解酶（顶体酶），在精子进入卵子透明带过程中，顶体酶起主要作用。顶体酶也能降低宫颈黏液的黏度，提高精子穿透宫颈黏液的能力。精子顶体缺陷与男子不育有密切关系。

（一）精子顶体染色

1.试剂

精子顶体染色所需试剂为：①瑞氏染液：称取瑞氏染料0.1g，放在清洁干燥的乳钵内，加少量甲醇，边加边磨使染料溶解。将已溶解的染料倒入棕色瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解。加甲醇至60ml，置室温1周即可使用。②吉姆萨染液：称取吉姆萨染料0.5g，置于33ml甘油中，60℃水浴2小时，使其溶解，再加入60℃预热的甲醇33ml，混合后置棕色瓶中，室温放置数日后方能使用。

2.操作

取液化精液推片，95%乙醇固定10分钟，自然干燥，用瑞-吉氏（10∶1）混合液加等量pH 6.9磷酸盐缓冲液，染色10分钟，自来水冲洗，再把染片置于95%乙醇中浸2～5秒，脱掉片膜上的浮色，待自然干燥后，用光学树脂封片，置于油镜下镜检。计数200条精子，200个生精细胞分别进行精子顶体完整率、精子细胞形态分类。

3.结果

精子顶体完整率根据顶体的外形和损伤情况，将精子顶体分为4种类型，并计算顶体完整率。

Ⅰ型：顶体完整，精子外形正常，着色均匀，顶体边缘整齐，有时可见清晰的赤道板。Ⅱ型：顶体轻微膨胀，精子质膜（顶体膜）疏松膨大。Ⅲ型：顶体破坏，精子质膜严重膨胀受损，着色浅，边缘不整齐。Ⅳ型：顶体全部脱落，精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型均为顶体不完整。

顶体完整率（%）的计算：

50例生育男子检查结果，精子顶体完整率为（90.5±6.1）%；242例不育男子为（84.8±11.3）%。

精子顶体内富含蛋白水解酶（顶体酶），在精子进入卵子透明带过程中，顶体酶起主要作用。顶体酶也能降低宫颈黏液的黏度，提高精子穿过宫颈黏液的能力。精子顶体缺陷与男子不育有密切关系。

（二）精子细胞形态学检查

精子细胞形态学检查是为了了解正常精子和生理及病理范围内变异精子所占的比例，是反映男子生育能力的一项重要指标。

精子包括头、颈、中段、主段和末段。由于通过光学显微镜很难观察到精子末段，因此可以认为精子是由头（和颈）和尾（中段和主段）组成。只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。所有处于临界形态的精子应该认为是异常。

精子头外形上大体上呈椭圆形，光滑并且轮廓规则。顶体区可清晰分辨，占头部的40%～70%。顶体区没有大空泡，并且不超过2个小空泡，空泡大小不超过头部的20%。顶体后区不含任何空泡。中段应该细长、规则，大约与头部长度相等。中段主轴应与头部长轴成一条直线。残留胞质只有在过量时才被认为是异常的，即胞质超过了精子头大小的1／3时被认为过量残留胞质。主段应该比中段细，均一，其长约45μm（约为头部长度的10倍），尾部应没有显示鞭毛折断的锐利折角，主段可以自身卷曲成环状，使用此标准，精子头部形状比大小更为重要，除非存在严重缺陷。可借助目镜测微尺来区分精子头部大小正常或异常。使用计算机系统测量77个经巴氏染色的精子的头部尺寸（重复测量的差异变异系数为2%～7%），得到以下数据：长度的中位数为4.1μm，95%可信限区间为3.7～4.7；宽度的中位数为2.8μm，95%可信限区间为2.5～3.2；长宽比的中位数为1.5，95%可信限区间为1.3～1.8。

由于人类精子形态的多样性，造成精子形态评估困难。但是，通过观察从女性生殖道，特别是性交后宫颈黏液回收的精子，或者从卵子透明带表面回收的精子，有助于定义具备潜在受精能力精子的外观（形态学正常）。在严格使用精子形态学某些标准的情况下，已经证实正常形态精子百分率与不同的生育力评价的终点指标［妊娠等待时间（time-topregnancy，TTP），体内与体外妊娠率（pregnancy rates in vivo and in vitro）］存在联系，这可能对判断生育力的预后有意义。

这里所描述分类方法的基本依据，是通过鉴定源自宫颈黏液具有潜在受精能力的亚群精子来定义正常形态精子，这是有局限性的。应用这些标准，有生育力和不育的正常形态精子百分率的范围大致为0～30%，很少有精液标本的正常形态精子百分率超过25%。这个低值不可避免产生一个低的临界值。试管婴儿、宫腔内人工授精及自然受孕的研究中确实发现，正常形态精子的参考限或临界值仅为3%～5%。

人类卵子透明带也能筛选出一类形态相似的精子亚群，但这种“卵透明带优选”的精子也有较大的形态范围。展示“卵透明带优选”形态的父亲精液中的活动精子百分率也低，约8%～25%。

在正常精液中形态正常的精子平均占80%，也可见到一定比例的畸形精子（表13-7），人类精液标本中含有各种各样畸形的精子。头部缺陷：大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、不定形头、有空泡的头（超过2个空泡，或者未染色的空泡区域占头部的20%以上）、顶体后区有空泡、顶体区过小或过大（小于头部的40%，或大于头部的70%）、双头，或上述缺陷的任何组合。颈部和中段的缺陷：中段非对称地接在头部、粗的或不规则、锐角弯曲、异常细的中段，或上述缺陷的任何组合。主段缺陷：短尾、多尾、断尾、发卡形平滑弯曲、锐角弯曲、宽度不规则、卷曲，或上述缺陷的任何组合。过量残留胞质（ERC）：这是精子异常发生过程产生的异常精子所伴有的。这类异常精子的特征是含有大量不规则已染色的细胞质，胞质的大小超过精子头部的三分之一，通常同时有中段缺陷。这种异常的过量胞质不应该被认为是胞质小滴。

在行精子形态学检查时，一旦精液涂片在空气中干燥后，应立即固定并染色，以突出精子细节。推荐使用的染色方法有巴氏染色法、Shorr染色法或Diff-Quik染色法。用上述三种染色方法，在光学显微镜亮视野下观察，精子头部的顶体区染成淡蓝色，顶体后区染成深蓝色，中段可能染成略呈红色，尾部染成蓝色或淡红色。通常位于头部下部或围绕中段的过量残留胞质染成粉红色、红色（巴氏染色）或者橘红色（Shorr染色）。

WHO 2010年版未规定精子形态的正常值。

表13-7　精子细胞学检查正常标准（WHO资料，1994）

二、精液中非精子细胞检查

人精液中非精子细胞可分为三大类：①未成熟生精细胞（IG），包括精原细胞（GN）、初级精母细胞（PS）、次级精母细胞（SS）、早期和晚期精子细胞（Sab和Scd）、无核胞质体（CM）；②白细胞（WBC），包括巨噬细胞（MФ）、多形核细胞（PMN）、淋巴细胞（LC）及其亚群CD3、CD4、CD8等抗原阳性细胞；③支持细胞（Sert）、脱落上皮细胞（EC）等其他细胞。睾丸是精子形态成熟的器官。精液中精子及生精细胞的形态学检查，是评价男子生育能力的重要指标。由于疾病、高温、药物等原因可以出现睾丸生精停滞。所谓生精停滞是生精细胞分化成精子的复杂过程中断，而出现少精（部分停滞）或无精子（完全停滞）的症状，精液中可见各级不成熟生精细胞。

（一）精液中非精子细胞判断标准

1.精原细胞

人和灵长类动物的精原细胞分为3种类型（Ad、Ap、B型），其中Ad型精原细胞可能是精子发生的干细胞。Ad、Ap型精原细胞一般不易离开基膜脱落，精液中见到的常是B型精原细胞。B型精原细胞是对放射线最敏感的细胞。细胞呈圆形，核居中央且较大，染色质呈疏松的细粒状，胞质较少，着不透明蓝色（图13-8）。

2.初级精母细胞

这一类型的生精停滞常出现在第1次减数分裂前期的末尾。精液中可见到偶线期的联会（同源染色体配对）或晚粗线期的去联会（配对的同源染色体片段提前分离）细胞形态。细胞体积较大，直径15～24μm（图13-9）。

3.次级精母细胞

由初级精母细胞增殖分化而来。体积一般较初级精母细胞小，有单核及双核两种类型，双核形的细胞与蜻蜓的头眼相似。胞核染紫红色（图13-10）。

图13-8　精原细胞1000×

图13-9　初级精母细胞（粗线期）1000×

图13-10　次级精母细胞1000×

4.精子细胞

由次级精母细胞发育成熟而来。精子细胞变态成精子的过程包括8个不同阶段。形态多样、核较小，着色较深，常呈球形或精子头的雏形（图13-11，图13-12）。

5.支持细胞

又称Sertoli细胞。成年男子睾丸支持细胞是不分裂的，其数量增加只在出生前和出生后早期进行。支持细胞外形不规则，常呈圆形或菱形，染色质呈细网状，有1～2个明显的核仁，胞质丰富，有时可见较多空泡（图13-13）。

图13-11　精子细胞（精子头雏形）1000×

图13-12　精子细胞1000×

图13-13　支持细胞1000×

6.生殖道上皮细胞

在正常男子精液中偶尔可见到呈柱状或立方形、圆形以及多边形的前列腺上皮细胞。圆形或卵圆形嗜碱性，胞质含色素颗粒的精囊细胞。呈多边形的尿道移行上皮细胞，见前尿道脱落的柱状或鳞状上皮细胞。慢性前列腺炎可见多核上皮细胞（图13-14～图13-16）。

图13-14　前列腺上皮细胞1000×

图13-15　胞浆含色素颗粒的精囊腺细胞1000×

图13-16　生殖道上皮细胞1000×

7.外周血液细胞

当生殖道感染，如精囊腺炎、附睾炎、淋病等疾病时精液中可见到红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核／巨噬细胞（图13-17～图13-21）。

图13-17　精液中的单核细胞1000×

图13-18　精液中的吞噬细胞1000×

图13-19　T淋巴细胞1000×

精液中不仅可以检查出正常生精细胞（生理性幼稚细胞），也可检出异常生精细胞即病理性幼稚细胞（图13-22）。①胞质破损：胞体变形胀大或缩小，甚至破碎，形态多样、异常，胞质内空泡不一，深浅不一，常见有深紫色大小不一的颗粒。有时核裸露，偶见精子穿入生精细胞的胞质内。②胞核变性：胞核变性是异常生精细胞的主要特征。由于胞核受损、分化不良，染深紫色，可见到核固缩、溶解、核断裂等形态特征。核固缩，常使核变小，变致密，均匀染色。核溶解，常呈胞核膨胀、疏松，染色质模糊，着色较浅，或核膜破碎，轮廓不清。核断裂，可见胞核断裂或几个核碎片，呈断裂状态，可明显看出着色深浅分明的断裂纹。

图13-20　精液中的浆细胞1000×

图13-21　精液中的中性粒细胞1000×

图13-22　病理性的次级精母细胞1000×

正常参考值：生育男子的平均值：精原细胞为0.8%；初级精母与次级精母细胞分别为8.0%和7.0%；精子细胞为7.0%。

（二）生精细胞的异常

1.存在异常

无论生育与不育男子的精液中均存在精子和／或生精细胞，若精液中找不到精子及其他有形成分，即为生精细胞存在异常。其临床表现为无精子症。这是由于睾丸生精小管的基膜发生障碍，导致无精子症，属于原发性睾丸生精障碍，治疗上比较困难。

2.形态异常

精液中各级生精细胞均可见到形态异常，尤以胞膜、胞质异常最为明显。

3.比例异常

指精液中存在的四种生精细胞的比例异常，其中一种或一种以上生精细胞的比例超出生育男子的比例范围。最常见的是精母细胞成熟发生障碍，尤以初级精母细胞的比例增加；其次是精原细胞比例增加，精子细胞的比例降低和精子生成减少。

（三）操作

同精子顶体染色及精子形态学检查。

三、精液中白细胞检查

精液常规检查白细胞是用新鲜精液直接镜检，判定结果。这种判定方法往往把精液中非精子细胞误认为白细胞。黄宇烽曾对50名男子的精液同时进行直接涂片和染色后镜检比较，结果直接镜检96%（48／50）检出白细胞，而染色后镜检，发现白细胞只有16%（8／50）。由于染色后镜检能准确地识别白细胞，因此精液中白细胞必须用染色法加以鉴别。

（一）联苯胺法

1.试剂

联苯胺法所需试剂为：①将125mg联苯胺溶于50ml 95%的甲醇中；②将150mg玫瑰红B溶于50ml蒸馏水中。

上述两液混合。取1ml混合液，再加H ₂O ₂2滴（以0.3%浓度为好），即为联苯胺染液。

2.操作

取新鲜精液1滴于载玻片上，加入1滴联苯胺染液，混匀，置盖玻片后，于37℃放置20分钟，镜检。白细胞被染成褐色，其他细胞被染成品红色。

（二）正甲苯胺蓝过氧化物酶染色法

1.试剂

正甲苯胺蓝过氧化物酶染色法所需试剂为：①饱和NH ₄Cl溶液（250g／L）；②5%（50ml／L）Na ₂EDTA的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）；③正甲苯胺蓝（致癌物）0.025% （0.25ml／L）；④ 30%H ₂O ₂（300ml／L）蒸馏水配制。

试剂1 ∶1ml；

试剂2 ∶1ml；

试剂3∶9ml；

试剂4∶1滴。

混合，即为工作液。配制后可用24小时。

2.操作

操作方法为：①0.1ml精液加入上述工作液至1ml，混合，振摇2分钟；室温放置20～30分钟，再振摇；②镜检：过氧化物酶阳性细胞染成棕色，过氧化物酶阴性细胞不着色。

（三）邻甲苯胺过氧化物酶染色法（WHO 2010版推荐方法）

1.试剂

邻甲苯胺过氧化物酶染色法所需试剂为：①67mmol／L，pH值为6.0的磷酸盐缓冲液：将9.47g磷酸氢二钠（Na ₂HPO ₄）溶于1000ml纯水中，将9.08g磷酸二氢钾（KH ₂PO ₄）溶于另一1000ml纯水中。然后将一种溶液加入到另一种溶液中直至pH值为6.0（约12ml的Na ₂HPO溶液加入到88ml的KH ₂PO ₄溶液中）；②饱和氯化铵（NH ₄Cl）溶液：将250g NH ₄Cl加入到1000ml的纯水中；③148mmol／L的乙二胺四乙酸二钠（Na ₂EDTA）溶液：将50g／L Na ₂EDTA溶入步骤1准备好的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中；④底物：将2.5mg邻甲苯胺溶于10ml的0.9%（9g／L）生理盐水中；⑤30%（v／v）过氧化氢（H ₂O ₂）溶液：购买成品；⑥工作液：往9ml邻甲苯胺底物中加入1ml饱和NH ₄Cl溶液、1ml 148mmol／L Na ₂EDTA溶液及10μl 30%（v／v）H ₂O ₂溶液，充分混匀。该溶液配制后可使用24小时。

2.操作

操作方法为：①充分混匀精液样本；②取0.1ml精液并与0.9ml工作液混合［1+9（1∶10）稀释］；③涡旋振荡精子悬液10秒钟，并在室温下放置20～30分钟。或者使用试管摇动装置持续摇动。④重复样本与工作液混匀。取样前，再次混匀精液标本；⑤镜检：过氧化物酶阳性细胞染成棕色，过氧化物酶阴性细胞不着色。

（四）瑞-吉混合染色法

试剂及操作同精液中非精子细胞检查。

（五）CD45单克隆抗体法

1.试剂

CD45单克隆抗体法所需试剂为：①三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲生理盐水（TBS）：Tris 6.06g，NaCl 8.52g加蒸馏水900ml，用1mol／L HCl调整pH至8.6，加水至1000ml。②抗人全白细胞单克隆抗体（α-CD45）：购自军事医学科学院生物制剂发展中心，批号951205。③碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）桥联酶标试剂盒：产地与批号同上。

2.操作

操作方法为：①标本处理及制片取液化精液0.5ml，用pH 7.4 PBS洗2次，校精子密度50×10 ⁶／ml，取此混悬液5μl，1式2份于干净玻片上涂片，空气中干燥，丙酮固定10分钟，Tris缓冲盐水洗2次，晾干备用。②免疫组织化学染色取涂有精子细胞的玻片，加鼠抗人白细胞抗体（α-CD45）20μl，置37℃湿盒孵育30分钟，TBS洗3次；加20μl羊抗鼠IgG，置37℃湿盒30分钟，TBS洗3次；加APAAP复合物，置37℃湿盒30分钟，同上洗涤；加20μl碱性磷酸酶底物溶液，37℃湿盒显色15～30分钟。先置低倍镜下观察，待见到细胞膜上出现明显红色标记时，用TBS洗玻片，终止显色加复染液（苏木素）1滴，复染1分钟，自来水冲洗，光镜下观察结果。

结果判断：细胞表面呈红色、细胞核呈蓝色为阳性，细胞表面不着色为阴性。

（六）CD4、CD8单克隆抗体染色法

1.试剂

CD4、CD8单克隆抗体染色法所需试剂为：①鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体、羊抗鼠-FITC为军事医学科学院生物试剂发展中心提供。②碘化丙啶（propidium iodide，PI）分析纯，上海化学试剂采购供应站进口分装。③pH 7.4，0.01mol／L磷酸盐缓冲液（PBS）。

NaCl 8.5g，Na ₂HPO ₄· 12H ₂O 2.9g，KH ₂PO ₄ 0.2g，KCl 0.2g加蒸馏水至1000ml。

2.操作

操作方法为：①标本处理及制片新鲜液化精液，用pH 7.4的0.01mol／L PBS洗3次，校精子密度5×10 ⁷／ml，在载玻片上画圈部分涂片，电吹风冷风吹干，甲醇固定3分钟。②荧光染色在精子涂片上，分别加鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体1滴，切勿相互污染，放置37℃湿盒30分钟，用自来水冲洗后，再用pH 7.4 0.01mol／L PBS洗3次，每次3分钟，电吹风冷风吹干，分别加羊抗鼠FITC（PBS 1∶20稀释）放置湿盒40分钟，自来水冲洗5分钟，用PBS浸洗3次，每次3分钟，电吹风冷风吹干。再滴加碘化丙啶（PI）液10μl，盖上盖玻片，在荧光显微镜下镜检（×100）。

3.结果判断

精子及生精细胞不染荧光，T淋巴细胞胞膜染草绿色荧光。

四、精液中凋亡细胞检查

细胞凋亡（apoptosis）一词最早由澳大利亚病理学家John Kerr于1972年提出，是近年来研究较多的细胞死亡方式，它是由基因控制的细胞自我消亡的过程，其最突出的特点是染色质的有控降解。精子发生是精原细胞经复杂的神经-体液调节，不断增殖分化演变为成熟精子的过程，其调节机制非常复杂。近来对一系列动物模型的研究表明，凋亡在精子发生的生理、病理过程中充当了重要的角色，它可能是人体清除剩余或缺陷生精细胞的正常的生理机制，也可能是引起不育的病理环节，利用对生殖系细胞凋亡的毒理学控制有可能研究与开发新的男子避孕药物，同样也可从凋亡的角度研究现有避孕药物的作用机制。引起男子不育的理化因素很多，这些因素是否诱导凋亡，其攻击位置是哪一阶段的细胞等问题也将有待于进一步研究。检测生殖系细胞的凋亡对于不育的临床诊疗及生殖系肿瘤的治疗与预后可能具有重要意义。

凋亡最初的检测手段主要是形态学上的鉴别，凋亡细胞具有特征性的核周染色质月牙形的固缩、胞质膜起泡、细胞器缩聚、凋亡小体形成等。为了区别凋亡与坏死，后来又逐渐在形态学检测的基础上辅之以检测细胞膜的通透性的变化，诸如放射性核素标记蛋白质、核酸的释放，LDH的释放，染料进入等方法；应用最多的方法是DNA琼脂糖凝胶电泳法，检测凋亡细胞断裂的寡或少核苷酸片段呈现的“梯”状结构。20世纪90年代以来，流式细胞仪被应用于凋亡的检测，随着凋亡细胞的缩小，DNA相应减少，荧光散射也相应下降，并出现一个亚G1峰，越来越多的研究采用该方法，并逐渐由定性向定量发展。

两种原位检测手段也得到广泛应用，即DNA切口标记法和DNA切口末端标记法（TUNEL），两者的建立都有赖于凋亡细胞中DNA裂解片段的出现，前者是用DNA聚合酶，而后者应用末端转移酶将生物合成的核苷酸序列连接到DNA链的断裂处，标记的DNA通过免疫组织化学的方法转为可视。值得一提的是，DNA链断裂也可能发生于坏死和自溶的过程中，综合检测以避免假阳性结果是必要的。下面就常规瑞-吉染色和TUNEL法分析精浆脱落生精细胞的凋亡作简要介绍。

（一）常规检测方法

1.瑞-吉染色

（1）原理：

瑞氏染粉（伊红亚甲蓝）是由伊红和亚甲蓝混合组成的中性盐染料，其中伊红是酸性染料，有色部分为阴离子（E ^-），亚甲蓝是碱性染料，有色基团为阳离子（M ⁺）。这两种有色离子可以与细胞蛋白质选择性的吸附进而使细胞呈现不同的着色，其中胞质中的碱性蛋白与伊红结合称嗜酸物质，胞核的核蛋白和原始细胞胞质等酸性蛋白质与亚甲蓝结合呈紫红色，称嗜碱物质。吉姆萨染料由天青、伊红组成，其染色原理和瑞氏染色基本相同。吉姆萨染色法对细胞核着色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则染色较差，两者混合染色可兼二者之长。

（2）试剂：

①瑞氏染液；②吉姆萨染液；③磷酸盐缓冲液（pH 6.4～6.8），磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g，蒸馏水加至1000ml。

（3）步骤：

①检测对象用手淫法留取全份精液于清洁容器中，37℃恒温水浴30分钟，待精液液化后，1500r／min离心5分钟后弃去精浆，沉淀用生理盐水洗涤3次，离心涂片，晾干；用95%乙醇固定10分钟。②瑞-吉姆萨染液临用前依9∶1的比例新鲜配制。③将固定的涂片用瑞-吉姆萨染液染色30～60秒，加等量磷酸盐缓冲液，染色10分钟。④镜检计数凋亡的生精细胞，依据以下标准判别：细胞核染色质固缩，在核周聚集，呈境界分明的新月形或块状小体，胞膜皱褶或起泡（blebbing），出现界限分明的含或不含核物质的凋亡小体。依据文献所描述的特征区分生精细胞（图13-23）。观察全片，计数凋亡的精母细胞（包括初级精母细胞与次级精母细胞）、精子细胞并计算其占同类细胞的百分比。

图13-23　凋亡的生精细胞

2.TUNEL法

（1）原理：

DNA裂解为许多单或寡核苷酸片段是细胞凋亡的主要生化标志之一，这些离断的DNA序列可以通过末端核苷酸转移酶在其3′-OH末端结合上标记有荧光素的dUTP，然后通过荧光显微镜直接观察，或用标记有辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体与其二次结合后和底物进行显色反应，用普通显微镜进行镜检（图13-24）。

图13-24　原位末端标记（TUNEL）原理示意图

（2）试剂：

CAT.No.1684817。

（3）步骤：

①检测对象用手淫法留取全份精液于清洁容器中，37℃恒温水浴30分钟，待精液液化后，1500r／min离心5分钟后弃去精浆，沉淀用生理盐水洗涤3次，离心涂片，晾干，用95%乙醇固定10分钟；②将固定的涂片用3%H ₂O ₂甲醇溶液封闭30分钟；③用TritonX-100通透细胞；④TUNEL混合液温孵60分钟；⑤POD转换液温孵30分钟；⑥加DAB底物显色；⑦镜检计数细胞凋亡率：观察全片，细胞呈现棕黄色为凋亡细胞，计数凋亡的精母细胞（包括初级精母细胞与次级精母细胞）及精子细胞，计算其占同类细胞的百分比。

3.结果分析

20例正常生育男子检测结果如下：

瑞-吉法精母细胞凋亡率

± s）（%）：1.4±0.9。

精子细胞凋亡率

± s）（%）：1.7±0.8。

TUNEL法精母细胞凋亡率（

± s）（%）：4.3±1.8。

精子细胞凋亡率

± s）（%）：4.3±2.6。

引起细胞凋亡的原因很多，细胞生存与繁殖的必要信号的缺乏可引起细胞自杀，如生长因子的缺乏等。Shetty等用抗FSH血清免疫中和鼠的FSH，检测不同阶段细胞凋亡特征性的DNA片段表明，粗线期精母细胞对缺乏FSH最为敏感，精原细胞和精子细胞也出现不同程度的细胞凋亡，免疫中和LH则发现凋亡只出现于粗线期精母细胞和精子细胞，而精原细胞不出现凋亡；利用GnRH拮抗剂处理成年雄性小鼠，发现细线前期、粗线期的精母细胞和精子细胞出现凋亡特征的形态学指标。以上文献从不同的角度说明了凋亡在抑制精子发生的过程中充当了重要的角色，同时也用凋亡作为一个指标来说明各种激素在精子发生过程中是如何发挥作用的。Kenth等通过杀伤成年小鼠Leydig细胞使精浆睾酮和睾丸内睾酮下降到不可测的水平，生精细胞凋亡几乎涉及精子发生的各个阶段，而对处理组采用睾酮进行治疗后凋亡显著受到抑制，说明睾酮作为Leydig细胞的旁分泌产物，对于精子发生具有重要的作用。用超生理剂量的十一酸睾酮（TU）抑制了促性腺激素（GnT）的分泌，降低睾丸内睾酮的浓度，引起生精细胞的凋亡，使生精过程受阻于中晚期，即减数分裂和精子形成阶段，从而达到了抑制精子发生的效果。

黄宇烽等以生精细胞凋亡作为指标，探讨超生理剂量十一酸睾酮抑制精子发生的机制。对正常生育史男子肌内注射TU，应用瑞-吉染色和TUNEL法对其精液脱落细胞进行凋亡细胞动态检测。结果显示用药后精子密度和生精细胞数较用药前显著下降（ P＜0.01），精母细胞凋亡率和精子细胞凋亡率则显著上升（ P＜0.01）。表明TU具有显著的抑制精子发生效应，其作用机制是通过抑制促性腺激素而导致睾丸内T浓度降低，继之精子发生停滞，该过程可能是通过生精细胞凋亡完成的。

（二）试剂盒检测

利用Annexin V-FITC／PI试剂盒检测精子细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸进而检测精子凋亡

1.试剂

试剂盒组分：①结合缓冲液，稀释后溶液中各组分浓度：10mMol Hepes／NaOH，pH 7.4，140mMol NaCl，2.5mMol CaCl ₂；②碘化丙啶溶液浓度：20μg／ml；③重组人Annexin V-FITC／PI。

2.步骤

①用4℃预冷的洗细胞两次，用250μl结合缓冲液（10mMol Hepes／NaOH，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mMol CaCl ₂）重新悬浮细胞，并使其浓度为1×10 ⁶／ml；②取的细胞悬液于流式管中，加入5μl Annexin V-FITC／PI和10μl 20μg／ml的碘化丙啶溶液；③混匀后于室温避光孵育15分钟；④在反应管中加400μl PBS，流式细胞仪分析。

3.结果分析

所有标记精子的荧光信号都通过流式细胞仪进行检测。每次检测至少检测10 000个精子，要求流速＜100细胞／秒，阳性细胞比率和平均荧光强度采用CellQuset软件进行分析。

五、流式细胞术在精子及生精细胞检查中的应用

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是20世纪70年代发展起来的一种可快速定量单细胞分析的高科技技术，它能在复杂的细胞群体中，一个一个地测定每个细胞大小、胞内颗粒的多少、DNA及RNA含量、细胞表面标志、细胞膜上及胞内受体、细胞蛋白质及酶的质和量等多种参数。它集激光技术、计算机技术、半导体技术、统计学意义明显及能对细胞亚群分类收集等特点。

流动相分析单个细胞的雏形是1930年，由Moldavan首先用毛细管置于显微镜视野中使细胞在管内流动，由光敏感受器接收信号而报道的。1965年，Kamentsky采用分光光度计开始测定细胞中核酸的含量和细胞的大小，第一次记录并分析了多参数流式细胞测量数据。1967年，Van Dilla引进Crossland-Taylor以氢激光为光源开发了高速染色细胞的流式细胞仪，成为目前流式细胞术的基础。1974年，Arndt-Jovin用电子计算机控制仪对细胞的分析分离过程，实现了自动化、快速化，促进了流式细胞仪的商品化。近几十年来，随着新的荧光物质不断发现及计算机功能在数据存储、显示分析等系统日趋完善，流式细胞术已广泛使用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、遗传学、病理学及临床检验等各领域。

流式细胞术的原理是让待测的已染了色的细胞在特制的样品管里稳定地流动，细胞一个个依次经过50～100μm的小孔，恒速通过激光束的焦斑区时产生电信号，这些信号代表荧光、光散射、光吸收或细胞的阻抗等，这些信号被摄取处理，于是细胞的一系列特性就被快速地、大量地测定。还可根据有关的参数把指定的细胞亚群从整个细胞体中分选出来。

（一）基本结构

流式细胞仪的基本结构如图13-25所示，由四大部分组成，即光源、气控单细胞层流系统、光电检测及计算机处理系统、细胞分类纯化和自动克隆系统。

1.光源

采用氩激光或氪激光，因其提供了极高的光强、稳定度和窄的光谱带。激光的发散角小，能聚集到等于细胞大小的限度内。

2.气控单细胞层流系统

由压力氮气瓶、鞘液瓶、滤器、样品室、硅化管、流室、喷嘴、吸废瓶、真空泵及多个可调气体控制阀等构成。在氮气压力下，细胞悬液经喷嘴时形成鞘液包裹细胞悬液的层流。调节压力可控制检测细胞的速度，细胞层流垂直而下，与激光束交会，产生散射光和荧光。

图13-25　流式细胞仪基本结构

3.光检测及计算机信息处理系统

由中子吸收板（吸收激光，允许散射光通过）、滤光系（阻止或允许一定波长的光通过）、光电倍增管、电子计算机、图像显示屏等组成。光电倍增管感受前向散射光（forward and light scatter，FLS）、90°散射光（ninety degree light scatter 90°LS）、绿荧光（green fluorescent light，GF）和红荧光（red fluorescent light，RFL）而形成参数，从光电倍增管输出的脉冲积分脉冲经计算机处理转换成图像，并计算出绝对值或相对率，也能大容量将信息贮入磁盘。

4.细胞分类纯化和自动克隆系统

由高频压电晶体、静电偏转板、收集器、细胞恒温装置、自动克隆装置等构成。可将细胞分选和自动克隆。

（二）工作原理

首先，待测细胞被制成单个细胞的悬液，以保证细胞一个个地通过受检。

然后，荧光染料使细胞着染，核酸染料（吖啶橙、溴化乙啶、溴化丙啶、普卡霉素、Hoechst33258等）可直接与DNA和／或RNA结合，结合量与DNA、RNA含量成正比；标有异硫氰酸荧光黄或藻红素的单克隆抗体（如OK7）与相应的细胞亚群结合，使该亚群细胞着染；标有荧光素的配体或与细胞受体产生等当量结合反应。

单细胞悬液，在高压氮气的驱使下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱，液柱与入射的激光束垂直相交，产生两种效应：①散射效应，包括前向角散射（反映细胞的直径）和90°散射（反映细胞表面状况和胞内颗粒的质和量）；②荧光辐射效应：不同类型的细胞由于结合荧光染料的质和量不同，发出波长不同。散射光和荧光的不同成了鉴别不同类型细胞的根据。

根据FLS，90°LS两个参数，可将细胞初步分群，若再作荧光染色处理，则可在物理参量相似的细胞群中，再进一步区别细胞亚群（亚型）。例如在增生活跃的肿瘤细胞群体中，处于不同增殖期的瘤细胞的核酸含量不同，对核酸染料的着染也就不同，由此显示的DNA含量的多少，可计算出G0、G1期（二倍体），S期（超二倍体），G2、M期（四倍体）或其他高倍体的肿瘤细胞的比例，从而了解该细胞群体DNA倍体和细胞动力学状况。

（三）样品制备及保存

FCM的实验对象是单个细胞悬液，故睾丸组织必须分散为单个细胞，精液单层细胞也要分散为单个细胞。下面介绍其样品的制备：

（1）培养细胞分散为单个细胞：

①将培养细胞中的培养液倒掉；②加入少量0.25%胰酶涮洗后倒掉；③加入1～2ml 0.25%胰酶，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，若无倒置显微镜，可直接观察培养瓶，静置消化2～3分钟，待细胞逐渐变白，停止胰酶作用，弃去胰酶，应注意胰酶消化时间与消化温度、细胞类型及细胞生长情况有关；④加入3～4ml无Ca ²⁺、Mg ²⁺的PBS液（磷酸盐缓冲生理盐水），用吸管反复操作，使之成为单个细胞悬液，移入离心管中；⑤离心，弃去上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散；⑥用细滴管或注射器将细胞迅速注入4℃冷乙醇中（乙醇浓度为70%），然后保存于4℃冰箱中。

（2）实体组织分散为单个细胞：

具体方法见文献，主要步骤如下（酶消化法）：

将细胞悬液充分混匀，吸取0.2ml，加入5ml冰冷的含0.1%Triton，0.3mol／L NaCl的0.01mol／L甘氨酸氢氧化钠缓冲液（pH 10.0）。然后依次加入200μg／ml的溴化乙啶（EB）染液（BDH）0.1ml及10mg／ml RNA酶Tris液0.2ml。混匀置于暗处4℃10分钟，再置于室温下5～10分钟，取一滴在荧光显微镜下检查，若细胞核呈明亮的橙红色荧光，即可上机分析。

样品的长期保存方法：①首先配制枸橼酸盐缓冲液，其配制方法：将85.5g（250mmol／L）蔗糖，11.76g（40mmol／L）枸橼酸钠（trisodium citrate 2H ₂O）溶于800ml蒸馏水中，再加入50ml二甲亚砜（DMSO），加蒸馏水总体积达到1000ml，将pH调整到7.6。②被保存的样品如果是单个细胞或者是实体组织针吸样品，将约10 ⁶细胞悬浮于400μl枸橼酸盐缓冲液中，然后置于聚丙烯管中，立即将此管浸入-80℃干冰和99%乙醇的混合物中，然后移到-80℃的冰箱中保存。③被保存的样品如果是实体组织，可直接把样品置入干燥的聚丙烯管中，快速冷冻（方法同上）。④样品分析前，将冷冻的样品块快速放入37℃的水浴中融化，以小块实体组织存贮的样品，融化后再重悬于枸橼酸盐缓冲液中，然后可进行常规的DNA染色和FCM分析。这种方法可保存样品达1年之久，其DNA直方图分析也不发生变化。因此，能进行大量的对比实验。

（四）数据的获取及分析

1.数据的显示方法

①单参数显示即单参数直方图，是一维数据图用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分析，直方图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号的强度的相对值，其单位用“道数”（channels）表示，“道”即多道脉冲分析中的道，亦可看成相对荧光的单位，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，直方图的纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。单参数显示的典型例子就是图13-26所示的DNA增殖曲线。②双参数显示双参数显示有多种：散点法、透视法和轮廓法等。

图13-26　非同步群体的DNA分布曲线（1∶G0；2∶G2+M）

散点法是双参数显示的最简单方法，X轴代表一个参数，Y轴代表另一个参数，以点的出现频率代表细胞数（图13-27），从点的分布密度可区分细胞群体。

透视法是很直观的二参数显示法，两个参数组成一个平面的两根轴，细胞数为到达这个平面的距离，整个分布表现为三维立体图形，有山峰山谷，其方法是每一对X、Y坐标的细胞数以一个距平面一定高度的点子来表示，凸起的程度表示细胞数多少，透视法立体感强、直观，被广泛应用，计算机软件可使整个透视图旋转，以利于从不同角度观察分布。

轮廓法就是等高线图，在二参数为坐标轴的平面上，根据实验者要求（细胞数等），找出相应于此等级的点连成线，这些线即为等高线（图13-28）。

图13-27　散状点显示的双参数频率分布图

图13-28　轮廓法显示双参数分布图

此外，还有三参数的四维显示法，在精子（精液）的FCM数据显示中少用，此不加详述。

2.数据分析

在来自流式细胞计的实验数据已被接收、存储、显示的基础上，接下来的任务就是如何进行处理分析数据，即是根据分布图区别细胞群体或亚群，以此得出相应的细胞特性和动力学参数。

对于二维以上的参数能很好反映各个细胞群体或细胞亚群的特性，从其分布图上往往易于区分，所以一般二维以上参数分布图不需要特别处理。对于单参数（如DNA含量）的频率分布直方图，就需分析。

图13-29为正常睾丸组织FCM细胞分布直方图。直方图显示，正常睾丸组织主要由三类细胞群组成，就其DNA含量排列在相应的峰道数内，故可见如下三个峰：第一个峰为IC峰，（单倍体量DNA的细胞群），包括精子细胞和精子，第2个峰为2C峰（二倍体量DNA的细胞群），包括G0期精原细胞、次精母细胞、支持细胞和间质细胞等，第3个峰为4C峰（四倍体量DNA的细胞群），包括细线期、粗线期、双线期的初级精母细胞和G2期的精原细胞及非生殖细胞等。如果要计算各部分所占的百分比，只要计算出3个峰下的面积即可。可在三个峰之间的两个谷分别作一垂直横坐标的直线。3个峰各由直线为界，逐道计算峰下的细胞数，并将其与总细胞数相对，则可分别得出每个峰所占的百分数。这种定量分析方法中，既没有使用任何数学模型，也没有引入任何变量，所以称为非参数定量分析法。

图13-29　正常睾丸组织FCM细胞分布直方图

当变异系数（CV）增大时，非参数分析法因误差过大，显然不能满足要求，必须用计算机拟合的参数分析法。现常用的有二阶多项式拟合法和多正态拟合法，已有相应的软件。

（五）精子（精液）

检查中应用精液检查和睾丸活检是临床判断男子生育能力的重要依据。FCM为客观地评价男子生育力，提供了有利的条件。FCM在男科学研究中应用，把定性的描述过渡到定量研究，可进行数理统计，使实验结果的科学性大大提高，同时可采用穿刺的方法取样本，并在必要时可多次穿刺，而不必活检睾丸组织，减少患者痛苦。在动物实验中，可不必杀死动物而行睾丸切片，故FCM在男科生物学及男子计划生育研究中有其应用前景。

1.精子细胞增殖周期定量分析

测定单个细胞内DNA含量是FCM最早最普遍的用途，细胞成熟程度与DNA含量密切相关。精子的发生过程，可分为三个阶段：①精原细胞增殖期：在增殖过程中，通过精原细胞的分裂和分化，由精原细胞产生初级精母细胞。②精母细胞成熟分裂期：包括初级精母细胞和次级精母细胞的两次成熟分裂，即初级精母细胞经过一次DNA复制继而进行了两次细胞分裂，结果染色体数减少一半。③精子形成期：由圆形精子细胞变形成为蝌蚪状的精子，在前减数分裂间期的DNA复制，初级精母细胞含有四倍体量的DNA（4C）。经过第一次成熟分裂得到的两个次级精母细胞虽然染色体的数目减半，但由于每条染色体是由两条染色单体组成的，因而其DNA含量与精原细胞相同为二倍体量的DNA（2C）。次级精母细胞经过第二次成熟分裂所形成的精子细胞，其每条染色体仅为一条染色体单体，DNA含量相当于初级精母细胞DNA含量的1／4（1C）。由计算机程控可按每个精子发生阶段的DNA含量绘制出DNA图形，并计算出各周期时相细胞的相对数量（G0／G1、S、G2+M%）以至各时相细胞的时间（TG1、TS、TG2、TM）或细胞周期时间（TC），故FCM可获得精液或睾丸组织中各类细胞相对比例的精确数据及精子形态学等指标，对精子发生障碍的性质和程度做出客观、精确评价，在临床不育症的研究，尤其是少精症和无精症的诊断疗效评价和预后估测，使用FCM具有明显优点。

2.抗精子抗体检测

免疫珠试验（IBT）检出抗精子抗体为当前的标准试验法，但费时且有些主观。FCM检测抗精子抗体提供了快速而高度的检出率，且具有高度敏感性和特异性，克服IBT的缺点。流式细胞计数的主要优点是对所给标本能以1000个细胞／s速度分析10 000精子。对比IBT取决于人的视觉评分系统，总共仅100个可活动精子。

3.检测人精子顶体结构，预测生育力

运用流式细胞计及人精子顶体特异性标记物，结合异硫氰酸荧光素的花生凝集素，检测精液精子顶体结构的完整性。表明人精子顶体结构的完整性与精子正常形态百分率、存活率、前向运动百分率正相关，而不育组精子在体外诱导发生顶体反应的能力明显低于生育组。故流式细胞计能用于预测生育力。

4.研究药物对人精子功能及形态的影响

通过测量Rh123荧光素的光强度，可衡量细胞内线粒体的数量与质量，从而反映出精子的活动能力。研究某些药物对人精子功能及形态的影响，目前在国内研究较多，用若丹明123（Rh123）和碘化吡啶（PI）染色做FCM检测人精子线粒体功能，具有快速、敏感度高优点，改变以往检测线粒体功能的方法局限于对固定细胞的观察。研究精子形态学的改变，用FCM检测其DNA含量同时结合电镜观察，可研究药物对精子形态的改变。从而对某些药物引起的不育症的诊断具有意义。

5.癌前病变肿瘤诊断和监视肿瘤治疗

人类正常体细胞具有较恒定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变以及一些具有恶性潜能的癌前病变，在其发生发展的过程中可伴随细胞DNA含量的异常，FCM可精确测定DNA含量的改变，可作为诊断癌前病变发生癌变的一个有价值的指标，还可根据DNA直方图，直观反映细胞周期的分布状态，对癌前病变细胞的增殖能力进行动态观察，可获得形态学难以获得的信息。大量的临床应用表明，FCM对肿瘤细胞系的诊断正确率已达到细胞形态学水平。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要意义。

6.精子染色体核型分析

FCM检测速度可达每秒10 ⁸染色体。这种分析技术能快速分析染色体核型和分类收集不同类型的染色体，供进一步的专门研究。精子染色体结构异常，导致男子生育力的下降。研究表明，染色体结构异常的精子，较结构正常的精子，耐高温的能力差，当加热至100℃持续5分钟，即出现部分结构异常的染色体的双螺旋结构破坏现象，发生不可逆的障碍，此时，用吖啶橙染色单键DNA呈红色荧光，双键DNA为绿色荧光，经FCM检测精子中红、绿色荧光的比例，计算αT、SDαT、COMPαT，以衡量精子染色质的稳定性，其中，αT（alpha T）指红色荧光占总荧光的比例，XαT代表了标本中平均每个精子总DNA中解旋的单链DNA的数量，SDαT表示αT的分布，而COMPαT（cells outside the main population）指具有较高解旋的单链DNA比例的精子，即具有较高αT值的精子，通常称为主群以外的精子。利用红色荧光与总荧光之比，流式细胞仪可反映不稳定染色体键的情况，男性不育患者的精子具有较多的单链染色质，因此可利用此检测技术查找不育的原因。另外，FCM进行细胞遗传学研究的另一特殊功能是用分类器可以纯化单一染色体型号。精子细胞有22条常染色体和1条性染色体，而性染色体可为X染色体和Y染色体，故精子细胞有两种精子：X精子和Y精子，而X精子和Y精子的DNA含量不同。据此，FCM可描绘出不同的峰型，峰的面积代表这种类型染色体的丰度，从而可检出X、Y精子的比例。FCM还可用分类器收集纯化单一的X精子或Y精子。故FCM可应用于男子学遗传方面的研究。

7.精子质膜的完整性

精子质膜作为与外界最接近的一层，有保护细胞器及其功能的作用，是精子维持正常结构的重要部分。精子的质膜完整性是精子存活的基本条件之一，镜下不动的精子由质膜破裂的死精子和运动能力差的精子组成，通过加入不具有膜通透性的染料（如伊红、PI等）即可区分这两类精子，而由于荧光颜色鲜明，易判断，因此，流式细胞仪检测观察精子质膜完整性更为精确。精子经核酸凝胶染色（nucleic acid gel stain，SYBR）／碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后经FCM测定，SYBR+为活精子，PI+为死精子，SYBR+PI+为精子处于从活到死的过渡状态。

8.精子的氧化应激

精子在各种外界环境应激中可产生活性氧，活性氧对精子具有氧化的作用，特别是精子在冷冻及解冻的过程中会产生大量的活性氧及自由基对精子的结构及各种酶产生损害作用。通过羧基-2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯染料染色的活性氧H ₂O ₂可以通过流式细胞仪进行检测，通过二氢罗丹明123染色的过亚硝酸盐也可以通过流式细胞仪进行检测。利用C11-BODIPY（581／591）探针及流式细胞仪测定精子膜脂肪氧化应激情况。另外一个具有氧化特性的自由基一氧化氮可以利用4，5-二氨基乙酰乙酸荧光素探针染色，利用流式细胞仪进行检测。

9.精子的渗透应激能力

研究表明渗透应激能力指的是细胞具有在高渗透及低渗透的环境中恢复自我形态的能力。这种能力对精子的功能尤为重要。相对于女性生殖道，精子在附睾中是低渗透性的，精子需要经过低渗透到高渗透的环境中。流式细胞仪可以检测精子的渗透应激能力，但不是最好的检测此能力的方法。

10.精子钙离子感觉器

钙离子是精子细胞中重要的离子，对于控制精子的运动方式及顶体反应发挥着重要的作用，也可以称为精子功能的一部分。细胞内钙离子浓度一般低于100nM，当精子获能的情况下，精子内钙离子浓度升高，UV可激发的Fura-2 and Indo-1染料，Fluo3-AM and eFluorTM 514钙离子敏感染料，Fluo-3 and Fluo-4钙离子敏感染料可和钙离子结合，这样钙离子浓度变化可以通过流式细胞仪很好的检测出来。

第三节　精子的功能检查

传统的精液检查主要包括精子密度、活动力、活动百分率和精子形态指标，在一定程度上反映了男子的生育能力。但有时精液常规检查的结果与实际生育力之间不尽一致。临床上经常发现一些不育症患者上述指标是正常的（排除女方因素），妻子不能妊娠，而精液常规检查密度低下正常者其妻子仍可妊娠的事实。陈国斌等认为常规精液检查与实际生育力仅有70%的一致性。精子功能指标的测定，更能客观地反映精子的受精能力，是对精液常规检查的必要补充。精子功能测定主要有：①精子运动功能指标的测定；②精子穿卵试验；③精子-宫颈黏液相互作用；④精子膜功能测定；⑤精子核功能测定；⑥精子线粒体功能测定；⑦精子顶体反应和顶体酶活力测定等。

（一）精子-仓鼠卵穿透试验

精子穿卵试验是精子穿透去透明带金黄仓鼠卵试验（sperm penetration of zona-free hamster egg assay，SPA）的简称，首先由Yanagamashi等于1976年报道，是测定精子获能、顶体反应、精子卵膜融合能力以及精子核解聚能力的经典方法。国外已作为精子功能的常规检测方法，但由于实验条件要求高，操作步骤多，有一定的技术难度，国内仅限于研究机构用于研究目的，临床未作常规展开。此外，精子穿卵试验也可进一步用于制备精子染色体之用。

1.试剂

（1）培养液

1）BWW（Biggers，Whitten and Whittingham）贮备液

2）BWW培养液

用100ml BWW贮备液溶解上述药品，加温至37℃，通入CO ₂气体调pH至7.4。

3）高渗BWW溶液（获能液）100ml BWW培养液加入0.15g人血清白蛋白。

（2）1.0g／L透明质酸酶：

临用时用BWW培养液配制。

（3）1.0g／L胰蛋白酶：

临用时用BWW培养液配制。

2.操作

（1）男方至少禁欲2天，用手淫法收集精液于无菌消毒容器，30分钟内送检。

（2）将精液倒入锥形离心管内，加BWW培养液至10ml，1500r／min离心5分钟，弃上清液。重复洗涤3次。

（3）加精子获能液于37℃ 5%CO ₂培养箱中，培养18小时获能。获能后精子1500r／min离心5分钟弃上清液，用高渗BWW溶液调整精子密度为1×10 ⁷／ml，备用。

（4）制备卵细胞用性成熟仓鼠（8～12周龄），观察1～2个性周期。以阴道口出现白色分泌物为周期第1天。于周期第1天上午给鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）25～50U，56小时后（第3天下午），再注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）30～50U，15～17小时后，将仓鼠断颈处死。剖腹，从输卵管伞端切断，取出卵巢，浸泡于盛有BWW培养液的培养器皿中。在解剖显微镜下，从伞部插入针头，刺破卵泡，冲洗卵泡腔。冲洗液中即含有成熟卵细胞。通常1次排卵可获30～50个卵子。将卵子移入1.0g／L透明质酸液中洗涤，待大部分卵丘细胞散脱后，再用BWW液洗1次，而后移入1.0g／L胰蛋白酶液中去除透明带。除去透明带后的卵再用BWW液洗2次备用。

（5）在无菌小培养皿中盛入2～3ml液体石蜡，吸取已获能的精子悬液0.1ml注入液体石蜡下，然后取出去除了透明带的仓鼠卵15～20个注入获能滴内。37℃含5%CO ₂培养箱中温育2～3小时后观察结果。

3.结果

受精后吸出卵子，用BWW培养液洗3次，除去吸附于卵子表面的精子。将受精卵放在载玻片上，四周涂抹少许凡士林与羊毛脂的混合物。将盖玻片轻轻盖在受精卵上，在相差显微镜直视观察下，轻压盖玻片，使卵细胞既不破裂，又能清楚地显示卵细胞质内肿大的精子头部。卵细胞质内出现肿大的精子头，且相对应的卵细胞膜上附有精子尾，提示卵已被精子穿透。肿大的精子头在镜下呈清亮区。如用2.5g／L乙酰卡红（acetocarmine）或10g／L乙酰间苯二酚蓝（acetolacmid）染色，则呈黑色斑块。受精卵也可先用乙醇∶冰醋酸为3∶1的溶液固定2小时，然后用20～40g／L Giemsa（0.15mol／L，pH 7.4磷酸盐缓冲液配制）染液染色8～10分钟，镜检。

4.计算

SPA结果可用卵子受精率及受精指数表示。

卵子受精率：卵子被精子穿透的百分率。最为常用，可按下列公式计算：

卵子受精率=受精卵子数／卵子总数×100%

受精指数（fertilization index，FI）：由于透明带已去除，1个卵子可被多个精子穿透。FI为穿透卵子的精子总数与卵子总数之比，从整体上反映精子的穿透力与顶体反应，可按下式计算：

正常生育男子SPA时卵子受精率各家报道不一，由0至100%不等，但多数＞10%。对女方曾与他人婚育过，或女方经全面检查证实生育力正常的不育夫妇中男方的研究表明，不育男子卵子受精率常＜10%。因此，多数学者将标准定为10%，≥10%为正常（SPA阳性），＜10%为异常（SPA阴性）。各实验室可根据自身实验条件及人群特征，经统计学处理后对标准做相应的调整。

5.最佳实验条件的选择与影响因素

SPA的实验条件各实验室不尽一致，而结果的好坏又受实验条件所左右。因此，应尽可能将实验条件控制在最佳状态。

（1）禁欲时间：

对生育男子不同禁欲时间的SPA结果比较表明，将禁欲时间从48小时缩短至24小时或12小时，即使精液常规未见精子总数与活力下降，精子对卵的穿透力也明显降低。因此，禁欲时间不能少于1天，但超过5天也无多大益处。

（2）标本送检时间：

精液标本放置过久，精子的穿透力显著降低。观察5例供者标本放置1～2小时后，有3例卵子受精率降至正常标准以下，出现假阴性。

（3）精子洗涤：

洗涤精子时不宜强力离心。有些学者用上游法（swim up）替代精子洗涤。即于精液表面滴加培养基，温箱内作用30～60分钟，让精子从精液上游至培养液内，吸取培养液内的精子进行SPA。上游法常规用于人工授精，但用于SPA时，能增加精子穿透卵子的能力，出现假阳性，不宜采用。

（4）获能时间：

争议较大。每个精子的获能时间不一，一般选用长时间培养，以保证每个精子均充分获能。Johnson等（1984）研究表明，获能7小时，33%的生育男子SPA卵子受精率＜10%，获能20小时，受精率全部正常。

（5）精卵穿透时间：

研究表明精卵相互作用3小时，卵子受精率最高。但如果获能时间短，应延长精卵穿透时间至3～6小时，使未获能精子有机会获能。

（6）精子密度：

过高、过低均影响穿透结果。调整时不能只以活动精子数为标准，否则结果偏高。精子密度大多为5×10 ⁴～2×10 ⁷／ml，但以1×10 ⁷／ml为最佳。

（7）卵子采集：

雌鼠至少6周龄以上，于性周期任何时间使用PMSG，卵子回收量与质量均不佳。用酶去除卵丘细胞和透明带时，时间越短越好，特别是胰酶处理过长，可显著降低精子穿透率。因此，操作必须十分娴熟。特别是洗涤卵子时，易将卵子吸进毛细管上端而粘于管内，应特别小心。

（8）培养：

培养液的组成成分应相对固定。人血清白蛋白（HSA）与牛血清白蛋白（BSA）均可使用，但以35.0g／L HSA穿透效果最佳。空气中培养，效果也好，且精子获能比在5%CO ₂环境中快，后者可能与CO ₂降低pH有关。培养时，试管塞务必塞紧。

（9）镜检：

加压盖玻片时力度要适宜。既不要压破卵子，又要能清楚地显示胞质内肿大的精子头。涂于细胞悬液四周的凡士林-羊毛脂混合物必须硬度适当。也可将其涂在盖玻片的4个角上。

（10）精卵的冷冻保存：

仓鼠卵的采集有严格的时间程序。临时收集，多有不便。可收集大批卵子冷冻保存，但以透明带完整的卵子为宜。将卵子置于含BSA 30g／L二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），以Hepes缓冲液配制的Tyrode培养液中。以0.3℃／min速度逐渐冷却至-80℃，而后转入液氮中保存。解冻时，速度宜8℃／min。解冻后，用5倍量的上述培养基洗2次，37℃温箱中作用1小时后，用胰酶去除透明带。此法保存的卵子与新鲜卵的精子穿透率无显著性差别。卵子的复活率为70%～80%。

冷冻精子解冻后绝大部分精子活力保持不超过5小时，因而不宜用于SPA，但精子可加入TEST卵黄缓冲液中于2～5℃保持48小时，对卵子的穿透力不但不降低，反而增高。

TEST-卵黄缓冲液的配方为：211mmol／L TES［N-tris（hydroxymethyl）methyl-2-amino-ethane sulfonic acid，N-羟甲基-2-氨基乙烷磺酸］；96mmol／L Tris（三羟甲基氨基甲烷）；11mmol／L右旋糖酐（dextrose）；20%新鲜鸡蛋清；用青霉素、链霉素防腐。

6.评价

SPA可检测人精子的受精能力、获能及顶体反应，对不育症较精液常规更有价值。生育男子SPA正常的概率为82%，不育者SPA正常的概率仅2%。提示虽然生育男子精子穿透率也可能低下，但不育男子精子穿透率很少正常。SPA虽优于精液常规，但与精子活力及形态并无关联。精液中脓细胞数也显著影响SPA结果。SPA与性交后试验（PCT）及体外精子-宫颈黏液穿透试验有相关关系。对已知的生育与不育男子用牛宫颈黏液穿透试验和SPA检测，结果和临床的符合率分别为74%与90%。在试管婴儿（IVF-ET）技术中，Margalioth等研究20例进行IVF-ET的男子，7例SPA异常者无一例人卵受精成功，13例SPA正常者10例成功。说明SPA能较准确地评价精子受精能力。

7.临床意义

在临床实践中，SPA可用于以下几个方面：①对原因不明的不育者，检测其精子的功能；②女方进行强有力地治疗前，如促性腺激素治疗和输卵管成形术前，确定其丈夫精子的受精能力；③估计不育症患者精液异常的严重程度、观察治疗效果；④IVF-ET时，估计供精者精液标本的质量和作受孕率的估计；⑤检测生殖抗体，如抗精子抗体对生殖的影响；⑥输精管结扎前，男子受精能力监测；⑦评价化疗或放疗对男子肿瘤患者生育力的影响；⑧估计化学药品、环境中的毒物和药物对人精子受精能力的影响。

8.离子载体刺激精子的替代方法

随着精子-卵透明带的相互作用，启动顶体反应的两个关键细胞内信号是钙流入和胞质碱化作用。这两种细胞内信号均可用二价阳离子载体人工产生。下面介绍一种使用离子载体刺激精子的替代方法。

（1）试剂

1）BWW贮备液。

2）透明质酸酶（300～500IU／mg）。

3）Ⅰ型胰蛋白酶（10 000 BAEE U／mg）。

4）蜡（熔点48～66℃）。

5）凡士林。

6）液体石蜡。

7）去透明带仓鼠卵：可在市场上购买，或者通过仓鼠的超排卵来获取。

8）二甲亚砜（DMSO）。

9）离子载体（用于替代方案）1mmol／L贮备液：将5.23mg二价阳离子载体。

10）A23187，溶解于10ml DMSO。

（2）不加入离子载体激发的标准方案

1）充分混匀精液标本。

2）用密度梯度离心法或者上游法制备精液标本。

3）吸去精子团上的大部分上清液。

4）用移液器轻柔地吹打精子团，并且测定精子团中的精子浓度。

5）用0.5ml的培养液，将精子团稀释为10×10 ⁶个精子／ml。

6）将试管倾斜与水平面成45°角，以增加管内精子悬液的表面积。

7）在37℃、含5%（v／v）CO ₂的空气中孵育精子悬液18～24小时，诱导获能（旋松试管盖，允许气体交换）。如果没有CO ₂培养箱，可以应用Hepes缓冲培养液，塞紧试管盖，在37℃中孵育。

8）将试管恢复垂直位置20分钟，使获能后不活动的精子沉降下来。

9）在上清液上1／3处吸取活动精子，注意勿扰动界面处的死精子，将它们移入一支新试管。

10）调整浓度为每ml培养液含3.5×10 ⁶个活动精子。

11）用正向置换式移液器吸取已知体积（50～150μl）的精子悬液，缓慢地将精子悬液散在滴布于小的Petri培养皿中。用一支一次性塑料吸管，吸取经CO ₂平衡和预温的液体石蜡，覆盖住精子滴，注意勿扰乱精子悬液，在周围加入足够的液体石蜡并正好覆盖住每个精子滴。

（3）加入Ca ²⁺离子载体的替代方案

1）用密度梯度法制备高活力精子团。

2）吸出80%密度梯度液层底部的液团，并转入到8ml BWW液中。

3）以500g离心5分钟。

4）轻轻地倒出大部分上清液，然后用移液器轻柔地吹打精子团。

5）测定精子团中的精子浓度，用新鲜BWW液稀释为5×10 ⁶个活动精子／ml。

6）在2份1ml的精子悬液中分别加入1.25μl和2.5μl的A23187贮备液（1mmol／L），以获得1.25μmol／L和2.5μmol／L的两个终浓度。

7）37℃，将精子与离子载体一起孵育3小时。

8）以500g离心精子5分钟。

9）轻轻地倒出大部分上清液，然后用移液器轻柔地吹打精子团。

10）测定活动精子百分率。

11）用新鲜BWW液稀释至约3.5×10 ⁶个活动精子／ml。使用低至1×10 ⁶个活动精子／ml的浓度，仍可以获得正确结果。

12）制备精子液滴，覆盖液体石蜡。

（4）收集卵巢

1）注射HCG后18小时内，按照相关的动物保护与使用委员会所批准的方法处死仓鼠，回收卵母细胞。

2）背部朝下放置仓鼠，用95%乙醇涂湿腹部皮毛。

3）用带齿的镊子夹住皮肤，用剪刀剪开皮肤和肌肉，暴露出子宫和卵巢。

4）用95%乙醇棉球揩去镊子和剪刀上的皮毛。

5）把肠子推出腹腔，暴露出子宫角。

6）用镊子夹住一侧子宫角，从腹腔提出，暴露出输卵管、卵巢和卵巢韧带。

7）用镊子夹住子宫角最远的部分，紧贴着镊子下方剪断子宫末端。剪下卵巢，放入小的培养皿内预温（37℃）的BWW液中。

8）用同样方式收集另一侧卵巢。

（5）收集卵丘细胞团

1）用倒置显微镜透射光检查卵巢，确定输卵管膨大部位中含有卵母细胞的颗粒细胞的位置。

2）用镊子夹住输卵管，用21号针头刺破膨大区，卵丘团会从刺破孔涌出。

3）用针拔出卵丘团。用镊子挤压输卵管，移出全部卵丘团。

（6）回收和处理卵母细胞

1）用针和镊子将颗粒细胞团集拢在一起，然后把这些颗粒细胞团移入表面玻璃皿、滴试板或者其他浅底容器中。容器中盛有含有0.1%（1g／L）透明质酸酶，预温、并经CO ₂平衡的BWW液。

2）用铝箔覆盖容器，使颗粒细胞团避光，并在室温下孵育10分钟，用倒置显微镜观察颗粒细胞的分散情况。

3）用火焰烧拉制成的玻璃移液管，从透明质酸酶液中转移已分离出的卵母细胞到经预温和平衡的BWW液里。

4）转移卵母细胞到新鲜的预温和平衡的BWW液滴中，漂洗回收的卵母细胞2次。这个程序可以在玻璃多孔板或滴试板上完成。每次转移卵母细胞之间，用BWW液漂洗移液管。

5）在室温下，用0.1% （1g／L）胰蛋白酶（10 000IU／ml）消化处理卵母细胞约1分钟，以酶解除去卵透明带。用倒置显微镜观察卵透明带的消化情况。一旦卵透明带已经溶解，立即移出卵母细胞。

6）用BWW液漂洗卵母细胞3次。

7）37℃预热分离出的卵母细胞，将卵母细胞移入精子悬液中。另一种方法是，将分离出的卵母细胞在使用24小时前储存在4℃冰箱内。

（7）配子共培养

1）将去透明带卵母细胞分配入几个精子液滴中，每个液滴放入约5个卵母细胞（例如，每份精液标本用20个卵母细胞，制备4个精子悬液滴，每个液滴5个卵母细胞）。

2）将1组约5个卵母细胞吸入移液管，装入的培养液量要少，以使精子悬液不会被稀释太多。

3）将玻璃移液管的尖端直接插入精子悬液滴的中央，缓慢地放入卵母细胞，保持着正压力以避免液体石蜡吸入移液管，注意勿将气泡打入精子液滴。

4）移液管从精子悬液滴中移出来后，揩去移液管尖端过多的液体石蜡。

5）重复步骤3，直至全部卵母细胞转入精子悬液滴。

6）每次转移卵母细胞后，在BWW液中彻底地冲洗移液管，以避免精子的交叉污染。

7）在37℃、含5%（v／v）CO ₂的空气中孵育配子3小时。

8）从液体石蜡滴中回收卵母细胞。在转移卵母细胞到BWW液前，注意搽去移液管尖端的液体石蜡。

9）用火焰拉制成的巴氏移液管，在BWW液中冲洗掉疏松附着在卵母细胞上的精子。

（8）卵母细胞的分析

1）用蜡-凡士林混合物在载玻片上做4个柱子以形成一个矩形，以它的角支撑起盖玻片（22mm×22mm，厚度号码1.5，0.17mm）。

2）在4个支柱中央放入含有卵母细胞的BWW液小滴。

3）盖玻片放在4个支柱上，轻轻地压盖玻片，至卵母细胞变扁。显微镜观察解凝聚的精子头需要充分压扁卵母细胞。

4）如果必要，多添加一些BWW液，充满盖玻片，以避免压碎卵母细胞。

5）在相差显微镜200倍下检查制备情况。

6）计数带有尾或靠近尾部的解凝聚精子头的数量。

7）记录至少有1个精子穿透的卵母细胞百分率。记录穿透每个卵母细胞的精子数。

8）记录经最初冲洗卵母细胞后仍然结合在卵母细胞表面的精子数，因为这可以得到发生顶体反应的精子比率。

（9）质量控制：

本试验必须使用显示＞50%穿透的精液标本作为阳性对照。

（二）精子-宫颈黏液相互作用

宫颈黏液是精子受精过程中穿越的第一道屏障，活动的精子在体内以宫颈黏液的纤维丝为导向到达宫颈隐窝，在此停留，并以缓慢的速度进入子宫及输卵管。精子-宫颈黏液相互作用试验分体内试验和体外试验。体内试验即性交后试验（post-coital test，PCT），体外试验主要包括玻片试验和毛细管穿透试验。体外试验可以应用几项体外穿透试验来详细评估精子-宫颈黏液相互作用。这些体外穿透试验通常在性交后试验结果为阴性后才进行，并且使用供者精液和供者宫颈黏液作为对照，进行交叉试验可以提供更多的信息。这些试验也可以用于评估男性或女性配偶抗精子抗体试验阳性的意义。如果精子-宫颈黏液相互作用的试验目的是为了比较不同宫颈黏液标本的质量，应使用同一份精子参数正常的精液标本。如果试验目的是评价几份精液标本的质量，应使用同一份质量好的月经中期宫颈黏液标本。

可以从预约进行人工授精或辅助生育取卵的月经中期妇女获得供者宫颈黏液。应在自然周期或使用促性腺激素诱发排卵周期的受精前采集宫颈黏液。妇女可以给予炔雌醇7～10天，以产生用于测试的雌激素化的宫颈黏液，由于氯米芬的抗雌激素作用可能对宫颈有影响，因此使用了氯米芬诱发排卵的妇女不应作为宫颈黏液的供者。应使用人的月经中期宫颈黏液。

体外实验应在采集精液后1小时内进行，以防止脱水或温度变化影响精液质量。宫颈管内或采集的宫颈黏液，立即用范围为6.0～10.0的pH试纸测试pH值。

如果在宫颈管内测试pH值，应注意方法正确，因为宫颈管外的宫颈黏液pH值通常低于宫颈管内。还须注意避免阴道分泌物的污染，因为它的pH值低。

精子对宫颈黏液pH值的变化甚为敏感。酸性宫颈黏液可使精子制动，而碱性宫颈黏液可提高精子活力。宫颈黏液碱性过强（pH＞8.5）对精子存活有不利的影响。在宫颈黏液中精子移动和存活的最适pH值是7.0～8.5，这也是月经中期正常宫颈黏液的pH值范围。虽然pH值为6.0～7.0的宫颈黏液可容许精子穿透，但pH值低于6.5常抑制精子活力。如果宫颈黏液的pH＜7.0，通常不进行精子-宫颈黏液试验。

在精子-宫颈黏液相互作用体外实验中，使用代用凝胶，如牛宫颈黏液或合成凝胶，不能认为等同于人宫颈黏液。

1.性交后试验

（1）原理：

精子欲达到输卵管壶腹部使卵受精，必须穿过充盈有宫颈黏液的宫颈管。宫颈黏液由宫颈管腺细胞分泌，能保护精子免遭阴道酸性环境的破坏和巨噬细胞的吞噬，并可给精子补充能量。正常情况下，射精后数秒钟精子即穿入宫颈黏液，然后依其自身的运动游向宫腔，同时有一部分精子贮存在宫颈腺上皮的隐窝内，不断游出，增加了卵子受精的概率。精子在宫颈黏液中的运动及其存活时间受许多因素的影响。黏液中如有抗精子抗体存在，或精子表面结合有抗精子抗体，精子将失去其运动能力，出现凝集及摇摆现象。由于巨噬细胞的吞噬和补体介导的细胞毒作用，精子将被破坏；精子本身如有遗传或代谢障碍，也不能穿透宫颈黏液。

（2）分类：

根据从性交至宫颈黏液镜检的时间不同，可将PCT分为标准试验、延迟试验和早期试验。标准试验通常在性交后6～10小时进行，而延迟及早期试验分别在性交后18～24小时及2～3小时进行，通常射精后150分钟宫颈管内精子密度最大。但PCT不仅检查精子穿透宫颈黏液的能力，而且也可反映精子在黏液中的寿命。标准试验异常，应进行早期试验，以检查精子的穿透力。相反，当延迟试验时PCT仍正常，则可排除宫颈因素。

（3）时间选择：

宫颈管腺细胞分泌黏液受卵巢激素的影响。排卵前随雌激素分泌的逐渐增多，宫颈黏液量渐增，且日趋稀薄。至排卵期可超过0.3ml，呈蛋清样，同时拉丝度大，可达10cm。涂于玻片干燥后可出现3级以上分支的羊齿状结晶，此时最便于精子穿透。排卵后，随孕激素的增多，宫颈黏液量渐减、变稠，此时正常精子也不能穿透。因此，PCT必须在排卵期进行，否则出现假阴性。应尽可能在邻近排卵时，但是要在排卵前，进行性交后试验。邻近排卵时间可根据临床指标来确定，例如：通常的周期长度、基础体温、宫颈黏液变化、阴道细胞学检查、测定血清或尿液中促黄体激素或雌激素，以及超声检查卵巢。在实验室评价宫颈黏液的标准时间是性交后9～14小时，这点是很重要的。WHO根据宫颈黏液的性状，制定了评分系统（表13-8），并认为总分少于5分者，精子不可能穿透宫颈黏液。5～10分者，精子的穿透力受影响。做PCT时，在10分以上为宜。临床上，还可借助基础体温、阴道脱落细胞学及激素测定确定排卵期。对月经不规则或分泌功能紊乱者，可用人工周期。于月经来潮第5天服用己烯雌酚1mg／d，于服药后的7～14天进行PCT，且需复查。

表13-8　宫颈黏液的评分标准（WHO提供，2010）

（4）操作：

①试验前夫妇双方要禁欲2天。性交时宜抬高臀部并平卧0.5小时，性交过程不能使用任何阴道润滑剂，女方不能在性交后冲洗阴道（可以淋浴，但不能全身浸浴）和用药。②用不涂有润滑剂的窥阴器徐徐打开阴道，暴露宫颈与穹隆。用不带针头的注射器先吸取阴道后穹隆的黏液置于载玻片上，显微镜下检查有无精子。如无精子，表示性交失败，精子未射入阴道。如有精子，则换注射器抽吸宫颈口黏液，再用灭菌棉签擦拭宫颈外口，将注射器头插入宫颈管内抽取黏液，分别涂片后，用高倍镜计数每视野活动精子数目，同时注意精子有无凝集，有无脓细胞、滴虫、真菌及其他微生物。

（5）结果：

宫颈黏液中精子的活力分为0～Ⅲ级。0级：不活动；Ⅰ级：原地运动；Ⅱ级：运动缓慢；Ⅲ级：直线运动。在标准试验，宫颈口及宫颈管黏液中每高倍视野有10个以上Ⅲ级向前直线运动的精子，则表示正常。在延迟试验中，宫颈口黏液中活动精子数有所减少，但宫颈管内黏液中活动精子数不应少于5个／HP。WHO于2010年制订PCT分级诊断标准（表13-9）可供参考。

表13-9　WHO的PCT诊断标准（2010版）

如果黏液中没有观察到精子，实验结果为阴性。性交后9～14小时子宫颈内黏液中存在任何快速前向运动精子，可以排除宫颈因素以及男方或女方的精子自身免疫因素导致不育的可能。当观察到非前向运动精子显示颤动现象，提示宫颈黏液中或者精子表面可能存在抗精子抗体。如果初试结果是阴性或异常，应重复性交后试验。如果阴道池标本没有观察到精子，应询问这对夫妻，以确认有过阴道内射精。试验阴性可以由选择实验时间不正确所致。对有生育力的妇女来说，在月经周期内过早或过迟进行试验也会出现阴性结果。有些妇女可能在整个月经周期中仅有1或2天有阳性结果。如果不能合理精确预期排卵，则需在月经周期中重复几次性交后试验，或者重复进行体外试验。选择月经周期中最佳时间重复进行性交后试验的结果均为阴性，才能确定宫颈因素为不育的可能病因。

（6）影响因素：

PCT结果取决于精子与宫颈黏液的相互作用，任何一方的异常均可影响PCT结果。由于宫颈黏液的性状受人体内雌、孕激素的左右。因此，女性内分泌失调，如无排卵，PCT常异常。有时，月经中期的雌激素高峰能诱发排卵，但不能使宫颈管腺上皮分泌黏液，此时虽有排卵，PCT仍异常。宫颈黏液中的白细胞及细胞碎片也影响精子对黏液的穿透。pH＜7或pH＞8.5也可导致PCT假阴性。宫颈疾病及男女双方性功能障碍，均可影响PCT结果（表13-10）。由于影响因素多，因此，PCT异常必须复查。

（7）意义：

PCT不仅能测定宫颈黏液中的活精子的数量，也可以了解性交后一定时间内精子在女性体内存活和运动情况。性交后6～10小时是PCT测定的最佳时间，此时如宫颈内有适量的活动精子，就可排除不育的宫颈黏液因素。对初次试验阴性或不正常者应重复PCT试验。

表13-10　影响PCT结果的因素

2.毛细管穿透试验

由Kremer于1965年创立，通过在体外观察精子是否穿透毛细管内的宫颈黏液来评价精子的功能。该方法操作简便，实验条件容易控制，影响因素少，特别是可以使用供者的宫颈黏液或宫颈黏液代用品，可同时检测一批标本。该试验还可以用来鉴定导致性交后试验（PCT）异常的因素是在男方还是在女方，有很大的临床实用价值。

原理：与PCT相同。由于使用供者的宫颈黏液或宫颈黏液代用品，精子在黏液内的穿行距离及黏液内活动精子数，完全取决于精子本身的运动功能。

宫颈黏液代用品临床上取正常妇女排卵期的宫颈黏液有一定的困难，取材不方便，而且量少，干扰因素多。因此，许多学者一直在寻找可替代人宫颈黏液的穿透介质。常用的代用品主要有以下几种：①动情期母牛宫颈黏液（BCM）：BCM在生化组成、黏稠度及流体力学上与人宫颈黏液（HCM）极为相似，干燥后也可形成羊齿状结晶。人精子在BCM内的穿透高度、穿透密度及活力与在HCM中无显著差别。BCM对畸形精子的阻滞力较HCM更大。BCM储存于带塞的试管中，以免脱水，4℃可保存1周。②含人血清精子营养液：NaCl 7.721g，MgSO ₄·7H ₂O　0.247g，果糖1.000g，Na ₂HPO ₄3.581g，KH ₂PO ₄0.136g，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4于4℃备用。用时取6ml精子营养液加25%人血清白蛋白1ml。③含牛血清白蛋白精子营养液：取150mg牛血清白蛋白溶于5ml精子营养液中，混匀后即可使用。④鲜鸡蛋清：蛋清的物理性状类似于宫颈黏液，用蛋清做穿透试验，经济方便、结果可靠。取新鲜鸡蛋2只，分离蛋清，混匀、搅拌后加入100U／ml青霉素。⑤精浆：取3～5例生育男子精液，液化后混匀，2000r／min离心15分钟，取上清液，加入100U／ml青霉素。

以上代用品均分装于安瓿中，-20℃保存。

材料：①毛细管：规格为内径0.9～1.1mm，长120mm。②精液池：规格为内径8mm，长40mm的平底聚苯乙烯塑料管。

操作：试验前患者禁欲2天。穿透前将排卵期的宫颈黏液或其他代用品吸入毛细管内，顶端用胶泥封口，下端插入精液池内，池内有精液0.2ml，垂直放入37℃湿盒内1小时，取出毛细管，镜下观察，测定精子在毛细管中的穿透高度，并记录活动精子的数目。

结果：有人直接根据精子的穿透高度来判断结果。WHO推荐根据穿透高度、穿透密度和活力项指标，采用评分的方法，对结果进行判断。试验时间可经预实验设定，如10分钟、30分钟、3小时、24小时等。

穿透高度：毛细管中领先精子达到的高度，单位：mm。

穿透密度：选择毛细管中精子数目最多的一段，计数其中的精子数。

活动力：根据毛细管中上1／3段前向运动精子的比率分为0～Ⅲ级。0级：无前向运动；Ⅰ级：前向运动精子占25%；Ⅱ级：前向运动精子占25%～50%；Ⅲ级：前向运动精子＞50%。根据以上指标，按表13-11对实验结果进行评分，取各项指标的累计分值为判断标准。7～9分为优；4～6分为良；1～3分为差；0分为阴性。

表13-11　毛细管精子穿透试验评分标准

正常参考值：见表13-12，以含白蛋白的精子营养液、牛宫颈黏液较有鉴别价值。

影响因素：影响结果的因素主要有精子的质量、宫颈黏液的性状及试验时的温度。精液必须新鲜，采集精液时必须遵循精液检查一节所述的原则。精液液化后宜在1小时内进行穿透试验。冬天送检应特别注意保温。宫颈黏液必须选择排卵期的黏液，吸入毛细管内时，不可存留气泡，以防气泡阻止精子向前运动。

3.玻片试验

玻片试验最初由Miller和Kurzrock于1932年建立，后经Moghissi改进。原理和作用类似毛细管穿透试验，区别在于本法在载玻片上观察精子对宫颈黏液的穿透，比毛细管法更为简便。

表13-12　生育、不育男子精子在5种宫颈黏液代用品中的穿透力

（1）操作：

取洁净玻片1张，相距4mm分别滴加1滴排卵期宫颈黏液或其代用品和1滴液化的精液。轻轻盖上盖玻片使两液滴相互接触但不重叠，37℃孵育10～15分钟后40×物镜下观察。宫颈黏液和精液均具有一定的表面张力，两样品接触时可形成明显的界面。精子可由指状突起处向黏液穿透。一旦领先精子突破界面后，其他精子鱼贯而入，在黏液内四向运动。前向运动力强的精子不断穿入黏液深部。

（2）结果：

以紧邻界面第一个高倍视野为F1，紧邻F1第二个高倍视野为F2。计数F1和F2中活动的精子数，并依此判断结果（表13-13）。

表13-13　精子-宫颈黏液玻片试验结果判断

（三）精子膜功能测定

精子膜上含有丰富的多聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分，精子膜的功能与精子获能、顶体反应及精卵融合密切相关。精子膜功能的测定，可预见精子的受精能力。

1.精子尾部低渗肿胀试验

精子尾部是精子的运动器官，它直接关系到精子的活动能力。精子尾部低渗肿胀试验（hypo-osmotic swelling test，HOST）可作为体外精子膜功能及完整性的指标，可预测精子潜在的受精能力。

（1）原理：

精子在低渗溶液中，必须重新建立内外液体间的平衡，水分子通过精子膜进入精子，使精子体积增大而膨胀，这是活精子膜功能正常的标志。而膜功能不全（包括死精子）的精子表现为不膨胀。

（2）试剂：

①低渗肿胀液：枸橼酸钠（Na ₃C ₆H ₅O ₇·2H ₂O）7.35g；果糖13.51g；加蒸馏水至1000ml；4℃冰箱保存。②伊红Y溶液：5g伊红Y溶解于100ml 0.01mol／L pH 7.4 PBS缓冲液中。

（3）操作：

取液化精液0.1ml加37℃预温的低渗肿胀试剂0.85ml，混匀，置37℃水浴30分钟后再加入伊红Y溶液0.05ml，混匀，室温放置2分钟。镜下计数200条精子中b-g型精子的百分率（肿胀精子分为b-g 6型）。b-g型精子尾部呈不同程度的肿胀，g型精子整个尾部肿大呈球状，证明精子膜无损伤，精子功能良好。

（4）结果分析：

人精子尾部低渗肿胀有b-g 6种类型（图13-30）。除a型未肿胀外，b-g均为肿胀形，统计b-g型精子的百分率。

（5）正常参考值：

结果见表13-14。

表13-14　生育、不育和妻子流产男子精子低渗肿胀试验结果

^*与生育组比较P＜0.01

目前对HOST的临床价值仍有争议，对是否能预测精子的受精能力有着不同的看法。HOST对评价精子膜功能是简便有效的方法，同时应结合其他精子功能试验进行全面分析。

图13-30　低渗肿胀试验后各种形态的精子

A.未肿胀；B.尾尖肿胀；C.尾尖弯曲肿胀；D.尾尖肿胀伴弯曲膨胀；E.尾弯曲肿胀；F.尾粗短肿胀；G.尾完全肿胀

2.伊红Y水试验

精子尾部低渗肿胀试验通过检测精子尾部的肿胀率来评估精子膜的完整性。由于精子头部胞质少，质膜与核膜接触紧密，因而精子头部肿胀率明显低于尾部。伊红Y水试验除可检测精子尾部肿胀率来反映精子膜功能的完整性外，还可以通过检测精子头部未着色率来评估精子头部膜结构的完整性。

（1）试剂：

50g／L伊红Y水溶液：伊红Y5g加蒸馏水至100ml。

（2）操作：

液化精液10μl+伊红Y水溶液40μl，载玻片上混匀，盖上盖玻片，静止1～2分钟后置于40×物镜下观察，计数精子尾部总肿胀率、g型精子百分率和精子头部未着色率。

（3）结果：

生育组与不育组男子精子伊红Y水试验结果见表13-15。

表13-15　伊红Y水试验各项指标生育组与不育组的比较

±s，%）

（四）精子核功能测定

精子核是精子重要的细胞器，包含了父方遗传物质。精子发生过程中，各期生精细胞核内DNA的含量发生规律性变化，与核DNA结合的核蛋白也发生组型转换（即从组蛋白→过度蛋白→鱼精蛋白）。成熟的精子核内DNA与鱼精蛋白紧密结合，高度浓缩，抑制了基因的表达，使遗传物质保持稳定。精子核成熟度直接影响着精子受精能力和受精后原核的形成及胚胎的着床。

1.精子核DNA荧光染色

精子核占精子头部的65%，由鱼精蛋白（protamine）和DNA组成，成年男子排出的精子中有双链DNA精子，也有单链DNA精子，其中只有双链DNA精子才具有受精能力。荧光染料吖啶橙可区别单链或双链DNA，从而反映精子核DNA的成熟度以评估男子的生育力。

（1）原理：

精子发生过程中，鱼精蛋白逐步取代组蛋白与DNA结合。精子进入附睾后，鱼精蛋白的组成不再改变。但精子在附睾成熟过程中，鱼精蛋白中大量的巯基（—SH）不断氧化成二硫键（—S—S—）与DNA更紧密地结合，使DNA更具抗酸能力，维持了双链结构的稳定。而一些不成熟的精子鱼精蛋白中多数—SH未被氧化，DNA在酸的作用下变性成为单链。吖啶橙（AO）可与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光，与单链DNA结合呈聚合物形式发出红色或黄色荧光。

（2）试剂：

①吖啶橙染料：吖啶橙0.1g加蒸馏水至100ml。②枸橼酸溶液：枸橼酸1.91g加蒸馏水至100ml。③磷酸氢二钠溶液：Na ₂HPO ₄·12H ₂O 10.74g加蒸馏水至100ml。上述原液4℃存放备用。④吖啶橙工作液：按吖啶橙1.0ml，枸橼酸4.0ml，磷酸二氢钠0.25ml比例用前配制。

（3）操作：

液化精液1.0ml用pH 7.4 0.01mol／L PBS洗3次，弃上清液，用PBS调整精子浓度为5×1分钟，流水冲洗，晾干，荧光显微镜高倍镜下观察（波长EF 490nm，DM 500nm，BP510nm，SEF 530nm）。计数300条精子中绿色、红色和黄色精子数，计算出有受精能力绿色精子的百分率。

（4）正常参考值：

58例不育症患者，双链DNA精子的比率范围很广，为（77.1±15.2）%；33例正常生育男子与31例妻子流产的男子，比值均＞66%。

2.精子核染色质抗解聚试验

（1）原理：

精子核由于大量二硫键的存在呈高度浓缩，使DNA处于高度稳定状态。EDTA-SDS能打开鱼精蛋白分子中的二硫键。当精子核内组蛋白含量过多时，阻碍了鱼精蛋白与DNA的紧密结合，使核的结构较为松散，稳定性降低。经EDTA-SDS作用后，核出现膨胀，呈解聚状态。精子核抗解聚能力反映了精子核成熟的程度。

（2）试剂：

①0.05mol／L，pH 9.0硼酸盐缓冲液（BSS）：硼酸0.310g；硼砂（四硼酸钠）0.562g；加蒸馏水至100ml。②EDTA：SDS溶液（6mmol／LEDTA，10g／L SDS）：EDTA-Na ₂·2H ₂O 0.223g；SDS 1.0g；加试剂①至100ml。③2.5%戊二醛溶液：用上述0.05mol／L，pH 9.0硼酸盐缓冲液配制。

（3）操作：

精液液化后1000r／min离心10分钟，去精浆，精子用0.05mol／L硼酸盐缓冲液洗2次，精子沉淀加入1ml EDTA SDS溶液，混匀，37℃孵育60分钟，而后加入等体积的戊二醛溶液，终止反应。取出1滴（10～15μl）滴加在玻片上，覆以盖玻片，相差显微镜40×物镜下观察，计数200条精子中头部核未解聚的比例。也可将反应物涂片干燥后Feulgen染色，普通显微镜下同上观察计数。

（4）结果：

正常生育男子精子核未解聚的比率应＞70%。

3.苯胺蓝染色法检测精子核蛋白组型转换

（1）原理：

精子核蛋白组型转换发生在精子细胞阶段。圆形精子细胞伸长时，首先合成过渡蛋白（transition protein，TP）取代组蛋白。到了晚期精子细胞，TP又被鱼精蛋白取代。人成熟精子中仍然保留了少量的组蛋白和过渡蛋白。鱼精蛋白分子中富含精氨酸和胱氨酸，一般不含赖氨酸，而组蛋白和过渡蛋白中则有众多的赖氨酸。苯胺蓝可与富含赖氨酸的蛋白结合，呈蓝色，以此来显示精子核蛋白组型转换。

（2）试剂：

①0.05mol／L，pH 9.0硼酸盐缓冲液（BSS）：配方同上。②0.5g／L苯胺蓝-4%醋酸溶液：5g苯胺蓝溶于4%醋酸溶液。③操作：精液液化后1000r／min离心10分钟，精子沉淀用BSS洗3次后再用BSS悬浮。涂片，空气干燥，用苯胺蓝醋酸溶液染色5分钟，用90%乙醇脱色，干燥后显微镜下计数100条精子中染色阳性精子（核呈蓝色），计数阳性精子的百分率。

（3）结果：

50例正常生育男子苯胺蓝阳性精子均≤30%。精子核内组蛋白的大量存在，阻碍了鱼精蛋白与DNA的正常结合，使精子核DNA稳定性降低。同时，受精后使精子核不能解聚形成原核，影响雌雄原核的融合，导致受精失败、胚胎不能正常发育而流产。

4.精子核蛋白组分的测定

精子发生过程经历精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子几个阶段。在精子细胞阶段，细胞核内与DNA结合的组蛋白大部分由体细胞型转化为鱼精蛋白（也称精核蛋白或精蛋白），形成高浓缩的DNA鱼精蛋白复合物，使DNA处于不转录状态，形成精子特异染色质。在这一过程中，精子由圆形变为长形，核高度浓缩，最终分化形成成熟的精子。精子鱼精蛋白分为两类：一类是P1，富含精氨酸和胱氨酸，存在于所有哺乳动物中；另一类是P2族（由P2和P3鱼精蛋白组成），仅存在于人类及小鼠、仓鼠等极少数哺乳动物精子中。正常人精子中还含有少量的组蛋白和过渡蛋白。

（1）试剂：

①0.02mol／L EDTA-Na ₂，pH 8.0：EDTA-Na ₂·2H ₂O 0.745g溶于适量蒸馏水，用2mol／L NaOH调整pH至8.0，蒸馏水定容至100ml；②溶液A：0.5mol／L Tris-HCl pH 8.0，0.28mol／L β-巯基乙醇，5mol／L盐酸胍（称6.057g Tris，47.800g盐酸胍，加水80ml，再加1.96ml β-巯基乙酸，用1mol／L HCl调pH至8.0，定容至100ml）；③ 1.0mol／L HCl；④60%三氯醋酸；⑤丙酮；⑥10g／L考马斯蓝（R250）；⑦丙烯酰胺；⑧电泳样品稀释液：5%醋酸，9.0mol／L尿素；⑨脱色液∶甲醇∶冰醋酸∶水=5∶1∶4。

（2）操作：

①精子核总碱性蛋白的提取液化精液2000r／min离心10分钟，弃上层精浆，沉淀精子用生理盐水洗3次后悬浮于适量的0.02mol／L EDTA溶液中，加入等体积的溶液A，上下缓慢颠倒数次后，置于37℃水浴30分钟，使核解聚。加入1.0mol／L HCl使其终浓度为0.25mol／L，冰浴20分钟后2000r／min离心30分钟，得上清液，沉淀用0.25mol／L HCl漂洗1次，同上离心。合并2次上清液，加入60%三氯醋酸使终浓度为20%，此时可见白色沉淀。4℃冰箱放置100分钟，再2000r／min 4℃离心45分钟，沉淀保留，上清液加入6倍体积的冷丙酮，4℃过夜。次日，2000r／min 4℃离心15分钟，弃上清。合并2次沉淀，用冷丙酮洗涤1次，同前离心，沉淀真空干燥，得到白色精子核碱性蛋白丙酮干粉。②醋酸-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳制备15%聚丙烯酰胺凝胶（含0.9mol／L冰醋酸，2.5mol／L尿素），将样品溶于样品稀释液中，浓度为1g／L，100℃水浴3分钟后置于室温。以牛鱼精蛋白和相对分子质量Mr为17 500～94 000蛋白为标准品，每孔加样10μl，100V，20mA电泳6小时。电泳结束后凝胶用1%考马斯蓝染色1小时，用脱色液漂洗至无本底色。制成干胶，置于薄层扫描仪上扫描（450nm和550nm双波长，扫描束为0.05mm×2.0mm），计算精子核碱性蛋白的构成比。

（3）结果：

过高的TH／TBP与过低的HP2+3／HP1均是导致流产与不育的病因之一（表13-16）。

表13-16　正常生育组与不育组精子核碱性蛋白含量的比较（

±s）

5.精子DNA碎片检测

精子DNA检测是评估男性不育的重要方法之一。虽然目前DNA碎片检测被广泛使用，但是DNA碎片异常到底代表什么含义却知道的很少。目前有不同检测DNA碎片的方法。目前临床上一般精索静脉曲张的患者，以及精子质量接近正常最好需要行精索静脉结扎的患者建议行DNA碎片检测。反复自发性流产与增多的DNA碎片相关，精子中增多的DNA碎片也影响着不育患者辅助生殖的成功率。很多研究表明对于精液中精子存在较多DNA碎片的不育患者，可以通过睾丸穿刺取精，这样得到的精子DNA碎片较少。对于经常接触影响精子质量的危险因素的不育患者，检测DNA碎片有利于这些患者预防这些危险因素导致的不育（例如，停止吸引，抗氧化治疗等），还能够预测患者的生育能力及评估干预措施对患者是否具有明显的效果。

在所有不育因素中，男性的因素几乎占了一半。传统的精液分析已经不足以阐明不育的潜在因素。由于精液质量及数量的不稳定性很难确定临床上的治疗策略。精子功能的分析有助于了解精子是否能够穿过女性的生殖道，进行顶体反应及穿过透明带。

在过去的几十年里，很多研究不育的科学家们开始了对精子分子结构的研究。哺乳动物的受精及之后的胚胎发育很大程度都与精子DNA的完整性相关。精子DNA与鱼精蛋白紧密结合，避免在转移过程中受到损伤。有些损伤发生后，卵母细胞中的细胞质对这些损伤进行相应的修复，如果损伤的程度超过了卵母细胞的修复能力，那么就会导致不育。

体外及体内研究均表明精子DNA完整性与生育能力存在正相关。精子DNA碎片的增加将严重妨碍精子的受精、着床、胚胎的发育及妊娠。

导致精子DNA碎片形成的原因是多方面的。很多因素比如“精子生成过程中不正常的染色质重组，氧化应激的过度产生，精子抗氧化能力的下降，精子在附睾成熟的过程中发生凋亡”。长期接触环境中的毒素、污染物质、药物、化学物质、放射性物质等，以及吸烟、精索静脉曲张及老年等因素都会导致精子DNA碎片的增加。

目前通过2个原理检测精子DNA碎片，第一是通过探针和染料直接检测DNA碎片的多少；第二是检测DNA碎片发生的易感性。8种DNA碎片的检测方法见表13-17。脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）介导的三磷酸脱氧核糖核苷酸（dUTP）缺口末端标记短的用TUNEL（原位末端标记，ISEL），精子DNA分散试验（sperm chromatin dispersion test，SCD），精子染色质结构分析（sperm chromatin structure assay，SCSA）。这些试验的结果之间互相关联，并且与精子形态学、精子活力和精子存活率相关。这些试验可以给出有关标准体外受精的受精率，及有关于自然妊娠率的额外信息。精子染色质结构试验（SCSA）能够预示体内和体外的受精失败（Evenson&Wixon，2006）。尚不清楚这些试验与流产或其他妊娠结局是否存在相关性。

（1）吖啶橙试验：

吖啶橙是核酸选择性阳离子荧光染料，它通过插入到双链DNA中与其结合，通过静电吸引作用与单链DNA进行结合。当吖啶橙与双链DNA结合后，它会像荧光素一样发出绿光，当它与单链DNA结合后发出红光，通过检测精液标本中红光的多少就能确定精子DNA损伤的程度。快捷，简单，便宜是这个方法的优点，然而由于不同的实验室之间的差别，以及载玻片染色后出现很多不同的颜色，此试验的结果不够稳定。因此通过吖啶橙试验检测DNA碎片的结果是不可靠的。

（2）苯胺蓝染色：

苯胺蓝是一个酸性染料，它与非成熟精子细胞核中富含赖氨酸组蛋白进行结合而发蓝光，而成熟精子细胞核中富含精氨酸及胱氨酸的鱼精蛋白与其结合则不会发光，以此来鉴别松散的染色质。对DNA碎片进行鉴别。苯胺蓝染色的优点是简单、便宜，最大的缺点是结果不够稳定。

表13-17　精子DNA碎片检测方法

续表

（3）甲苯胺蓝染色：

甲苯胺蓝与精子DNA磷酸残基具有高度的亲和力，它能与损伤的染色质高度融合而显示出紫蓝色，只需要普通显微镜就可以完成此检查。然而很多中间颜色会干扰观察者，以至于结果具有不确定性。甲苯胺蓝染色试验与其他检测精子DNA的试验具有很好的一致性。

（4）色霉素A3染色：

色霉素A3是与鸟苷酸及胞嘧啶碱基对特异性结合的荧光染料，它同鱼精蛋白竞争性结合DNA相同位点。此试验结果如为阳性，则反映了染色质处于松散的状态。

（5）精子染色质结构分析：

精子染色质结构分析评估精子DNA在受热及酸性环境中变性的易感性。通过流式细胞仪可以快速高效的评估10 000个细胞中DNA的变化情况。吖啶橙染色后，通过流式细胞仪检测细胞从绿色转变为红色的数量来评估DNA损伤程度。精子染色质结构分析的优点是它有一套严格的检测标准，减少了由于试验人员观察时的误差。试验的临界值是30%。此检测的缺点是需要一台流式细胞仪，费用昂贵。

（6）TUNEL：

精液标本通过流式细胞仪及标准的荧光探针进行检测，此方法被认为是检测精子DNA碎片的金标准，Mitchell和他的同事们将TUNEL进行改良，减少不同试验人员的观察误差。在进行检测之前先用二硫苏糖醇进行处理，使整个染色质的结果变得松散，改良后的TUNEL是用台式流式细胞仪可以同时高效准确的检测多个标本。

（7）单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）：

彗星试验通过检测每个精子中DNA损伤的数量来测定精子DNA的损伤程度。彗星试验名称的由来是因为DNA碎片就像是精子头部流出来的东西，好比“彗星的尾巴”。通过染色而呈现的彗星尾巴的强度及程度代表了迁移的DNA数量，表明不同程度的DNA碎片损伤。这个检查的主要优点是适用于严重的少精子症患者，仅仅需要5000个精子就能完成检测。彗星试验还能检测单链及双链损伤。彗星试验检测时包含的信息量大，利用中性或是碱性电泳检测DNA不同类型的损伤。结果需要专业人士进行分析，不能快速诊断。

（8）精子DNA分散试验：

精子分散试验也称光晕试验。正常无DNA碎片的精子会出现具有特征性的分散的DNA光晕，而酸性变性及无核心蛋白的情况下，精子DNA碎片增加，则不会出现光晕，这就是光晕试验的由来。

将凝胶包被的精子放在使其变性的溶液中去掉核心蛋白暴露损伤的DNA，在电泳的时候，正常的精子会在精子的核心出现具有特征性的光晕（称为光晕效应），而损伤的精子则不会出现。

通过伊红染色和天青蓝B溶液进行染色，显微镜镜下可以看见光晕。DNA直接进行荧光染色需要荧光显微镜进行观察。此项技术简单，不需要复杂的仪器，与传统的精液分析相比，DNA碎片检测评估男性的生育状态更为精准，尽管如此，但是仍然有很多因素限制着此方法的广泛应用。人们对精子DNA损伤的本质目前仍然知之甚少，也不清楚每个试验具体检测的是什么。精子DNA碎片检测的准确性依赖于所应用的试验技术，同一份标本，实验室不一样，检测的结果也不一样。检测的临界值也没有完全清楚的界定。实验室及临床的环境如精子核去凝集程度及禁欲时间都会影响到精子DNA碎片检测结果。

6.活性氧检测

一般认为，过多的活性氧产生和存在高活性的胞质酶类（如肌酸磷酸激酶），可以反映出异常精子体部有过量残留胞质。

活性氧是氧的代谢物，包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧基、过氧羟自由基、氧化亚氮等。过高浓度的活性氧可以诱导细胞的脂类、蛋白和DNA氧化损伤，从而启动病理变化。大部分的细胞具有抵抗活性氧作用的系统，包括酶抗氧化系统（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶）和非酶抗氧化系统（尿酸、维生素C、维生素E），当精子中的抗氧化系统被破坏，精子功能就会受损。

人精液中的活性氧由精子和白细胞产生。精浆中含有自由基的抗氧化清除物和抗氧化酶，而有些男性则缺乏这些物质，所以，在辅助生殖技术中精子制备时，去除精浆会使精子更容易遭受氧化损伤。过多的活性氧产生导致氧化损伤和人精子功能受损，以及核和线粒体DNA的损伤。

采用鲁米诺（luminol）或光泽精（lucigenin）为探针的化学发光法，可用于检测人精子的活性氧生成量及氧化还原活性。

7.精子悬液活性氧的检测

（1）原理：

在该方法中，应用了敏感的光度计和化学发光探针（如鲁米诺），检测人精子所产生的微弱光信号。以下描述的方法是联合应用鲁米诺和辣根过氧化物酶来检测过氧化氢产生的敏感方法。其他探针（如光泽精）也可用于检测经洗涤人精液中生的活性氧。

由于人精子表面没有甲酰三肽（甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸，formylmethionyl-leucyl-phenylalanine，FMLP）受体，所以，应答于FMLP为探针所产生的信号是白细胞特异性的。可用含已知数量的多形核白细胞悬液来校准数据。

（2）试剂：

①Hanks平衡盐溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS），不含酚磺酞。②Krebs-Ringer液（Krebs-Ringer medium，KRM），不含酚磺酞：鲁米诺（25mmol／L）。③将29mg鲁米诺（5-氨基-2，3-二氢-1，4-二氮杂萘二酮）溶于10ml二甲亚砜（DMSO）中。④辣根过氧化物酶（Ⅵ型，310IU／mg蛋白）：取5mg（1550IU）溶解于1ml KRM液中。⑤FMLP（白细胞特异性探针，10mmol／L）：将44mg FMLP溶于10ml DMSO中。⑥PMA（12-十四酸佛波酯-13-醋酸盐，phorbol12-myristate 13-acetate），1mmol／L储存液：取6.2mg PMA溶解于10ml DMSO中。使用时，将1mmol／LPMA用DMSO稀释100倍，得到10μmol／L的工作液。⑦酵母多糖。⑧明胶：0.1%（1g／L），溶解于HBSS中。

（3）酵母多糖的制备：

①加500mg酵母多糖于10ml HBSS中，制成悬液。②剧烈涡旋振荡。③在加盖的烧杯中煮沸20分钟，以防蒸发。④以500g离心5分钟。⑤加10ml的HBSS洗涤沉淀团。重复操作4和5，再洗一次。⑥将沉淀团重悬于5ml的新鲜人血清中，轻柔吹打混匀。孵育20分钟。以500g离心5分钟。用10ml的HBSS洗涤沉淀。⑦再次以500g离心5分钟。用10ml的HBSS洗涤沉淀。⑧将沉淀团重悬于10ml HBSS（含0.1%明胶），使终浓度为50mg／ml，轻柔吹打混匀。⑨将配制的悬液冻存于-20℃待用。

（4）检测自发产生的活性氧：

①充分混匀精液标本，取一定体积的精液（含10 ⁷个以上精子）用于ROS检测。②用KRM液洗涤精子，并调整精子浓度为10 ⁷／ml。③取400μl洗涤后的人精子悬液，悬于不含酚磺酞的KRM液中，加入至一次性光度计容器中。小心操作，避免产生气泡。④加入4μl浓度为25mmol／L的鲁米诺。⑤加入8μl浓度为1550IU／ml的辣根过氧化物酶溶液。⑥在37℃下监测光度计的化学发光信号约5分钟，直至信号稳定。添加FMLP、酵母多糖和／或PMA，能够诱导精液中的白细胞产生活性氧，此外，PMA也能诱导精子产生活性氧。

（5）FMLP诱导白细胞产生活性氧：

取2μl浓度为10mmol／L的FMLP，加入上述样本中以诱导精子悬液中的白细胞产生化学发光信号。

（6）酵母多糖诱导白细胞产生活性氧：

取20μl经调理制备的酵母多糖混合液，加入上述样本中以诱导精子悬液中的白细胞产生化学发光信号。所产生化学发光信号的大小直接与精液中白细胞污染水平成比例。

（7）PMA刺激白细胞和精子产生活性氧：

①将PMA储存液用DMSO按1∶100的比例稀释成10μmol／L的工作液。②待FMLP或调理酵母多糖的信号减退。③加入4μl浓度为10μmol／L的PMA工作液处理精子悬液（终浓度为100nmol／L），刺激精子产生化学发光信号。

（8）结果：

通过观察人精子悬液的化学发光图形可间接分析精液中是否存在白细胞污染。

8.流式细胞仪测定精子活性氧

（1）试剂：

①ROS工作液；②1×Earle’s培养液；③DCFH-DA荧光探针；④PBS液。

（2）操作：

精液标本用PBS洗涤2次后离心（2000rpm×5分钟），PBS悬浮沉淀精子，调整精子密度为5×10 ⁶／ml，取以上精子悬液（5×10 ⁶／ml）100μl，加入500μl ROS工作液及400μl 1×Earle’s培养液，使DCFH-DA终浓度为5μmol／L，混匀后置于37℃、5%CO ₂培养箱中孵育20分钟，室温离心（2000rpm×5分钟）后收集精子，PBS洗涤两次，离心（2000rpm×5分钟），500μl PBS重悬沉淀精子，混匀，流式细胞仪检测（Ex=488nm，Em=525nm），每个样本测定10 000个精子。

（3）结果：

平均荧光强度即表示精子胞内活性氧含量。

（五）精子顶体反应及顶体酶活性测定

人精子顶体位于精子头前端，覆盖在精子核前面，由顶体帽与赤道板组成，是一个膜结合的帽状结构。顶体内含有多种蛋白水解酶和磷酸酯酶。获能的精子穿过卵丘细胞外基质时被激活引发顶体反应（acrosome reaction，AR），将顶体内的酶释放出来以溶解卵放射冠及透明带。精子在体内只有经过获能、顶体反应，才能穿入卵细胞与其融合，完成受精。因此，检测精子是否发生顶体反应，有助于预示精子的受精能力。

1.凝集素免疫荧光染色检测顶体反应

（1）原理：

精子顶体中含有大量糖蛋白，能与植物凝集素——豌豆凝集素（pisum sativum agglutinin，PSA）等特异性结合。钙离子载体A23187能诱导精子发生顶体反应。精子发生顶体反应后，顶体丢失。因此可利用能与糖基结合的PSA作为探针检测顶体反应。

（2）试剂：

①BWW液；②100mg／L氢澳酸罗丹明豌豆凝集素（TRITC-SPA），用0.1mol／L pH 7.4 PBS配制；③1mmol／L A23187溶液，用二甲亚砜（DMSO）溶解。

（3）操作：

取液化的精液1ml置于无菌洁净的玻璃试管中，上层轻轻加入5ml BWW液（含3.5g／L人血清白蛋白），45°倾角37℃上游30分钟。取上层活力良好的精子1000r／min离心10分钟，精子沉淀用BWW液调整至（1～10）×10 ⁶／ml。37℃孵育5小时，使精子获能。而后加入A23187使其终浓度为10μmol／L，37℃再孵育1小时，诱导精子顶体反应。1000r／min离心10分钟，沉淀用适量PBS悬浮后涂片，晾干，甲醇中固定30秒，迅速干燥。用TRITCPSA染色30分钟，蒸馏水冲洗后浸泡15分钟，晾干，荧光显微镜40倍油浸物镜下观察（G激发滤片／G双色分光组件，激发光谱0～545nm，0～515阻挡滤片）。

（4）结果：

镜下可见3种类型的精子：①顶体帽无荧光或仅核有荧光为发生顶体反应的精子；②顶体完整有荧光而核无荧光为顶体完整的活精子；③整个精子有荧光为死精子。计数100条精子中第1种类型精子的百分率。

2.考马斯蓝染色检测顶体反应

（1）原理：

精子获能后，经钙离子载体A23187诱导发生顶体反应。发生顶体反应后顶体丢失，顶体区不着色，顶体完整而被考马斯蓝染上紫蓝色的精子为没有发生顶体反应的精子。

（2）试剂：

①BWW液。②0.05%考马斯蓝：考马斯蓝50mg加入100ml 3.5%的高氯酸水溶液，煮沸溶解后过滤，置于棕色瓶内保存。③1mmol／L A23187溶液，用二甲亚砜（DMSO）溶解。

（3）操作：

精子获能，顶体反应同上。发生顶体反应的精子悬液1000r／min离心10分钟，沉淀用4%甲醛-PBS悬浮，固定10分钟。涂片，自然干燥，考马斯蓝染色30分钟，用蒸馏水冲洗后晾干，显微镜下观察。

（4）结果：

计数100条精子中顶体未着色（发生顶体反应）精子的百分率，即为顶体反应率。正常生育男子精子顶体发生率≥75%。

3.顶体状态荧光检测方法

这项方法由Cross等首先建立，随后Liu和Baker进行了改进。改良的方法更为简单，重复性好，而且获得非常清晰的图像。建议使用精子制备技术去除白细胞、生殖细胞和死精子等污染物，以获得高活力精子。因此需根据精液标本的质量，对标本进行洗涤或者密度梯度离心。

（1）试剂：

①PSA-FITC：豌豆凝集素（Pisum sativum agglutinin，PSA），用异硫氰酸荧光素（FITC）标记。②磷酸盐缓冲液（PBS），pH为7.4。③0.9%的氯化钠溶液（9g／L）：将0.9g氯化钠溶解于100ml水中。④95%（v／v）的乙醇溶液。⑤PSA储存液：将2mg用FITC标记的PSA溶解于4ml PBS中。以每管0.5ml分装，冻存于-20℃。⑥PSA工作液：将0.5ml PSA储存液稀释于10ml PBS中，储存于4℃备用（可存放4周）。

（2）简单的精子洗涤：

①充分混匀精液标本，取0.2ml。②用0.9%的氯化钠溶液（9g／L）稀释至10ml。③以800g离心10分钟。④弃去上清液，仅留下20～40μl上清液。⑤轻柔吹打，将精子沉淀团重悬于留下的上清液中。⑥重复以上精子洗涤操作步骤。

（3）已纯化精子的处理：

①用生理盐水将经过一次密度梯度离心的精子悬液稀释至10ml。②以800g离心10分钟。③弃去上清液，仅留下20～40μl上清液。④轻柔吹打，将精子沉淀团重悬于留下的上清液中。

（4）精子涂片制备：

①取5μl精子悬液，制成2张约1cm长的精子涂片。②确保精子均匀分布在玻片上而不聚集。③玻片在空气中晾干。④95%（v／v）乙醇固定30分钟。⑤玻片在空气中晾干。

（5）PSA-FITC染色：

①加10ml PSA-FITC工作液到平底染色缸内。②将已固定并在空气中干燥的涂片浸泡在PSA-FITC荧光染料中。③4℃，染色1小时以上。④用纯净水洗涤每张玻片，并且用可溶于乙醇的封片剂封片。

染色时间长（长至18小时）并不影响PSA结果，但染色时间短（不足1小时）难以评估结果。

（6）结果：

用450～490nm激发光激发，于400倍荧光显微油镜下观察精子涂片。结果分类如下：

顶体完整（acrosome-intact，AI）：精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀（图13-31）。

图13-31　精子顶体

已发生顶体反应（acrosome-reacted，AR）：精子仅在赤道带出现荧光带，或者顶体区根本没有荧光。

顶体异常：除上述两类精子外的所有其他精子。

4.诱导顶体反应的检测

顶体反应发生在精子与卵透明带结合之后的胞吐过程。且在精子穿透卵母细胞膜并与卵母细胞融合前，必然发生顶体反应。钙内流被认为是正常顶体反应的起始事件。使用钙离子载体诱导钙内流，是检测已获能精子发生顶体反应的能力的一种手段，也是本检测方法的理论基础。这种检测方法也称为离子载体激发的顶体反应试验（acrosome reaction after ionophore challenge，ARIC）。然而，在顶体状态检测作为一种常规临床检测前，尚需更多研究支持。

（1）试剂：

①Ham’s F-10 HSA培养液：含3.5%（35g／L）人血清白蛋白（HSA）的Ham’s F-10培养液）。②BWW储备液。③二甲亚砜（DMSO）。④钙离子载体A23187储备液（浓度为1mmol／L）：将5.23mg的A23187溶解于10ml的DMSO中。⑤3%（v／v）戊二醛或70%（v／v）乙醇。

（2）步骤：

①刚取出的新鲜精液标本放置30～60分钟，使之完全液化。②每次检测，配制新鲜的Ham’s F-10 HSA培养液。③培养液在使用前应预热到37℃，最好置于含5%CO ₂和95%空气的培养箱内进行孵育。④用新鲜的Ham’s F-10 HSA培养液，通过密度梯度法获得高活力精子团，去除如白细胞、生殖细胞和死精子等污染物。⑤准备1个对照管和2个重复检测管，每管约1ml精子悬液，内含1×10 ⁶个活动精子。⑥将精子悬液在37℃，5%CO ₂和95%空气的培养箱内孵育3小时（拧松管盖，使气体交换），诱导获能。如果没有CO ₂培养箱，可以用Hepes缓冲培养液，拧紧管盖，在37℃孵育。⑦向2个重复检测管中加入10μl浓度为1mmol／L的A23187储存液，使终浓度为10μmol／L。⑧对照管中加入10μl的DMSO。全部管置于37℃孵育15分钟。⑨从每管中取出少量悬液评估精子活力。加入100μl 3%（v／v）戊二醛或70%（v／v）乙醇，终止反应。⑩将已固定的精子涂片在洁净玻片上，空气中干燥。用荧光标记物染色精子用450～490nm激发光激发，400倍荧光油镜下评估结果。计算检测管（检测%AR）和对照管（对照%AR）中，已发生顶体反应的精子百分率。

（3）结果：

①离子载体激发的顶体反应（ARIC）结果为检测管已发生顶体反应的精子百分率减去对照管已发生顶体反应的精子百分率。②正常差异值约为15%AR。③如果低于10%AR则为异常。④数值介于10%和15%AR之间，提示精子功能可能异常。⑤如果对照管的数值＞15%，则提示过早发生了自发的顶体反应。

（4）质量控制：

①每次试验必须有阳性对照的质量控制标本［精子取自先前对离子载体反应良好的男性精液标本（已发生顶体反应的精子百分率＞15%）］。②在新配制的染料应用前，为确保每批新配制的染料配制适当，必须用已知阳性反应的质控精子同旧染料一起进行交叉试验。

5.明胶法测定精子顶体酶活性

（1）原理：

顶体酶含有多种蛋白水解酶。精子在明胶制成的薄膜上孵育后，引起顶体的解聚，释放出顶体酶，将明胶溶解形成亮环。酶活性的大小可依据形成亮环直径的大小来判断。

（2）试剂：

①34g／L明胶：3.4g明胶加双蒸水100ml，100℃溶解。②0.05mol／L，pH 7.0巴比妥钠盐酸缓冲液：1.03g巴比妥钠加蒸馏水溶解，用0.1mol／L HCl调至pH 7.0。③0.05%戊二醛溶液：用pH 7.0巴比妥钠盐酸缓冲液配制。④0.5%锥虫蓝水溶液。⑤0.01mol／L pH 7.4 PBS。

（3）操作：

①明胶膜的制备34g／L明胶100℃溶解后降至56℃，每张洁净的玻片上滴加1.0ml，立即推成薄膜。置于4℃冰箱3～5分钟呈凝胶状，转置室温干燥20小时。用0.05%戊二醛固定2分钟，后用pH 7.0巴比妥钠盐酸缓冲液洗2次，每次10秒，蒸馏水冲洗6次，用滤纸吸去水分，室温干燥1小时。用0.5%锥虫蓝水溶液染色10秒，用滤纸将多余的染液吸去。②精子顶体酶活性测定精液液化后2000r／min离心10分钟，去除上层精浆，精子用PBS洗2次后悬浮于PBS中。将上述悬浮液1滴滴加于制备好的明胶膜上，均匀涂开，37℃湿盒中孵育2小时。取出，自然干燥，显微镜下观察。

（4）结果：

阳性反应的精子镜下可见亮环，亮环直径表示酶活性大小。正常生育男子阳性率＞60%，亮环直径＞120μm。

6.精子精氨酸酰胺酶（顶体酶）活性测定

（1）原理：

精子精氨酸酰胺酶存在于顶体中，其活性可反映顶体酶全部活性。精氨酸酰胺酶以Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺（BAPNA）为底物，分解产生有色产物——硝酰基苯胺，通过测定硝酰基苯胺的产量可推算出精氨酸酰胺酶的活性。

（2）试剂

1）Ficoll溶液（pH 7.4）NaCl：

0.7g；Hepes：0.6g；Ficoll 400（聚蔗糖）：11.0g；加水至100ml。

2）Triton溶液（pH 8.0）NaCl：

0.32g；Hepes：1.31g；TritonX-100：1.0mg；加水至100ml。

3）终止液（苯甲脒）：

8.73g；加水至100ml。

4）BAPNA液（1份）：

5mg BAPNA用0.5ml二甲亚砜（DMSO）溶解，临用前配制。

5）反应溶液：

9份Triton溶液+1份BAPNA液。

（3）操作：

液化精液计数后按10×10 ⁷精子／管计算出所需精液量，加入0.5ml Ficoll溶液，2000r／min离心15分钟，弃尽上清液，用100μl Ficoll溶液悬浮，再按表13-18操作。

表13-18　顶体酶（精氨酸酰胺酶）活性测定操作步骤

反应结束后2000r／min离心15分钟，取上清液400nm测吸光度（A）值，以反应溶液调零。

（4）结果

精子顶体酶活性定义：24℃水解1.0μmol BAPNA／min为1IU顶体酶活性。肖春花等报道18例正常生育男子顶体酶活性为（29.7±14.3）×10 ⁶IU／10 ⁶精子。

（六）精子线粒体功能测定

精子线粒体位于精子尾部的中段，形成线粒体鞘结构。哺乳动物每个精子约含有75个线粒体。线粒体是精子运动能量提供的场所。线粒体鞘局部或完全缺失、线粒体的体积及分布异常，都可能使精子运动能力发生障碍而导致不育。在弱精子症和死精子症中，可见大量线粒体缺陷的存在。

1.NBT法检测线粒体功能

（1）原理：

琥珀酸脱氢酶（SDH）是线粒体标志酶之一，其活性的降低可影响精子能量代谢，造成精子运动能力下降。SDH可将琥珀酸氧化生成延胡索酸，脱下的H ⁺通过中间氢受体吩嗪甲基硫酸酯（PMS）将硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium，NBT）还原为二甲NFDC ₄，呈蓝紫色颗粒。

（2）试剂：

① 0.65mol／L Tris-HCl，pH 7.4：7.88g Tris溶于蒸馏水，用0.1mol／L HCl调整pH至7.4，蒸馏水定容到100ml。②中性甲醛溶液溶液：10ml 36%甲醛加90ml水，加入少量的CaCO ₃，用0.1mol／L HCl调整pH至7.0。③1g／L NBT溶液：用上述Tris-HCl配制。

（3）操作：

取1滴液化精液和1滴NBT溶液于1块洁净载玻片上，两者混匀，盖上盖玻片，湿盒中37℃孵育30分钟。取出后将液滴涂匀，自然干燥，中性甲醛溶液中固定2小时，蒸馏水漂洗，晾干，镜下观察。

（4）结果：

生育男子正常线粒体精子＞70%。

2.精子线粒体DNA检测

人类线粒体DNA（mtDNA）为双链闭环结构，全长16 569bp，分为重链和轻链，两条DNA链不含内含子，均具有编码功能。除编码tRNA和rRNA外，还编码ATP酶等与线粒体呼吸链相关的酶。成熟的精子每个线粒体一般只含一个mtDNA。许多研究表明，精子线粒体利用女性生殖道内的能源物质，通过氧化磷酸化产生大量的ATP，使精子运动能力明显提高，出现一种特有的运动方式，为完成穿卵受精过程创造了条件。因此，在生育过程中，精子射出后的泳动过程所需能量中，线粒体呼吸链起到一个重要作用。近年来，精子mtDNA与精子功能的关系引起了人们的关注，研究表明，mtDNA的缺失是导致精子运动能力降低的原因之一。

（1）试剂：

①TES缓冲液：15mmol／L Tris-HCl，pH 8.0；1mmol／L Na ₂EDTA，pH 8.0；15mmol／L NaCl；②5mol／L NaClO ₄；③10%SDS；④饱和酚溶液：饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1；⑤dNTPs（4种脱氧核苷三磷酸）；⑥PCR缓冲液；⑦引物。

（2）操作：

①精子DNA提取液化精液2000r／min离心15分钟，弃精浆，精子沉淀用生理盐水洗3次，弃尽上清液。沉淀用300μl TES缓冲液充分悬浮，加入80μl 5mol／L NaClO ₄，100μl 10%SDS，混匀，此时溶液混浊。37℃放置10分钟，溶液变清亮，而后65℃放置15分钟。加入等体积的饱和酚溶液，混匀。12 000r／min离心10分钟，取上清液，加2倍体积的-20℃无水乙醇，此时有絮状DNA沉淀出现。12 000r／min离心10分钟，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2～3次，弃上清液，真空抽干，用20～30μl双蒸水溶解。②PCR反应：反应总体积50μl，含200μmol／L dNTPs，0.2μmmol／L引物（一对），1U Taq酶，50mmol／L KCl，1.5mmol／L MgCl ₂，10mmol Tris-HCl（pH 8.3），DNA模板0.4μg。反应条件：95℃变性5分钟，加Taq酶，94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，循环30次，最后72℃延伸7分钟。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照射，观察结果。

（3）结果：

王咏梅等报道，100例男子不育组线粒体ATP合成酶基因（ MTATP8）的缺失率为15%，30例生育组精子中未检出MTATP8的基因缺失。因此，线粒体DNA的缺失是男子不育的病因之一。

3.线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位（MMP）丧失是细胞早期凋亡的征象，因此线粒体膜电位的改变是精子早期程序化死亡的有力证据。线粒体MMP的改变与精子活动力密切相关。

（1）试剂：

①PBS液；②JC-1工作液；③1×Incubation Buffer。

（2）操作：

①精液标本用PBS洗涤2次后离心（2000rpm×5分钟），PBS悬浮沉淀精子，调整精子密度为5×10 ⁶／ml，取以上洗涤处理后的精子悬液200μl，离心（2000rpm×5分钟）收集精子；②加入500μl JC-1工作液混匀，置于37℃、5%CO ₂培养箱中孵育20分钟，室温离心（2000rpm×5分钟）收集精子，用1×Incubation Buffer洗涤两次，取500μl 1×Incubation Buffer重新悬浮沉淀精子，混匀；③流式细胞仪检测，每个样本均测10 000个精子。JC-1单体和聚合物荧光信号分别在FL1和FL2探测器上获得。

（3）结果：

JC-1聚合物（Ex=488nm，Em=575nm）呈红色荧光表示线粒体膜电位正常，JC-1单体（Ex=488nm，Em=525nm）呈绿色荧光表示线粒体膜电位丧失。

4.线粒体膜功能检测

精子线粒体膜功能的好坏直接反映了精子的运动能力，用流式细胞仪（FCM）用于精子线粒体膜功能测定是一个新方法。

（1）试剂：

①罗丹明（Rh123）荧光染料；②碘化吡啶（PI）荧光染料；③PI和Rh123染液用蒸馏水配制为1g／L储存液；④PBS液。

（2）操作：

①将精液标本用PBS（0.01mol／L，pH 7.4）洗涤2次后离心（300g，5分钟）；②PBS悬浮沉淀精子，调精子密度为1×10 ⁶／ml，加入Rh123（终浓度10μg／ml），置于37℃水浴孵育10分钟，离心弃上清；③PBS重复洗涤离心2次，PBS悬浮，加入PI（终浓度10μg／ml）染色5分钟；④FCM检测，仪器状态设置：前向散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FL1（绿）和FL2（红）对数放大。

（3）结果：

测每个精子Rh123和PI的荧光强度，每份悬液检测10 000个精子，数据用CellQuest软件进行分析。

第四节　精浆的生物化学检查

目前，精液常规分析虽然已成为临床上评价男性生育功能的重要常规手段，但是男性不育是一个比较复杂的临床综合征。随着研究的深入，精浆中的生化指标越来越受到人们的重视，它不仅可以了解精浆中各种成分的主要组织来源，还可以反映睾丸、附睾及其他附属性腺的功能，及对精子质量的影响，对全面评价男性的生殖能力有着重要的临床实用意义。由于各个性腺分泌产物较多，本文针对目前在男性不育临床诊断中常用的具有临床意义的精浆生化指标作一评述。

一、睾丸及附属性腺的分泌功能

（一）睾丸的分泌功能

1.乳酸脱氢酶同工酶

乳酸脱氢酶同工酶C4（lactate dehydrogenase-C4，LDH-C4）仅出现在人和哺乳动物的成熟睾丸和各级精细胞中，是精子特异的一种同工酶，合成调节与雄性激素分泌相关，是精子能量的主要酶系之一，并具有一定的抗原性。LDHC4在精浆中的活性与精子密度、存活率、活动度和顶体反应等指标相关，并对生殖有破坏作用。近年研究发现男性不育及少精症患者精子内LDH-C4比正常生育者精子减少，不育症精浆中LDH-C4活性大于正常生育者。因此，测定其含量可以作为反映睾丸的生精功能状态，评价精液质量以及受精能力好坏的客观指标，同时也能反映精道是否通畅。

2.精浆转铁蛋白（transferring protein，Tf）检测

Tf是反映睾丸支持细胞功能的重要标志物。Tf是一种糖蛋白，精浆中80%Tf是由支持细胞分泌、合成，并利用Tf将血中的铁转移到生殖细胞内，促进其发育与成熟，其含量的高低影响精子的生成。不育患者精浆Tf含量与精子密度有关，正常精子密度的不育患者精浆Tf含量与精子顶体完整率有关，低浓度的精浆Tf可引起精子顶体完整率下降，从而影响精子的受精功能，导致不育。因此，精浆Tf可作为评价睾丸支持细胞或生精小管功能以及精子受精功能的一项重要指标。

（二）附属性腺的分泌功能

1.附睾的分泌功能

①左旋肉毒碱：肉毒碱在肝脏合成，经血运至附睾且不断浓缩，主要以游离态和乙酰化形式存在。精子在睾丸内产生后尚不成熟，既无受精能力，也无运动能力。随着精子从附睾头部运动至尾部和附睾腔液内左旋肉毒碱的含量逐渐增加，精子内肉毒碱的含量也相应增加，通过肉毒碱促进脂肪β-氧化，为精子提供能量，促进精子发育成熟，增强精子的运动活力和受精能力，但此时附睾尾部极高浓度的肉毒碱环境通过抑制成熟精子的过度运动，使其处于一个相对安静状态，有利于精子在附睾尾部的富集和贮存。因此，精浆中左旋肉毒碱水平的高低直接影响精子运动功能和男性生育能力。精浆左旋肉毒碱的测定对评价附睾功能很有参考意义。②中性α-葡糖苷酶：在精浆中存在两种α-葡糖苷酶的异构体，其中主要的是仅来源于附睾的中性α-葡糖苷酶，另一种含量较少的酸性α-葡糖苷酶主要来源于前列腺。附睾分泌的中性α-葡糖苷酶可催化多糖或糖蛋白中的碳水化合物分解为葡萄糖，为精子代谢和运动供能，其活性高低可直接影响精液质量，与精子成熟、前向运动和精子受精能力呈正相关。在某些病理状况下，如附睾炎、输精管道阻塞时，精浆中该酶表现为含量减少和活力降低。在反映附睾功能失调方面，中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱更具特异性和敏感性。③γ-谷氨酰转肽酶（γglutamyl transpeptidase，γ-GT）：精浆γ-GT在附睾头部含量比较高，高活力的γ-GT能催化水解谷胱甘肽，生成的γ-谷氨酰能与附睾头部含有的高浓度的游离氨基酸和肽结合，实现跨精子膜转运。当附睾有疾患时，其分泌和浓缩能力下降，γ-GT的活性也随之降低，影响游离氨基酸和重要肽的跨膜转运，导致精子发生成熟障碍和精子运动能力下降；另一方面，当附睾头-体部交界处或头部以下部位发生阻塞时，γ-GT的活性也可下降，因此，γ-GT可作为附睾头部的功能性指标之一。

2.精囊腺的分泌功能

①果糖：精囊所分泌的特征性物质果糖是精子能量的主要来源，其直接参与精子的获能和受精。精浆果糖含量受血中睾酮水平的影响，雄激素不足可造成果糖含量降低，因此精浆果糖除了用于判断精囊腺分泌功能外，还能间接反映睾丸间质细胞分泌T的功能，对判断男性生育力具有重要意义。临床多用校正果糖浓度作为判断精囊腺功能：A.阻塞性无精子症患者精浆果糖含量偏低，其中输精管和精囊缺如患者的精浆果糖含量几乎为0；B.非阻塞性无精子症患者精浆果糖浓度高于正常生育者，可能与精子利用果糖能力下降有关；C.精囊炎症后引起精囊萎缩，以及相对性雄激素缺乏，可使精浆果糖降低，D.不完全性射精或射精过频，亦可导致果糖含量降低；E逆行射精的辅助诊断，射精后取膀胱尿液（含精液）作果糖测定。②前列腺素（prostaglandin，PG）：PG广泛分布于机体内的各种组织和体液中，但在精液所含PG种类最多，浓度最高，已知人精液中包括15种PG，其中对男性生殖系统作用明显的是PGE ₂和PGF2α。PGE ₂能刺激细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）增加，增加精子活力，而PGF2α能减少cAMP或增加环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），抑制精子活力。PG通过干扰睾丸血管功能、刺激睾丸生精小管类肌细胞收缩和抑制睾酮产生，起到抗精子发生作用，与精子密度有相关性。精浆中PG含量受睾酮的调节，反过来PG对睾酮的产生也有一定的影响。此外，PG通过对输精管平滑肌、女性生殖道平滑肌和阴茎海绵体肌都具有收缩功能，从而亦起着促进精子输送、促进精子穿过宫颈黏液和增强阴茎勃起和射精等生理功能。

3.前列腺的分泌功能

精液中的锌、枸橼酸和酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）的含量是前列腺分泌功能的可信检测指标，而且他们之间存在很好的相关性。①锌：前列腺是体内含锌量最多的器官之一，正常人精浆内锌含量为1.2～3.8mmol／L，为血浆中含量的100倍，这也反映了精浆锌对维持精子活动功能的重要性。精浆锌对男性生殖功能有非常重要的作用，主要表现在：影响睾丸间质细胞功能；延续精子细胞膜的脂质氧化，维持细胞结构稳定性和生理通透性，精子从而保持良好的活动度；维持精子染色质的稳定性；清除由白细胞和有缺陷的精子产生的氧自由基，减少氧自由基对精子的毒性；以及抗细菌感染等方面。故精浆锌含量可作为前列腺功能的指标之一。②枸橼酸：精浆中枸橼酸含量较高，几乎全部来源于前列腺，在精浆中的含量为1.4～6.3mmol／L，枸橼酸具有很强的缓冲作用，对维持精浆的渗透压平衡和适度的pH起着重要作用，但对精子代谢无明显影响。枸橼酸的生成受雄激素调控，其含量也间接反映血清睾酮水平。精浆中枸橼酸含量测定对检测前列腺功能和男子性功能有一定参考价值。高枸橼酸伴少精液症，提示精道梗阻但未涉及前列腺；低枸橼酸说明精道梗阻并涉及前列腺。③ACP：ACP是具有碳水化合物成分的涎蛋白，是典型的细胞分泌的糖蛋白，其作用是催化磷酸酯键水解。它存在于全身各组织，在前列腺中的含量尤为丰富，精浆ACP活力的高低可以反映前列腺功能，也可以反映出精子密度和精子活力的改变，因此，其在精浆中的含量变化可以作为反映前列腺功能的一个重要指标，并且与枸橼酸、锌之间有非常显著的相关性。

（三）异常分泌的特异性标记物

1.弹性硬蛋白酶

生殖道感染是男性不育诊断中最重要的内容之一，除了炎症能引起组织功能和形态改变外，还可以引起精液中白细胞分泌大量的氧自由基，导致梗阻性无精子症或附睾功能障碍；微生物直接毒性作用或激活白细胞产生抗精子抗体；炎症除了影响性腺功能外，还会引起射精障碍等诸多问题。弹性硬蛋白酶是炎症过程中由多形核中性粒细胞（polymorphonuclear leukocytes，PMN）分泌的一种蛋白酶，与随后分泌的α1-蛋白酶抑制剂结合，形成PMN-α1-蛋白酶抑制剂复合物，该复合物浓度与PMN释放量高度相关，所以被认为是男性隐匿性生殖道炎症标记物。＜250ng／ml时，提示为正常，无炎症存在；290ng／～1000ng／ml时，为中度炎症；＞1000ng／ml时，为重度炎症。除了诊断男性不育症之外，检测该复合物还能帮助诊断前列腺及其他附性腺器官细菌性炎症，以及诊断夫妇双方生殖道炎症及预后判断，而且可以动态监测疗效。精浆弹性硬蛋白酶不仅可作男性生殖道感染的指标，同时在评估男性生育力、男性不育症的诊断和治疗以及精子功能的研究方面都有着重要的临床意义。

2.超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种含锌、铜的酶蛋白，是体内最重要的活性氧自由基清除剂和自由基连锁反应的阻断剂，能抑制氧自由基引起组织损伤的主要环节-脂质过氧化反应。超氧化物歧化酶在生殖器官代谢活跃，当其活性低下时，清除氧自由基的能力降低，氧自由基可攻击精子细胞膜而发生脂质过氧化，导致精子活力的丧失或精子的死亡。当SOD活性过高时，过度清除氧自由基，则不能提高精子细胞内cAMP水平，影响精子获能和顶体发生率，造成精子功能受损。因此精浆SOD活性改变是男性不育的主要原因之一，精浆SOD活性可作为反映精液质量的一项生化指标。细胞因子：精浆中细胞因子是由男性泌尿生殖道内的各种细胞分泌，如转化生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白介素（interleukin，IL）及某些可溶性受体等。现已明确，与男性不育相关因子主要是IL-6和IL-8，不育者之IL-6和IL-8明显高于生育力正常者。

二、精浆生化指标检测的临床意义

上述精浆生化标志物分别反映睾丸及其附属性腺的分泌功能，各项指标都具有如上所述的临床意义。因此，精浆生化指标检测有如下临床意义：①对精浆生化标志物分别进行不同的组合项目分析，有助于分析无精子症、少精子症、弱精子症、畸形精子症和精液液化异常的病因，特别适合输精道梗阻的定位诊断，不同梗阻部位的异常生化指标表现为：A.睾丸部位：LDH-C4含量减少；B.附睾部位：中性α-葡糖苷酶含量降低，γ-谷氨酰转肽酶降低提示为附睾头部梗阻；C.精囊部位：主要为精浆果糖含量降低或为零；D.前列腺部位：精浆主要表现为低枸橼酸、低酸性磷酸酶、低锌水平；E.射精管部位：中性α-葡糖苷酶含量和果糖含量降低或为零。精浆生化检测结合病史、体检、超声影像学、精液常规分析和内分泌等检测，针对不同临床表现，进行不同组合检测，有逐步取代传统的创伤性检测（输精管造影术）的趋势。②协助评价睾丸生精功能和精子质量，例如LDH-C4、Tf和SOD等指标。③可作为睾丸及附属性腺疾患治疗和疗效评价的指标。

随着分子生物化学技术的发展，新的更具特异性的精浆生化标志物和新的更先进的检测方法会不断涌现出来，精浆生化检测在临床上日益广泛的应用，其临床应用价值也将会越来越显著。

第五节　精液的免疫学检查

不孕（育）的原因是非常复杂的。免疫学因素的参与和某些患者的发病有密切关系。在男子和女性患者都可能出现的抗精子抗体，对精子有制动和细胞毒作用。在女性出现的抗透明带抗体，可阻止精子对卵细胞的附着和穿透；抗子宫内膜抗体则可阻止受精卵的着床。一些自身免疫病，如甲状腺功能亢进、原发性甲状腺功能减退、桥本甲状腺炎、全身性红斑狼疮（SLE）患者，多有性功能的异常和／或不育。这些患者血清中也都存在各自特异的标志性自身抗体。检测这些自身抗体，有助于对男子病特别是男子不育症的综合分析或辅助诊断。

一、抗精子抗体

早在1899年Metchnikoff及Landsteinr发现，将异种动物精子注入机体可产生抗体。次年，Metchnikoff证实豚鼠在注射自体精子后，血液中有抗精子抗体存在。人类精子抗原相当复杂，约有100种，按其细胞定位，可分为核抗原、胞质抗原、膜固有抗原、包被抗原；按其特异性分为精子特异性抗原和精子非特异性抗原。

（一）精子抗原

特异性精子抗原：受精抗原1（fertilization antigen-1，FA-1）；受精抗原-2（fertilization antigen-2，FA-2）亦为精子膜抗原；卵裂信号-1（cleavage signal-1，CS-1）；精子／滋养层交叉反应抗原（sperm／trophoblast cross-reacting antigen，STX-10）；乳酸脱氢酶-C4（LDH-C4）相对分子质量（Mr）约为140 000，由4个C亚单位组成；兔精子膜自身抗原（rabbit sperm membrane autoantigens，RSA）为酶性凝集素样蛋白；鼠精子抗原-63（mouse sperm antigen-63，MSA-63）；鼠-29抗原（mouse-29 antigen，M-29）；PH-20：豚鼠PH-20的相对分子质量为64 000，定位于精子胞质膜上，顶体反应后出现于顶体内膜上；PH-30，是一种精子膜糖蛋白，具有细胞膜的外胞质融合作用；胚细胞抗原-1（germ cell antigen-1，GA-1），为精子膜蛋白；精子蛋白-10（sperm protein-10，SP-10）；YWK-Ⅱ相关抗原：YWK-Ⅱ是一种具有精子凝集作用的单抗，间接免疫荧光显示该单抗的相关抗原定位于精子中段、尾段和精子头赤道部的表面。顶体素原结合蛋白；钙结合蛋白（calbp）等。

非特异精子抗原：肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase，CPK）；甘露糖配体受体（mannose-ligand receptors，MLR）；C-myc蛋白；C-ras蛋白；G蛋白；膜磷酸酪氨酸蛋白（membrane phosphotyrosine protein，MPP）。其他精子抗原有：顶体素（acrosin）；ABO血型抗原；HLA抗原；鱼精蛋白（protamine）；精子膜抗原（sperm-coating antigens，SCA），又称scafferrin，是一种包被精子表面的抗原，来源于精囊等。有人用单抗从精浆中提取到Mr为70 000、64 000、60 000三种蛋白质，可与不育者血清反应。

精子固有的细胞膜抗缘由种属特异性抗原、组织相容性抗原（HLA，H-y，F9）等构成，其中器官特异性抗原可引起同种和自身精子免疫反应。此外，精子的特异性酶是细胞膜上的乳酸脱氢酶（LDHC4）和酶前体acrosin（顶体蛋白），它们的相应抗体可引起受精障碍。

精子对女性是一个同种异体抗原，性交活动可视为一个反复注射抗原的过程。射入阴道内的精液中，可溶性抗原可被阴道黏膜吸收，精子及其附着的精浆抗原可被巨噬细胞摄取，经过抗原识别，诱发全身或局部的免疫应答。当然，由于精浆免疫抑制物和其他抑制因素的存在，这种情况在绝大多数健康妇女不会发生。

输精管结扎患者血清中可出现抗精子抗体。术后半年阳性率及抗体滴度均明显增高。睾丸活检后也可产生抗精子抗体。此外，其他原因所致的输精管阻塞、睾丸的损伤和炎症、附睾等副性腺的感染，均可造成精子抗原外溢，与机体免疫系统发生反应而产生抗精子抗体。

抗精子抗体可使精子制动或黏附在宫颈黏液上而难以通过子宫颈，也可抑制精子顶体的活性，使精子不易穿透包绕卵细胞的卵丘、放射冠和透明带，阻碍了精子与卵细胞的融合，甚至导致胚胎死亡和流产。抗精子抗体按其对精子的作用分为凝集性、制动性与结合性三类；精子凝集抗体有头对头、尾对尾及混合型三种。以荧光抗体法检查，可将精子制动抗体区别为顶体、中体、后核帽、中片、尾及尾尖等几种。

（二）测定抗精子抗体的方法

测定抗精子抗体的方法，目前常用荧光抗体法、浅盘微量凝集法、伊红Y染色法、试管玻片凝集法、固相酶染色法、免疫洗选法（panning）、免疫珠法、ELISA法等。

1.试管-玻片凝集试验

（1）检测对象：

凡检测抗精子抗体的夫妇，均应询问病史、年龄，了解婚后不育时间，有无习惯性流产或死胎病史，以排除器质性原因，如精索静脉曲张、前列腺炎、附睾炎、子宫颈炎、附件炎等。

（2）试剂：

pH 7.4 0.01mol／L PBS：NaCl 8.5g，KH ₂PO ₄0.2g，Na ₂HPO ₄·12H ₂O 2.9g，KCl 0.2g，用蒸馏水溶解后补足1000ml。

（3）操作：

①收集禁欲1～2天的精液，自行液化，用PBS洗3次。通过4号注射器针头，使精子分散。用PBS配成5×10 ⁷／ml精子悬液。②夫妇双方血清56℃灭活后各取0.1ml，加0.2ml PBS，再加精子悬液0.1ml（血清稀释度为1∶4）；阴性对照管取精子悬液0.1ml，加PBS 0.3ml，37℃水浴1小时，轻轻混匀、滴片，加盖玻片镜检。

（4）结果：

出现3条以上精子头对头，或尾对尾，或头尾结合即为凝集。观察10个视野（400×）有5个以上视野出现凝集即为阳性。

2.混合细胞凝集反应

（1）　试剂：

① pH 7.4 0.01mol／L PBS：NaCl 8.5g，KH ₂PO ₄0.2g，Na ₂HPO ₄·12H ₂O 2.9g，KCl 0.2g，加蒸馏水至1000ml。②人IgG用阴离子交换剂提取纯化。③O型人红细胞（Rh阳性）或绵羊红细胞用125U／ml肝素抗凝。④羊抗人IgG将纯化人IgG加福氏完全佐剂后，给绵羊四肢悬蹄注射，每次IgG总量5～10mg，每周1次共4次。经预试验效价合格后，自绵羊颈动脉采血，分离血清即为羊抗人IgG。无条件自制时，也可从生物制品研究所购买。

（2）操作：

检测待测精子表面有无结合的抗精子抗体（直接法）。①取O型人红细胞或绵羊红细胞，用pH 7.4 PBS洗3次，配成4%红细胞悬液，加经预测合格的人IgG，在磁力搅拌器下滴加等体积的1%戊二醛，室温放置15分钟，PBS洗3次，恢复原细胞浓度。②取载玻片1张，依次滴加新鲜液化精液1滴，羊抗人IgG血清1滴，4%致敏红细胞1滴，充分混匀，盖上盖片，用光学显微镜（物镜40×）观察结果。结果，致敏红细胞表面吸附3条以上精子，形成可动的细胞集团，强阳性几乎看不到自由活动的精子。

检测待测血清、精浆、宫颈黏液中抗精子抗体（间接法）。①生育男子提供的精液（活率＞70%以上）用Baker缓冲液（葡萄糖3g，Na ₂HPO ₄·12H ₂O 0.6g，NaCl 0.2g，KH ₂PO ₄0.01g，加水至100ml）洗2次，校精子浓度为6×10 ⁷／ml。②取50μl待测血清，加50μl精子悬液，37℃水浴1小时，再用Baker缓冲液洗2次。③以下操作同直接法。

（3）结果：

精子与致敏红细胞结合形成可动的混合集团为阳性，强阳性反应几乎看不到自由活动的精子。阴性结果无混合凝集团可见，红细胞可凝集，但精子则自由游动。

3.免疫珠结合试验

免疫珠结合试验原理和方法同混合细胞凝集试验。采用包被羊抗人IgG、IgA的亲水性聚丙烯酰胺珠（免疫珠）来检测精子表面结合抗体，或待测血清（宫颈黏液）中的抗精子抗体。

（1）操作：

直接法（Jones法）测精子表面结合抗体。①新鲜待测精液1滴，一式3份，分别加1滴最适稀释度的羊抗人IgG、IgA、IgM包被的免疫珠悬液，混匀加盖玻片。②置湿盒1小时，然后在光学显微镜下观察。

（2）间接法：

测精浆或血清、宫颈黏液中各Ig类别的抗精子抗体。操作方法同混合细胞凝集试验间接法。

（3）结果：

如果每高倍镜视野下可见免疫珠黏附到2～3个以上能动的精子，试验为阳性。

4.浅盘凝集试验（TAT）

（1）试剂：

①液体石蜡（AR）。②0.01mol／L pH 7.4 PBS：配方同前述。

（2）操作：

①选用精子活率＞70%的生育男子精液，用0.01mol／L pH 7.4 PBS调整精子浓度为5×10 ⁷／ml；②待检血清用0.01mol／L pH 7.4 PBS作1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀释；③将浸泡在无水乙醇中的浅盘（6×3个小室）取出，棉布擦干，加液体石蜡50μl覆盖每个小室，再分别取稀释的血清5μl和精子悬液1μl通过石蜡层注入小室。室温18～25℃放置3～4小时，观察结果。

（3）结果：

用倒置显微镜（400×）观察每个小室的凝集情况。

5.伊红Y染色法

（1）试剂：

①50g／L伊红Y（Eosin Y）用蒸馏水配制；②0.01mol／L pH 7.4 PBS。

（2）操作：

①收取有正常生育能力的男子精液，选择精子计数＞0.6亿／ml，精子活率在70%～80%。无白细胞者，用PBS洗2次，配成5×10 ⁷～6×10 ⁷／ml精子悬液；②取精子悬液16μl分注于载玻片漆孔（2个测定孔，2个对照孔）内，测定孔中各加夫妇的待测血清20μl，新鲜人AB型血清（补体）4μl；对照孔不加补体。置加盖塑料盒内，37℃水浴30分钟后，各孔加50g／L伊红Y4μl，加盖玻片继续温浴2分钟，高倍镜下观察。

（3）结果：

活精子不着色，死精子染成红色。计数200条精子中死精子百分率，以测定孔死亡精子百分率减对照孔死亡精子百分率，为杀精子抗体百分率。也可用活体染色剂锥虫蓝染色检测杀精子抗体，其步骤与伊红Y染色相同，染液为20g／L锥虫蓝12μl，温浴时间60分钟，活精子不着色，死精子染成蓝色。

正常参考值生育能力正常的夫妇，杀精子抗体百分率≤9%，以≥10%为阳性。

6.固相酶染色法

（1）试剂：

①辣根过氧化物酶标记的羊抗人（IgG Fab′） ₂片段［HRP-羊抗人IgG F（ab′） ₂］：用方阵滴定法选择最适浓度。②底物溶液3.3′-二氨基联苯胺盐酸盐5mg，先用0.1ml二甲亚砜助溶，再加0.01mol／L pH 7.4 PBS 5ml，3%H ₂O ₂0.05ml，临用前配制。③糜蛋白酶，用等渗盐水配成2.5mg／ml，用于不液化的精液。

（2）操作：

①液化的新鲜精液离心后弃去上清液，沉淀用PBS洗3次，配成5×10 ⁷／ml精子悬液，通过4号注射器针头使精子分散。②夫妇双方成对检测，用丈夫精子悬液涂片一式2份，室温自然干燥，甲醇固定10分钟后，再分别加夫妇血清，37℃湿盒30分钟，PBS洗3次，晾干。③加1∶1000稀释的HRP-羊抗人IgG F（ab′） ₂，37℃湿盒30分钟，PBS洗3次后加新鲜配制的底物溶液，37℃湿盒反应15分钟，洗3次，吹干。

（3）结果：

油镜下观察，精子呈棕黄色为阳性；精子不着色或极淡黄色为阴性。

7.酶联免疫吸附法（ELISA）

（1）试剂：

①人精子膜抗原：取20份正常生育男子的精液，液化后，用PBS洗5次，将沉淀的精子混悬于含0.5%NP-40 Tris-HCl缓冲液中，置4℃ 1小时，18 000r／min离心30分钟，上清液测定蛋白量，即为精子膜抗原。②0.01mol／L PBS（pH 7.4）。③辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG（HRP-羊抗人IgG）：自制或从生物制品单位购买，最适浓度用方阵法滴定。④底物溶液：称取邻苯二胺（OPD）4mg，加5.14ml 0.2mol／L Na ₂HPO ₄·12H ₂O，再加0.1mol／L枸橼酸4.86ml，加3%H ₂O ₂50μl。临用前配制。

（2）标本保存与处理：

①血清：静脉抽血约3ml，分离血清，如不当天检测，请置于-20℃保存待检。检测时按6倍稀释（即100μl标本稀释液加血清20μl）。②精浆：待精液完全液化后，2000r／min离心10分钟，取精浆置-20℃保存待检。检测时按2倍稀释（即50μl标本稀释液加精浆50μl）。如果精液不液化或黏稠度高时，可用双层滤纸过滤或加入1滴糜蛋白酶，用生理盐水配制成2.5g／L。③宫颈黏液：无菌棉拭子蘸取宫颈黏液后，加入0.5ml生理盐水，尽量将拭子上的宫颈黏液挤出，置-20℃保存待检。检测时按2倍稀释（同精浆）。

精浆和宫颈黏液中的AsAb主要为AsAb-IgG和AsAb-IgA类别，建议同时检测这2种类别抗体。

（3）操作：

①将已包被的微孔板及所有检测试剂置于室温下平衡30分钟，同时配制标本稀释液（含5%小牛血清的PBS-T）。②根据不同待测标本，每孔加标本稀释液100μl或50μl，阴、阳性对照孔不加，空白对照孔加100μl标本稀释液。③依次加入标本（血清20μl，精浆和宫颈黏液50μl）和100μl阴、阳性对照。④42℃温育40分钟。⑤用PBS-T洗板4次，每次3分钟。⑥拍干后每孔加入2滴酶结合物。⑦42℃温育40分钟。⑧同步骤5，洗涤、拍干后加显色液A、B各1滴。⑨混匀后避光反应10分钟。加终止液1滴，混匀后以空白孔调零，450nm测吸光度值，P／N≥2.1为阳性。也可以不加终止液，直接肉眼判断（与阳性对照比较）。

8.间接荧光抗体试验

（1）试剂：

①羊抗人IgG-FITC（异硫氰酸荧光素）：最适稀释浓度经预试选定。②甲醇：AR级。

（2）操作：

取生育力正常的男子精液，液化后用PBS洗3次，使精子浓度为5×10 ⁷／ml，涂于载玻片上，每片涂膜2个，室温自然干燥，甲醇固定10分钟，涂膜上分别加夫妇血清（1∶16～1∶64），37℃湿盒30分钟，于PBS中浸洗5次，每片3分钟，加入经预试的羊抗人IgG-FITC，37℃湿盒30分钟，蒸馏水冲洗，晾干。

（3）结果：

荧光显微镜下观察，精子头部、中段出现荧光为抗精子抗体阳性。正常生育夫妇效价≤1∶16，故以≥1∶32为阳性。

9.补体依赖法（精子制动试验）

（1）试剂：

取生育男子的新鲜精液（精子活动率＞70%），液化后用PBS洗涤精子，并稀释至5×10 ⁷／ml；混合3～5只豚鼠新鲜血清，分装安瓿，-30℃保存作为补体来源；抗精子抗体阳性患者血清或兔抗人精子血清（RAHS），工作浓度经预试选定（选取在补体存在下能使90%左右精子制动的稀释度）；正常人血清（NHS）56℃灭活30分钟，作为无制动活性的阴性对照，经56℃灭活的不育夫妇待测血清。

（2）方法：

取小试管5支分别编号。1号为检测管，依赖补体制动抗体；2号为检测管，不依赖补体制动抗体；3号为等渗盐水对照；4号为阴性对照；5号为阳性对照。按表13-19进行操作。37℃水浴1小时后，光学显微镜观察。

表13-19　精子制动抗体检测操作程序

（3）结果：

每管取1滴混合液于载玻片上，用光学显微镜（物镜40×）观察10个视野，计数200条精子中活动精子，算出精子活率。按下式得出精子制动抗体值（sperm immunolizing value，SIV）：

以SIV≥2.0为精子制动抗体阳性。

10.免疫洗选法

（1）试剂：

①人IgG：用阴离子交换剂提取纯化，方阵滴定选择最适浓度。②羊抗人IgG：用人IgG免疫绵羊获得。可自制，也可从生物制品研究所购买。③5%小牛血清-PBS。

（2）操作：

取24孔聚苯乙烯反应板，用预先选定的最适浓度的人IgG（0.01mol／L pH 9.6碳酸钠缓冲液稀释）包被，每孔0.25ml。4℃过夜后，用0.01mol／L pH 7.4 PBS洗3次，再加入经预试选择的羊抗人IgG工作浓度0.25ml，37℃水浴1小时，PBS洗3次备用。

液化新鲜精液（可用自身精液）离心弃上清液，沉淀的精子用PBS洗3次，再加5%小牛血清-PBS校正精子数为5×10 ⁶／ml。取精子悬液0.2ml与0.2ml待检血清在试管中混合，再加5%小牛血清-PBS 0.4ml，37℃水浴1小时，重复洗涤后恢复至原体积（0.8ml）。取0.25ml加到上述已包被的聚苯乙烯板孔中，37℃ 1小时，洗涤后用倒置显微镜观察结果。精子大量附着于孔底为阳性，孔底无或仅有数个散在精子者为阴性。阴性对照孔加入未与待测血清作用的精子悬液。

同时用试管-玻片凝集法、免疫洗选法、固相酶法检测生育夫妇、不育夫妇血清中的抗精子抗体，结果见表13-20。

表13-20　三种检测抗精子抗体方法的比较

11.混合抗球蛋白反应（MAR）

混合抗球蛋白反应（MAR）试验是一项廉价的、快速和敏感的筛查试验但它提供的信息少于直接免疫珠试验。在MAR试验，“桥连”抗体（抗IgG或抗IgA）介导包被了抗体的微珠与精液中未洗涤精子表面露出的IgG或IgA的接触。直接IgG和IgA的MAR试验，是用未经处理的新鲜精液，与包被人IgG或IgA的乳胶颗粒（微珠）或处理过的红细胞相混合。向悬浮液中加入特异性的抗人IgG或抗人IgA。颗粒与活动精子之间形成混合凝集，提示精子表面存在IgG或IgA抗体（微珠之间的凝集作为抗体-抗原识别的阳性对照）。

（1）步骤

1）充分混匀精液标本。

2）吸取3.5μl精液2份，分别滴在2张载玻片上。

3）每次直接试验，包括1张滴上3.5μl抗精子抗体阳性精液玻片和1张滴上抗精子抗体阴性精液玻片作为对照。对照精液应该分别从先前直接MAR试验显示带有和不带有抗精子抗体的男性中获取。另一种方法是通过与已知含有抗体的血清相孵育来产生阳性精子。

4）加3.5μl包被了IgG的乳胶颗粒（微珠）至每滴待测精液和对照精液中，并用移液器吸头搅匀。

5）加3.5μl抗人IgG抗血清至每滴精液-微珠混合液中，并用移液器头搅匀。

6）在混合液上放置盖玻片（22mm×22mm），以使液层深度约为20μm。

7）室温下在湿盒内水平放置玻片3分钟（例如，放在带盖培养皿内浸透水的滤纸上），以避免干燥。

8）3分钟后，用相差显微镜，在200或400倍镜下检查湿片。10分钟后再检查1次。

9）用包被IgA的微珠替代包被IgG的微珠，用抗IgA抗体替代抗IgG抗体，重复上述步骤。

（2）观察结果：

如果精子表面有抗体，乳胶微珠会黏附到精子上。开始时会看到，活动精子附着几个或一团颗粒在泳动。后来凝集团变得很大，以致严重抑制精子运动。而没有包被抗体的精子在颗粒之间自由地泳动。

这项试验的目的是测定黏附有微珠的活动精子的百分率。出现的一个普遍问题是非前向运动精子靠近微珠，但是没有黏附上去。这些微珠是否能够黏附到精子上，通常用小的移液器头轻轻地叩击盖玻片来检验：微珠移动与精子的活动一致提示有阳性结合。

仅评定活动精子和测定黏附有2个或2个以上乳胶颗粒的活动精子的百分率。忽略精子尾尖的结合。为了获得可接受的低取样误差，每次重复测试至少评价200个活动精子。计算黏附有颗粒的活动精子的百分率。

记录免疫球蛋白的类型（IgG或IgA），以及乳胶颗粒结合到精子的部位（头、中段、主段）。忽略精子尾尖的结合。

如果3分钟100%的活动精子结合上微珠，将此数值作为试验的结果；

不需10分钟后再次计数。如果3分钟＜100%的活动精子结合上微珠，10分钟后再次对玻片计数。如果精子在10分钟不再活动，取3分钟时的数值作为试验结果。

目前，尚没有来自有生育力男性精液MAR实验的结合抗体精子的参考值。在新证据出现之前，仍保留将50%活动精子黏附颗粒作为临界值的一致观点。当50%或更多的活动精子有抗体结合上去，精子穿透宫颈黏液和体内受精有显著抑制的倾向。颗粒仅黏附在尾尖，与生育力降低无关，有生育力男性中也存在这种情况。

二、抗胰岛素抗体

糖尿病尤其是胰岛素依赖性糖尿病患者，血中经常可测出此抗体。鉴于某些患者不育与其所患糖尿病有关，故原因不明的不育患者应注意检测抗胰岛素抗体。常用检测方法为ELISA和放射免疫测定法。

（一）试剂

已有试剂盒供应，试剂盒组成为：胰岛素抗原（Ins-Ag）；酶标记SPA （HRP-SPA）；小牛血清（FCS）。

（二）操作

1.取包被液4.5ml加入Ins-Ag安瓿内，混匀。每孔加100μl。4℃过夜。用PBS-T洗3次，每次3分钟。

2.用含15%小牛血清的PBS-T封闭，每孔100μl。45℃ 1小时。PBS-T洗涤。

3.每孔加稀释液100μl，待检血清（阳性对照、阴性对照）5μl。45℃ 30分钟。PBS-T洗涤。

4.取稀释液4.5ml加入HRP-SPA安瓿内，混匀。每孔加100μl，45℃ 30分钟。PBS-T洗涤。

5.每孔加底物溶液100μl，室温3～5分钟后，用2mol／L H ₂SO ₄（每孔50μl）终止反应。酶联检测仪测492nm吸光度，以P／N≥2.1为阳性。

三、抗弓形虫抗体

弓形虫感染是一种人畜共患疾病，在人群中弓形虫感染率较高，由于病原体直接检查获得的阳性率较低，故血清学诊断已成为该病诊断的主要手段。目前，国内已建立了多种血清学方法。

（一）材料

1.抗原的制备

将弓形虫滋养体（江苏省农科院提供）腹腔接种感染小鼠。3天后，用无菌生理盐水洗涤腹腔，抽取洗脱液，3000r／min离心15分钟，弃上清液。再用生理盐水洗涤3次后，放低温冷冻24小时，取出，37℃溶解，再冷冻，反复冻溶3次。接着置于研钵内，研磨30分钟，将研磨液按1∶9容积加入蒸馏水，1500r／min离心10分钟，取上清液，加0.01%硫柳汞防腐（经考马斯蓝测定蛋白为0.07g／L），4℃冰箱保存备用。

2.标本保存与处理

①血清：静脉抽血约3ml，分离血清，如不当天检测，请置于-20℃保存待检。检测时按1∶5稀释（即100μl标本稀释液加血清20μl）。②精浆：待精液完全液化后，2000r／min离心10分钟，取精浆-20℃保存待检。检测时按1∶2稀释（即50μl标本稀释液加精浆100μl）。如果精液不液化或黏稠度高时，可用双层滤纸过滤或加入1滴糜蛋白酶（用生理盐水配制成2.5mg／ml）。③宫颈黏液：无菌棉拭子蘸取宫颈黏液后加入0.5ml生理盐水，尽量将拭子上的宫颈黏液挤出，置-20℃保存待检。检测时按1∶2稀释（同精浆）。

（二）操作

1.将已包被的微孔板及所有检测试剂置于室温下平衡30分钟，同时配制标本稀释液（含5%小牛血清的PBS-T）。

2.根据不同待测标本，每孔加标本稀释液100μl或50μl，阴、阳性对照孔不加，空白对照孔加100μl标本稀释液。

3.依次加入标本（血清20μl，精浆和宫颈黏液50μl）和100μl阴、阳性对照。

4.42℃温育40分钟。

5.用PBS-T洗板4次，每次3分钟。

6.拍干后每孔加入2滴酶结合物。

7.42℃温育40分钟。

8.同步骤5，洗涤、拍干后加显色液A、B各1滴。

9.混匀后避光反应10分钟。

10.加终止液1滴，混匀后以空白孔调零，450nm测吸光度值，P／N≥2.1为阳性。也可以不加终止液，直接肉眼判断（与阳性对照比较）。

四、精浆免疫抑制物

人类精浆中含有30多种抗原，其中大部分具有很强的免疫原性。它们作为“异物”进入女性生殖道后，通常并不引起全身或局部的细胞与体液免疫反应，其原因与精浆中含有SPIM有密切关系。精浆的免疫抑制物活性，可能是多种物质的综合反映。这些物质包括妊娠血浆蛋白A（PAPP-A）、丝氨酸蛋白酶、前列腺素、多胺氧化酶等，其中精浆经Sephadex G-100柱层析的组分I，称为男子抑制物质（male inhibition material，MIM），其抑制活性见表13-21。MIM随精子进入女性生殖道，抑制机体对精细胞及其胚胎的免疫反应，保护受精卵免受排异，使得正常的生殖生理过程能顺利进行。

MIM对补体有显著的抑制作用，经精浆作用的正常人血清，总补体溶血活性（CH50）下降50%，现已证实，其机制为抑制C3和B因子活化。MIM对补体的这种抑制作用，有助于保护精子免遭抗体参与的补体介导的溶细胞反应。MIM对T、B、NK、巨噬细胞和多形核白细胞都有抑制作用。对MIM的研究结果见表13-21。

表13-21　MlM的抑制活性

大量的临床实验室研究表明，MIM活性含量降低与不育（孕）、习惯性流产的发生密切相关。其配偶也常表现对精液过敏，性交后手脚奇痒，面色潮红。血清中抗精子抗体检出率高达50%。

（一）抗补体法检测精浆免疫抑制物活性

1.原理

将待测精浆加至补体（混合豚鼠血清）中，再加入指示系统（致敏羊红细胞）与不加精浆的对照管比较，观察溶血活性是否降低。

2.试剂

（1）缓冲等渗盐水：

NaCl 17.0g，Na ₂HPO ₄1.13g，KH ₂PO ₄0.27g，蒸馏水加至100ml。用时取此液5ml，蒸馏水95ml，100g／L MgSO ₄0.1ml，当日即用。

（2）溶血素：

即兔抗羊红细胞（SRBC）抗体。用1∶100稀释豚鼠血清作为补体，滴定溶血素最适效价。

（3）2%SRBC：

SRBC用血细胞保养液保存于4℃，2周内使用，用时以缓冲等渗盐水洗3次，配成2%SRBC悬液。

（4）致敏SRBC：

2%SRBC悬液加等量最适浓度溶血素，37℃水浴15分钟。

（5）补体：

3～5只豚鼠混合的新分离血清，分装每管0.1ml，-30℃保存。用时取出1支，用冷缓冲等渗盐水做1∶100稀释。

（6）检样：

待检男子均用手淫法采集精液于干燥清洁的瓶内，自行液化，3000r／min离心10分钟，取上清液备用。

3.操作

（1）设试验与对照两排试管，每排6支，补体和精浆按表13-22加入，对照排各管不加精浆，用0.05ml缓冲等渗盐水代替。

表13-22　反应物加入方法

（2）各管800r／min离心5分钟后，取出与50%溶血标准管（致敏SRBC 0.4ml，加0.6ml蒸馏水使全溶后，取0.5ml加缓冲等渗盐水0.5ml即成）目视比色，观察引起50%溶血的补体用量。

4.计算按下式计算CH50单位

正常参考值为（430±62）U／ml。

（二）单向免疫扩散法检测男子抑制物

1.原理

自精浆中提取MIM，免疫家兔制成抗MIM血清。将抗MIM血清与融化的琼脂混匀、浇板、打孔，加入待测精浆。精浆中MIM向含抗MIM血清的琼脂板中扩散，与抗MIM结合形成肉眼可见的白色沉淀环。沉淀环直径与精浆中MIM含量呈正相关。根据标准曲线可判明精浆中MIM含量。

2.试剂

（1）MIM：

将正常生育男子精浆经高速离心后，过Sephadex G-100柱，收集洗脱的第一蛋白峰，浓缩，过Sepharose 4B-兔抗人全血清亲和层析柱，收集流穿液，浓缩。

（2）抗MIM血清：

将纯化MIM加福氏佐剂给家兔皮下多点注射，10～20天后重复1次，然后每5～7天注射不加佐剂的MIM。注射4～5次后采血，单向免疫扩散效价达1∶60即可放血，分离血清后流穿正常人血浆Sepharose 4B柱，即为纯化抗人MIM血清。

（3）20.0g／L琼脂：

取琼脂粉2.0g，加等渗盐水（含10.0g／L硫柳汞1ml）至100ml，沸水浴溶解。分装，每管3.9ml，加橡皮塞后4℃保存。

（4）硫柳汞盐水：

等渗盐水99ml加10.0g／L硫柳汞1ml。

3.操作

（1）制板与加样：

将20.0g／L琼脂于沸水浴中融化，每管加入硫柳汞盐水3.77ml，于56℃水浴保温，加入56℃预温的抗MIM血清0.13ml，迅速混匀，浇注于水平台面上的6cm×8cm洁净玻片。凝固后，按模式图用直径3mm铜管打孔，于孔中加入待测精浆5μl。将板置湿盒于37℃扩散20小时，取出后量取沉淀环直径。根据标准曲线得出精浆中MIM的含量。

（2）标准曲线的制备：

将纯化MIM稀释成20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125g／L，各取5μl，置于加样孔中，于每块反应板上与待检精浆同样操作，以MIM含量为纵坐标（对数轴），沉淀环直径为横坐标，在半对数纸上制作标准曲线。

正常值：生育男子精浆MIM含量为（3.0±0.3）g／L。

（三）人精浆免疫抑制因子-DF2测定

人类精浆中含有一系列免疫抑制因子，上海第二医科大学王一飞等从正常人精浆中提取出一种免疫抑制因子DF2，其相对分子质量为52 000，PI 3.8～4.2，聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一区带。DF2对外周血NK细胞活性和外周血淋巴细胞转化试验，均有明显抑制作用。

1.试剂

（1）抗DF2抗体：兔抗人DF2抗血清经50%、33%饱和硫酸铵二步盐析，再经DEAE-纤维素柱层析，得兔抗人DF-2抗体。

（2）DF2参考标准：纯化人精浆DF2配制成浓度为1、2、5、10、25、50、100、200g／L。

（3）酶标抗DF2抗体：兔抗人DF2抗体用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），加甘油，-20℃保存。工作浓度为1∶1200。

（4）底物溶液、包被液、洗涤液同常规ELISA法。

2.操作

（1）检样：

人精浆经3000r／min离心15分钟，取上清备用。

（2）ELISA夹心法：

兔抗人DF2抗体（10mg／L）包被聚氯乙烯反应板4℃过夜后洗涤，4℃保存。用时取出包被板洗3次，加入DF2参考标准或待测样本每孔100μl，37℃温育90分钟洗3次；加HRP-抗人DF2抗体100μl，37℃温育75分钟，洗4次；加底物溶液100μl，37℃温育30分钟，2mol／L H ₂SO ₄终止反应，用酶联比色仪测490nm波长吸光度（A）值。

3.结果判断

以A为纵坐标，DF2参考标准浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。从标准曲线上查得各样本的DF2含量。

正常生育男子精浆中DF2含量为0.20～3.45g／L，平均为（1.32±0.72）g／L。

（四）间接免疫荧光定位分析精子表面MlM

男子抑制物质缺乏时，往往引起妻子对丈夫精子的过敏反应，产生抗精子抗体（AsAb），引起不孕。鉴于MIM在生殖生理中起重要作用，作者用间接免疫荧光技术，对339例生育、不育和妻子习惯性流产的男子精子进行MIM定位分析，并与精浆中游离的MIM进行了比较，结果认为精子头部MIM分布减少，可能是造成不育和妻子流产的重要原因。

1.材料

（1）检测对象：

生育男子96例，妻子正在妊娠或已有子女，年龄平均为28.5岁；不育男子141例，婚后性生活正常2年以上，精液常规及AsAb均正常，女方妇科检查正常，不孕与男方有关，平均年龄31.6岁；妻子流产的男子132例，妻子发生自然流产2～8次，平均年龄35.7岁。

（2）兔抗人MIM抗血清：

经方阵滴定预试，工作浓度为1∶80。

（3）羊抗兔IgG荧光抗体（羊抗兔IgG-FITC）：

自制，最适工作浓度为1∶100。

2.方法

新鲜液化精液→1500r／min离心15分钟→pH 7.4 PBS洗3次→校精子浓度2×10 ⁶／ml涂片，干燥→PBS洗3次→加兔抗人MIM（1∶80），37℃ 30分钟→加羊抗兔IgG-FITC（1∶100），37℃ 30分钟→PBS洗3次→荧光显微镜观察。

3.结果判断

在荧光显微镜下观察，精子体表着染浓厚的荧光斑点，定位于精子头部、颈部、尾部。

4.结果

（1）生育、不育和妻子流产的男子精子表面MIM的分布见表13-23。

（2）精浆中MIM含量正常（≥360U／ml）和偏低（＜360U／ml）的男子，精子表面MIM分布见表13-24。

表13-23　生育、不育和妻子流产的男子精子表面MlM分布

^*与生育组相比有显著差异（χ ²=5.9，P＜0.05）

^**与不生育组相比有差异但不显著（χ ²=1.8，P＞0.05）

表13-24　精浆中MlM含量与精子表面MlM分布

相差非常显著（χ ²=9.1，P＜0.01）

第六节　精液的微生物学检查

生殖系统感染常引发临床疾患。如女性的阴道炎、宫颈炎，附件炎、子宫炎等，男子的睾丸炎、附睾炎、前列腺炎等，以及男女性不育。可引起生殖系统感染的病原微生物有细菌、病毒、螺旋体、支原体、衣原体等。本节主要介绍生殖系统常见病原微生物的实验室诊断方法。

一、细菌与真菌的检查

（一）采集、检查与培养

1.标本的采集前列腺分泌物应由医师采集并收集于无菌试管送检。淋病奈瑟菌检查时，应用皂液清洗外尿道，用水冲洗干净后，将无菌尿道拭子插入尿道2～4cm，旋转2秒后送检。

2.涂片检查

（1）普通细菌：将分泌物或尿道拭子涂片制成干片，火焰固定后革兰染色，油镜下观察，根据染色和形态做出报告。

（2）淋病奈瑟菌：尿道拭子涂片制成干片，火焰固定后革兰染色，再加亚甲蓝染色，如白细胞内有革兰阴性双球菌，呈肾形，可报告细胞内检出革兰阴性双球菌。

（3）杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）：涂片同上，革兰染色镜检发现细小的革兰阴性杆菌单独或成丛存在，有两极浓染或者色不均匀现象者，可能为该菌。

（4）结核分枝杆菌：涂两张片，火焰固定，一张进行萋-纳染色。方法为加苯酚复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，但不可沸腾，染5分钟，水洗后加盐酸酒精脱色，不时摇动至无红色脱落为止，水洗。再加亚甲蓝复染液染0.5～1分钟，水洗。干后油镜下观察。另一张作潘本汉染色，两张涂片均找到红色杆菌，报告“找到结核分枝杆菌”，若仅萋-纳染色找到，而潘本汉染色未找到红色杆菌，则为耻垢分枝杆菌。

（5）念珠菌：可用生理盐水制成湿片，覆以盖玻片，用高倍镜观察，如杂质太多，可滴加10%氢氧化钠；也可制成干片，火焰固定后革兰染色，油镜检查。

3.培养

（1）细菌培养：分泌物或尿道拭子可接种血琼脂平板和中国兰平板各一个，35℃孵育24～48小时。

（2）淋病奈瑟菌培养：尿道拭子（也有人报告用前段尿，阳性率与尿道拭子相同）接种巧克力琼脂平板，5%～10%CO ₂环境中孵育24～72小时。淋病奈瑟菌为直径0.5～1mm、光滑、灰白色、透明的小菌落，革兰染色为阴性双球菌，肾形或成双排列，氧化酶阳性，触酶阳性，巧克力或血琼脂22℃不生长，营养琼脂35℃不生长。葡萄糖发酵试验阳性，麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖发酵试验均为阴性，硝酸盐还原试验阴性，DNA酶试验阴性。淋病奈瑟菌的药敏试验推荐用GC培养基加1%生长补充剂（每升水含1.1g胱氨酸、0.03g盐酸鸟嘌呤、0.003g硫胺、0.013g对氨基苯甲酸、0.01g维生素B ₁₂、0.1g羧化辅酶、0.25g NAD、1g腺嘌呤、10g谷氨酰胺、100g葡萄糖，0.02g硝酸铁）。

（3）杜克雷嗜血杆菌培养：疑为由杜克雷嗜血杆菌引起的软性下疳，从患部刮取屑物或淋巴结肿大处穿刺吸出脓液，接种于56℃灭活15分钟的新鲜无菌人血清中，35℃培养，每日转种于含30%兔血培养基，35℃培养24～48小时后生长菌涂片革兰染色。如为缠接在一起的革兰阴性杆菌，将可疑菌落接种MH琼脂，贴上分别含有X因子、V因子和X、V因子的3种纸片，纸片间相距20mm以上。在X因子周围生长，而V因子周围不生长的为杜克雷嗜血杆菌。

（4）念珠菌培养：分泌物接种沙保培养基置22～28℃培养，也可接种柯玛嘉念珠菌显色培养基。在这种培养基上，白念珠菌菌落显绿色，热带念珠菌显蓝灰色，克柔念珠菌为粉红色边缘有微毛，其他念珠菌显白色至粉色。

（5）生殖道支原体培养：生殖道较常见的有解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，Uu）和人型支原体（mycoplasma hominis）。它们分解代谢的物质及最适生长pH有异，因此需要含有不同成分的培养基。其基础培养基为牛心消化液（牛肉浸出液或猪胃胨消化液亦可）加1%蛋白胨、0.5%氯化钠、0.3%酵母浸膏粉配固体培养基加1.2%～1.5%的琼脂粉。高压灭菌后无菌加入10%～20%小牛血清、0.002%酚磺酞、2万U青霉素。如用于分离解脲支原体再加入0.1%尿素，调pH 6.0；用于分离人型支原体加入0.2%L-精氨酸盐酸盐，调pH 7.0。

（二）细菌与真菌的分离鉴定

分离鉴定程序为：待检标本（精液、前列腺液等）接种液体培养基，35℃培养3天，每天观察2～3次。培养基颜色一旦出现由黄变红的趋势（pH上升）且肉眼观察培养基外观澄清，立即转种（如培养基过碱，支原体迅速死亡）到另一只液体培养基和固体培养基（转种前最好用0.45μm的微孔滤膜过滤，以除去细菌，因为很多细菌也可分解尿素或精氨酸）。固体培养基置5%CO ₂、95%N ₂或微需氧环境中培养，每天用低倍镜观察菌落生长情况。培养基变红，镜下可见解脲支原体生长为直径20～50μm，多呈桑葚样的菌落。可对菌落进行染色鉴定。解脲支原体用MnCl ₂-Urea试剂，为1.0g尿素、0.8g MnCl ₂加水100ml过滤除菌后分装3ml／管，存-20℃冰箱。实验时将2～3ml染色试剂流过长菌平板，5分钟后显微镜观察，染成深棕色菌落为解脲支原体。人型支原体用Diene染液，为2.5g亚甲蓝、1.25g天青、10.0g麦芽糖、0.25g Na ₂CO ₃加水至100ml，用时1∶3稀释。实验时用1ml Diene染液冲洗平板，即刻用蒸馏水冲洗平板表面，去除染液，用95%酒精脱色2次，每次1分钟，用蒸馏水冲洗平板表面后自然干燥，镜下观察“荷包蛋”样菌落，中央被染成深蓝色，周围被染成浅蓝色。解脲支原体不被染色，但其他支原体均可被染色，若是从生殖道中分离的典型菌落且被染色，可判断为人型支原体。

二、人免疫缺陷病毒抗体的检测

HIV可以引起获得性免疫缺陷综合征，又称艾滋病（AIDS），此病毒有HIV-1、HIV-2两型。实验室检测分筛选实验和确认实验两种。实验室的建立须经有关单位批准，实验人员需经培训合格持上岗合格证后才能开展工作。HIV的实验室检测方法包括检测血清中HIV抗体、HIV抗原和HIV核酸。由于HIV感染后病毒难以清除，检测出抗体即指示体内存在病毒，所以最常用的实验室诊断方法为检测抗体。初筛实验检测的是总抗体，有ELISA、明胶颗粒凝集实验、免疫荧光法、免疫渗透法等，以ELISA最常用。确认实验检测对应病毒组分抗原的抗体，有蛋白印迹法（Western blot，WB）和放射免疫沉淀实验（RIPA），以WB最常见。

（一）ELlSA法

用基因工程或人工合成多肽抗原（含 HIV-1gp41、 HIV-1gp24、 HIV-2gp36）包被反应板，当待测血清中存在抗HIV抗体时，它与固相化的抗原结合，再用酶标记的抗人IgG与抗体反应，底物显色。具体操作方法参照各种试剂盒的说明书。若出现阳性孔，必须采用两种试剂盒复测双孔。若复测阳性，需将样品和重新采样的样品送国家卫生部门批准的确认实验室，用更灵敏的方法加以确认。ELISA法检测HIV-1／2抗体有较高的灵敏度，只有约1%的假阳性。

（二）免疫印迹试验

免疫印迹法又称蛋白印迹法，是将HIV蛋白抗原裂解，通过SDS-PAGE电泳将其按分子量大小分离排列，再转印至硝酸纤维素膜上。待测血清与切成细条的硝酸纤维素薄膜充分接触，若样品中有对应于相应抗原的抗体存在，就会与抗原结合，再加上酶标抗人IgG，经底物显色，就会在相应的位置上出现条带。根据世界卫生组织推荐的标准，阳性：至少有一条env带，另外有一条pol带或一条gag带加一条pol带；或者出现两条env带。阴性：无任何条带。可疑：无env带，只有gag带和／或pol带。对于可疑的患者至少随访6个月。对可能是阳性的患者还要结合临床表现方能作出诊断。

三、梅毒的实验室诊断

梅毒是由苍白密螺旋体［又称梅毒螺旋体（Treponema pallidum）］感染引起的性传播疾病。梅毒螺旋体体长6～20μm，宽0.09～0.18μm，有规则密螺旋，人工培养很难成功。当前的实验室诊断主要有：皮肤黏膜损伤时用显微镜检查，非梅毒螺旋体血清试验和特异性梅毒螺旋体血清试验。结合临床可对梅毒作出肯定、推断和提示三种判定。临床怀疑为梅毒的患者，要进行梅毒常规筛选实验（图13-32）。

（一）镜检暗视野显微镜和直接荧光抗体（DFA）检查

对于一期、二期梅毒可采取病灶分泌物，淋巴结穿刺物或活检组织，三期梅毒取活检组织做检查。采集标本要戴手套。如在硬性下疳皮肤黏膜损害处取材需先用浸过生理盐水的棉花球轻轻擦去覆盖的痂皮。然后用盖玻片蘸取渗出液。若由淋巴结取材，则先用针头穿入淋巴结，注入少量无菌生理盐水，再吸取少量淋巴液。用于暗视野检查法检查的标本，取样后应尽快检测，因为梅毒螺旋体对氧气、热、非生理性pH和干燥很敏感，易失去活力。

图13-32　梅毒常规筛选实验

1.暗视野显微镜法

暗视野显微镜检查应该先用40×或45×物镜寻找，找到后在盖玻片上滴加香柏油转为90×或100×物镜观察。梅毒螺旋体的特征是小而纤细，有紧密规则的螺旋和特征性的螺旋状运动，一期梅毒在血清学反应未出现时即可用此法检出螺旋体。但暗视野法阴性并不能排除梅毒，因为有时梅毒螺旋体太少而不易检出。

2.荧光显微镜法

荧光抗体检测法利用特异性抗梅毒螺旋体抗体标记荧光后，在荧光显微镜下直接检测梅毒螺旋体，方法特异。待检标本自然干燥后用丙酮固定10分钟或用100%甲醇固定10秒，亦可轻柔地热固定，然后加上荧光标记的抗梅毒螺旋体抗体作用后用荧光显微镜检测螺旋体。

（二）非特异性梅毒螺旋体试验

这一类实验的抗原是牛心中提取的心磷脂、胆固醇和纯化后的卵磷脂，所以也称类脂质抗原试验。梅毒螺旋体可使被破坏的组织细胞释放类脂样物质，螺旋体自身释放亦产生类脂及脂蛋白，这些物质刺激机体产生的抗体（IgG或IgM）可以与从牛心中提出的心磷脂发生抗原抗体反应，由于非梅毒螺旋体感染的各种急性或慢性组织损伤也可产生类似的抗体，所以这种反应是非特异性的，适合用于筛选实验。

1.性病研究实验室试验（venereal disease research laboratory test，VDRL）

原理：试剂中的心磷脂与抗体发生反应，卵磷脂可加强心磷脂的抗原性，胆固醇可增强对抗原的敏感性，试剂中的抗原悬于无水乙醇中，在试验过程中加入水后，胆固醇析出形成载体，心磷脂和卵磷脂在水中形成胶体溶液包裹在胆固醇载体周围，形成胶体微粒，这种微粒与梅毒血清抗体反应后，通过摇动、碰撞，相互黏附形成较大的颗粒，可通过显微镜观察到。

玻片定性试验操作：待检血清于56℃水浴灭活30分钟。吸取0.05ml血清，加在玻片圆圈中并涂匀充满；用1ml注射器装上针头，滴加抗原一滴（每毫升约60滴）；摇动玻片4分钟，每分钟约180次。

结果判断：

2+～4+：肉眼可观察到大的或中等大小的聚合在一起的块状物。报告阳性。

1+：肉眼可观察到小块状物，液体混浊，需要用显微镜放大到100倍观察块状物的形状。报告弱阳性。

±：显微镜观察颗粒分布不均匀，或呈细小粗糙颗粒。报告可疑反应。

-：显微镜检查颗粒细小，分布均匀。报告阴性。

玻片半定量试验在VDRL玻片定量试验中，为排除前滞现象或假阳性，可做玻片半定量试验。

待测血清用生理盐水在小试管中作6个稀释度，即原血清、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。每个稀释度血清取0.05ml，加入玻片圆圈中，按照定性试验的方法进行测定和判定结果。

2.不加热血清反应素试验（unheated serum reagin test，USR）

本试验是将脂质抗原悬于0.1mol／L EDTA，40%氯化胆碱和磷酸盐硫柳汞溶液中。EDTA可保护抗原半年内不变性，氯化胆碱可化学灭活补体，因此，血清不必加热灭活，抗原不必每天配制。

玻片定性试验吸取待检血清（不必灭活）0.05ml，加于玻片上的圆圈中，并分散到整个圆圈。用1ml注射器上专用针头吸取抗原，每份待检标本滴加1滴。摇动玻片，4分钟后观察结果。

结果判断：

4+～3+：肉眼可观察到大的或较大的块状物。报告阳性。

2+：肉眼可观察到小块状物，液体清亮，显微镜观察较大的块状物。报告阳性。

+：在显微镜下可见小块状物，均匀分布。报告弱阳性。

±：显微镜观察颗粒分布不均匀，或呈细小粗糙颗粒。报告可疑反应。

-：显微镜检查颗粒细小，分布均匀。报告阴性反应。

玻片半定量试验玻片试验阳性者，可做半定量试验，以进一步确诊。待测血清用生理盐水在小试管中作6个稀释度，即原血清、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。每个稀释度取血清0.05ml，加入玻片圆圈中，按照定性试验的方法进行测定和判定结果。

3.快速血浆反应素环状卡片试验（rapid plasma reagin test，RPR）

原理和USR基本相同，因抗原吸附于炭粒上，凝集时易观察。

操作：①取待测血清50μl，加入卡片上圆圈内，并分散到整个圆圈。②在每份血清上加入1滴RPR抗原。③旋转摇动8分钟（约100r／min），立即用肉眼观察结果。

结果判断：阴性标本不凝集。阳性标本反应液中可见到明显黑色凝集颗粒或絮片，根据颗粒和絮片的大小及有无，记录1+～4+或-。如有需要，阳性标本也可在RPR卡上将血清稀释后，做半定量试验。

4.甲苯胺红不加热血清试验（toluidine red unheated serum test，TRUST）

采用VDRL抗原混悬于含有特制的甲苯胺红溶液中，与血清中反应素反应，出现肉眼可见的凝集块。

操作：①将待检血清与TRUST抗原于用前放室温（23～29℃）平衡。②分别吸取阴性和阳性对照各1滴（50μl），加到反应卡的两个圈内并铺匀。③吸取待检血清或血浆（不须灭活）1滴（50μl）分别均匀涂于其余圈内。轻轻摇匀抗原，用专用针头垂直滴加抗原1滴于血清圈内。④摇动卡片8分钟，立即肉眼观察结果。

结果判断：

阴性：呈粉红色均匀分散沉淀物。

阳性：出现粉红色凝集块，根据凝集块大小记录1+～4+。

阳性反应需要定量试验的，可将待检血清用生理盐水倍比稀释，然后按定性试验方法进行。

（三）特异性梅毒螺旋体试验

试验中使用的抗原是梅毒螺旋体抗原，被测抗体针对螺旋体细胞成分。这种抗体在感染后3～4周可检出直到治愈后仍长期存在，因此在总人群中存在1%假阳性。特异性梅毒螺旋体试验不宜作为常规试验和筛选试验，主要用于梅毒螺旋体感染的证实，排除非梅毒螺旋体试验的假阳性，其对潜伏后期及晚期梅毒的阳性率高于非梅毒螺旋体试验，而早期的阳性率低于后者。

1.FTA-ABS试验：

血清用吸附液1∶5稀释，除去非特异性反应物后，加在已固定了抗原的玻片上。待反应后，加FITC标记的抗人免疫球蛋白抗体。反应后荧光显微镜观察。20世纪90年代后又有人建立了FTA-ABS双染色试验。采用四甲基若丹明异硫氰酸盐标记抗人IgG。复染用FITC标记的抗梅毒螺旋体抗体。复染可以保证阴性反应是血清中缺乏特异性抗体，以防抗原从玻片脱落而造成假阴性。

2.TPHA：

原理超声粉碎的梅毒螺旋体抗原致敏醛化羊红细胞，血清或CSF中存在抗梅毒螺旋体抗体，即可与致敏的红细胞形成肉眼可见的凝集，用未致敏的醛化血细胞作为阴性对照。

操作：①取U形微孔板1块。②加稀释液，第1孔1滴（25μl），第2孔4滴，第3、4孔各1滴。③取1滴血清（25μl）至第1孔，混匀后取1滴至第2孔，混匀后取1滴至第3孔，混匀后弃去1滴，再从第2孔取1滴至第4孔混匀后弃去1滴，第3孔为测试孔，第4孔为对照孔。④加75μl致敏血细胞至第3孔，75μl对照血细胞至第4孔。⑤加盖静置45～60分钟。⑥U形孔底观察血细胞凝集情况。凝集阳性细胞在孔底形成一层凝集，阴性细胞沉于孔底中央弱凝集形成一特异性环形。

如果对照孔和测试孔均阳性，说明血清中存在抗血细胞抗体，应将待检血清与对照血细胞按1∶4稀释，室温放置45～60分钟，1000r／min离心5分钟，再用稀释液1∶5稀释后分别加入对照或致敏血细胞检测。

（刘夏铭　邵海枫）

四、沙眼衣原体感染对精子的影响

衣原体是介于病毒和立克次体之间的、能通过滤菌器、具有在专门细胞内寄生与独特较长生活周期的原核细胞型生物。在分类学上具有独立的地位，由三个种组成，即沙眼衣原体种（C.tr）、鹦鹉热衣原体和后来发现的肺炎衣原体。根据引起的临床疾病、染色特征、对抗生素的敏感度、表面顶端蛋白特性及同源DNA片段的特点，可互相区别。与人类泌尿生殖道感染密切相关的是沙眼衣原体，根据其不同的主要外膜蛋白抗原（MOMP）已分出15种血清型（A～K 11个型；另4个型为Ba、L1、L2及L3）；新近又确定了来自生殖道与眼部的3个型Da、Ia及L2a；每一血清型伴有各自的临床表现，据此可分出三类生物型。其中生殖道与眼的衣原体病属沙眼生物型，除性病淋巴肉芽肿（LGV）外，生殖道衣原体感染通常是由D～K八种血清型所致。

沙眼衣原体包括两种基本结构，即原体或基本小体（elementary body，EB）与始体或网织体（initial or reticulate body）。原体为细小圆形颗粒，直径约为300nm，普通光学显微镜下勉强可见。电镜下，原体中央有致密的类核结构。原体在细胞外较为稳定，且有高度的传染性。吉姆萨染色为红色。始体为较大的圆形颗粒，直径为800～1200nm，电镜下始体中央无致密的类核结构，而是呈纤细的网状，外周围绕着一层致密的颗粒样物质，并有两层囊膜包裹。始体无传染性，是衣原体在宿主细胞内生活周期的繁殖体。吉姆萨染色为深蓝或暗紫色。衣原体的原体颗粒吸附在易感细胞表面后被细胞吞入胞质，细胞表面的胞膜形成的空泡将原体颗粒包围，原体在其内分化为始体，始体进行多次二分裂，直到整个空泡充满较小的颗粒-原体为止。此种细胞内结构称为包涵体，即原体在细胞内形成的小菌落。对衣原体的分离培养较为复杂，目前常用鸡胚卵黄囊接种和易感细胞培养两种方法。分离眼-泌尿生殖道型衣原体，鸡胚法不如细胞培养法。

在症状和非症状男子生殖道感染中，起关键作用的两种生物体是解脲支原体和沙眼衣原体。本节着重探讨沙眼衣原体引起的男子生殖道感染对男子不育症所起的作用。据报道沙眼衣原体是35岁以下男子尿道炎和急性附睾炎的主要病因之一。它经射精管逆行向上进入输精管是附睾感染的常见途径。由于射精管内结构的改变，可能导致尿液逆流入输精管，这意味无症状衣原体前列腺炎可能先于急性附睾炎。衣原体因导致输精管和附睾管腔部分或全部阻塞而明显改变精子质量。

越来越多的迹象表明沙眼衣原体也是非细菌性前列腺炎的一个候补病因。采用补体结合试验、尿拭子及组织培养、免疫荧光检测等证实非细菌性前列腺炎男子生殖道衣原体存在率高。经尿道切除获取的前列腺标本中，30%的小管内有沙眼衣原体。大约45%的症状性非细菌性前列腺炎和脓精男子的精液中抗沙眼衣原体特异性IgA水平升高。但Doble等经会阴对50例慢性非细菌性前列腺精囊炎男子采集标本，作培养、免疫荧光或血清学检查，在前列腺组织中未发现沙眼衣原体。这种差异的原因尚不明了。由于其细胞内特性以及精液对培养基中细菌产生抑制作用的事实，前列腺液或精液沙眼衣原体培养阴性不能作为无病菌存在的依据。

早期研究发现生殖道感染与精子自身抗体产生相关，抗精子抗体阳性男子前列腺精囊炎发生率明显高于抗体阴性男子。非症状男子的既往前列腺炎或尿道炎史与精子抗体发生率显著升高相关。与非感染组比较感染沙眼衣原体男子精浆中精子抗体数量明显升高。目前对衣原体诱发精子抗体的机制尚不明了。炎症可能导致免疫细胞向生殖道迁移，与精子作用，或潜伏在排出管内。

沙眼衣原体引起的生殖道感染与男子不育的关系鲜有报道，可能通过影响附属性腺功能，改变了前列腺分泌的蛋白水解酶功能和精囊腺功能，从而使精液的液化时间延长、酸碱度下降，同时也可能通过对精子结构的影响、对精子细胞的毒性或自身免疫作用，使精子发生变性或死亡，而降低生育能力。沙眼衣原体对生精细胞有无影响尚无直接证据，据报道沙眼衣原体阳性者精子密度下降，可能对其生精功能影响也是导致不育的原因。

鉴于沙眼衣原体感染后通常缺乏明显的临床症状，故正确检测沙眼衣原体的方法就显得极为重要。以往由于分离沙眼衣原体困难，故感染后，通常是在尚未确定病原体种类时予以诊治。随着分离沙眼衣原体技术的不断发展，已有多种诊断沙眼衣原体的方法应用于科研和临床，如刮片检查、细胞培养（CC）、血清学检查、直接免疫荧光法（DIF）及新近开展的聚合酶链反应（PCR）、核酸杂交法等。

（一）刮片检查

刮片检查取样法同淋病检查。应注意采集患部含有大量上皮细胞的标本。涂膜干燥后甲酸固定吉姆萨染液染色。如在上皮细胞内找到包涵体为阳性。胞质内成熟型原体占优势的包涵体，染成红色至紫色，以始体为主的幼稚型包涵体染成暗蓝色，宿主细胞的核可由中央被挤至边缘。也可用碘液染色法，涂片经甲醇固定后滴加Lugol碘液染色10分钟，水洗后即可镜检。包涵体基质中因含丰富糖原，可被染成深棕褐色，细胞其他部分则显黄色。在有条件时（拥有抗沙眼衣原体的荧光抗体），用直接荧光抗体染色法检查，可显著提高检出率。有人发现在轻伤（第1次刮片后1～7天内再次取样）或滴可的松后，可激发衣原体活化而使检出率显著升高。

（二）细胞培养

细胞培养操作费时繁杂，易受标本质量等因素影响，一般不作为常规检查，必要时可取样送有条件单位进行。

（三）血清学检查

血清学检查需有特异性衣原体抗原，用此抗原制备抗原膜片或包被固相载体，用间接荧光抗体法或ELISA法检查抗沙眼衣原体抗体。IgM类抗体有早期诊断价值。

（四）荧光法诊断

衣原体性病荧光法诊断操作用荧光抗体染色法鉴定衣原体颗粒，在许多国家已成为临床泌尿生殖道标本的常规检验。与细胞培养法比较，该方法的特异性和敏感性均在95%以上。

1.试剂与器材

试剂盒所提供的基本材料有：①抗衣原体荧光抗体（10.5ml分装，用时以无菌生理盐水1∶4稀释）。②吐温-80。③缓冲液母液（用时每2ml母液加蒸馏水至1000ml，NaCl 8.5g及吐温-80 0.5ml即为洗涤用缓冲液）。④碱性缓冲甘油（作封片剂和镜油）。

试剂盒未提供之必要材料有：蒸馏水、吸管、消毒棉签、甲醇、载玻片、37℃孵箱、荧光显微镜、染色体盒。

2.标本采集

衣原体是在细胞内寄生的微生物，检测衣原体必须采集被感染的上皮细胞，先用消毒棉签将尿道宫颈口分泌物擦干净（女性患者需用扩阴器），再换一只棉签并将其深入尿道或宫颈内约2～4cm，转动360°停留片刻后取出，立即将采集的标本涂在干净的载玻片上。

3.衣原体的鉴定步骤

将涂有标本的玻片放在标本缸中以甲醇固定10分钟，取出后于空气中充分挥发，加衣原体荧光抗体一小薄层（约20μl），放湿盒中，加盖，置37℃孵箱30分钟，用上述缓冲液冲洗，甩干，滴加缓冲甘油加盖玻片封片，再加1滴缓冲甘油作为镜油于光学显微镜下检查。

4.结果报告

标本镜下查见亮绿色、具有典型大小、边界清晰的圆形颗粒，柱状细胞内可见亮绿色包涵体，可报告为“衣原体荧光抗体染色阳性”。

（五）核酸杂交法

应用杂交技术检测特定的核苷酸片段，是基因诊断的有效手段之一。基因诊断按其原理大致分为三类：核酸杂交技术、PCR技术和二者结合的技术。核酸杂交技术是用已知基因片段作为探针与待测样品DNA（RNA）或其片段进行核酸分子杂交，从而判断二者同源性程度。它包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、液相杂交、夹心杂交、原位杂交和寡核苷酸杂交等。地高辛（DIG）标记法以其灵敏度较高、非特异性杂交信号少、标记探针稳定期长、检测时着色容易等特点而受到人们青睐。在此介绍DIG标记的寡核苷酸探针通过斑点杂交检测沙眼衣原体DNA的方法。

1.试剂

①DIG DNA标记和检测试剂盒。②枸橼酸钠缓冲液（20×SSC）：枸橼酸钠·2H ₂O 88.2g和NaCl 175.3g溶于800ml水中，用10mol／L NaOH调pH至7.0，定容至1L，分装后高压灭菌。作用是稳定DNA，使其共价结合在硝酸纤维素膜（NC膜）上。③马来酸盐缓冲液：马来酸钠0.1mol／L，NaCl 0.15mol／L，用NaOH溶液调pH至7.5。④封闭试剂（10×）：将DIG试剂盒中的试剂11（粉末）按10%（W／V）浓度于65℃下溶于马来酸盐缓冲液，配好的溶液贮于4℃，暗处保存。⑤杂交液：5×SSC，十二烷基磺酸钠（SDS）0.02%（W／V），1×封闭试剂（10×），封闭试剂用马来酸盐缓冲液稀释。⑥EDTA 0.2mol／L，pH 8.0。⑦LiCl 4mol／L。⑧TE 10mol／L Tris-HCl，1mmol／L，EDTA，pH 8.0。⑨抗体溶液：1×封闭试剂20ml中加2μl DIG试剂盒中的试剂8（抗DIG抗体-酶耦联物）。⑩检测缓冲液：Tris-HCl 0.1mol／L，NaCl 0.1mol／L，MgCl ₂50mmol／L，pH 9.5。显色液（现配现用）：检测缓冲液10ml内加入DIG试剂盒中的试剂9（硝基四氮唑蓝NBT）45μl，试剂10（5-溴-4-氯-3-吲哚基乙酸BCIP）35μl。

2.方法

①探针制备及DIG标记：取人工合成的寡核苷酸15μl（约含DNA 2μg），100℃ 10分钟后急冷，使DNA变性，加DIG试剂盒中的试剂5（6种核苷酸混合物）2μl，试剂6（含DIG-11-dUTP的单核苷酸混合物）2μl，试剂7（Klenow酶）1μl（相当于2U），37℃过夜，进行DIG标记反应。加0.2mol／L EDTA 2μl终止反应，再加4mol／L LiCl 2.5μl，用冷无水乙醇80μl沉淀，70%乙醇洗涤后抽干沉淀，并以TE 50μl溶解，如此获得的探针约3μg，每条探针均标有DIG半抗原。②探针灵敏度实验：将梯度稀释的变性探针（浓度从1.0ng至0.01pg）制成NC膜，与对照标记的DNA（DIG试剂盒的试剂2）进行比较。该NC膜经80℃烘烤2小时后洗膜，检测。③标本检测：标本采集和处理同PCR法，最后获得的消化液用无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤、抽干后，以TE 10μl溶解。100℃ 10分钟后用冰水浴急冷变性，取4μl点膜。同时设阳性对照和阴性对照，80℃烤膜2小时，将烤过的膜封入盛有杂交液的塑料袋，68℃保温4～5小时预杂交，以封闭膜上非特异DNA，再加入标记好的变性探针（4ml杂交液中加10μl探针），68℃保温16小时进行杂交反应。取出杂交后的膜，行下述洗液步骤：①2×SSC，0.1%SDS，室温2×5分钟；②0.1×SSC，0.1%SDS，68℃ 2×15分钟。

洗过的膜按下述步骤进行免疫学检测、显色：①马来酸盐缓冲液中简单冲洗；②1×封闭试剂中洗30分钟；③抗体溶液中30分钟；④马来酸盐缓冲液中洗2×15分钟；⑤检测缓冲液中平衡5分钟；⑥膜置入新配的显色液中，于暗处显色过夜，再用蒸馏水充分洗膜、晾干、照相。

（刘夏铭　王卫萍）

五、单纯疱疹病毒感染的检查

单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是疱疹病毒科的成员，属DNA病毒。在发现该病毒以来，从多种动物体内分离到80余种不同的HSV。人类常见和重要的疱疹病毒有单纯疱疹病毒1型与2型（HSV-1，HSV-2）、水痘-带状疱疹病毒（varicellazoster virus，VZV）、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）以及巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）。人类疱疹病毒主要通过接触黏膜表面而传染。此类病毒都能通过胎盘屏障，其他传播途径为器官移植，性传播或通过应用污染的血液制品而感染。

HSV通常是隐性感染，但也可能是严重感染，甚至是致命的全身感染。此病毒感染后最常见的临床症状是皮肤黏膜上形成局限的成堆的疱疹。原发性单纯疱疹的表现有疱疹性口龈炎、疱疹病毒性外阴阴道炎、疱疹性角膜结膜炎、湿疹性疱疹、疱疹性脑膜炎、新生儿疱疹等。尽管HSV不论是显性或隐性的原发性感染后都产生特异性抗体，但是HSV能以潜伏的形式持续存在，并且后来可被各种非特异性刺激再激活。HSV-1与大部分生殖器以外的感染有关，而HSV-2主要为生殖器和新生儿疱疹性感染。另外现已发现HSV-2与子宫颈癌的发生有关。根据血清学研究的结果，HSV-1较HSV-2常见。

目前，判断疱疹病毒感染的常用实验方法有：①病毒分离；②病毒或病毒抗原测定，使用的方法有免疫电镜、细胞学方法、免疫荧光法、对流免疫电泳及ELISA方法等；③血清学方法，有补体结合试验（CF）、中和试验（NT）、免疫荧光试验（IFA）、间接血凝试验（IHA）、ELISA和放射免疫试验（RIA）等。病毒分离是直接诊断技术中较特异和敏感的方法，但实验条件要求高，时间长，现多将细胞培养增殖病毒与快速免疫学诊断技术结合起来，以弥补单用细胞培养分离病毒耗时长和单用免疫学方法检测标本中病毒抗原阳性率较低之不足。HSV-1和HSV-2两者DNA的同源性约为50%，每型HSV毒粒均含有共同抗原和型特异性抗原。含有多种糖蛋白，据分析，糖蛋白gD为HSV-1和HSV-2所共有；gC为HSV-1型特异，gF为HSV-2型特异。可用基因组成和抗原构成来区别HSV-1和HSV-2。

（一）单纯疱疹病毒抗原的检测试剂

抗HSV单克隆抗体用做包被抗体，兔抗HSV多克隆抗体用做二抗，酶标记抗体用HRP-羊抗兔IgG。

1.操作方法

标本采集用消毒棉拭擦拭病灶或宫颈数次，然后将该棉拭放入0.4～1ml 0.01mol／L pH 7.4的PBS中，浸出液供实验用。泪液标本用消毒滤纸条放入穹隆部停1分钟左右，待吸满泪液后取出放入0.25ml PBS中。为保证阳性检出率，可重复采样3次。标本采集后若不能立即检验，应放-30℃保存。

2.检验方法

①用包被液将抗HSV单克隆抗体1∶100稀释后，包被酶标反应板，每孔0.1ml，4℃过夜后备用。用SP 2／0小鼠骨髓瘤细胞制备的小鼠腹水同法包被作为阴性对照。②每份标本加一个试验孔和一个对照孔，每孔加样0.1ml；每次试验同时设阳性对照（HSV阳性抗原）和阴性对照（PBS）各一孔，40℃，40分钟，洗板3次。③将兔抗HSV免疫血清用含3%绵羊血清作1∶50～1∶200稀释后加入各孔，每孔0.1ml，40℃ 40分钟，洗板3次。④加入工作浓度的HRP羊抗兔，每孔0.1ml，40℃ 40分钟，洗板3次。⑤加入底物（TMB-H ₂O ₂）显色，10分钟后加2mol／L H ₂SO ₄终止反应。

3.结果判定

①目测：包被对照孔和阴性对照孔无色，阳性对照孔显黄色，实验孔显黄色者可判为阳性。根据显色的深浅，可判定其阳性程度。②比色：用酶标仪测450nm处吸光度值A，以P／N≥2.1判为阳性。

（二）单纯疱疹病毒感染的血清学检查

1.试剂

（1）HSV-1 Stoker株，HSV-2 Sav株，在乳兔肾单层细胞中传代。

（2）HeLa细胞，培养于Eagle液或RPMI 1640培养基（培养时均含10%小牛血清，而维持液只含2%小牛血清）中。

（3）抗原片：将HSV-1、HSV-2分别接种HeLa细胞单层，待细胞病变达2+时，将细胞摇落，悬液经3000r／min离心10分钟，沉淀细胞涂于印有小圈的载玻片孔内，干后冷丙酮4℃ 10分钟，置密封塑料袋内，4℃保存。

（4）底物溶液3，3′-二氨基联苯胺（DAB）4mg加二甲亚砜0.2ml（或丙酮0.5ml）溶解后，加入0.01mol／L pH 7.4的PBS 10ml中，再加入30%H ₂O ₂50μl，备用。

2.操作

（1）将待测血清用0.01mol／L pH 7.4的PBS自1∶5开始作双倍稀释达1∶1280，依次加入抗原片孔内，37℃湿盒30分钟。

（2）流水冲洗去多余血清，用上述PBS洗3次，每次5分钟（下同）。

（3）滴加工作浓度HRP标记的抗人IgG，37℃湿盒30分钟，PBS洗3次。

（4）加入底物溶液，避光反应15分钟，倾去底物溶液，于无水乙醇中浸泡3分钟脱水。

3.结果观察

滴加中性树脂封片后镜检，根据阳性细胞数和染色程度，判定为阳性或阴性，每次试验需设置阳性与阴性对照。

目前HSV的检测，也有商品试剂盒出售，包括抗原、抗体及核酸测定试剂等。

（刘夏铭　李保仝）

六、巨细胞病毒感染的诊断

人巨细胞病毒（HCMV）在人群中广泛存在，用测定HCMV-IgG，HCMV-IgM的方法调查HCMV感染率，发达国家为40%～60%，发展中国家为95%～100%。HCMV感染所致疾病的临床症状和体征等表现是非特异性的，而且许多HCMV感染的患者并不表现出任何临床症状而成为潜在感染状态。健康人群感染HCMV后，一般表现为轻微症状或无症状感染，但在免疫功能低下的人群，如器官移植、艾滋病、肿瘤患者，婴幼儿则可导致严重后果；早孕妇女感染HCMV，可通过胎盘引起胎儿宫内感染，从而导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓和新生儿先天畸形等。因而HCMV感染是一个值得重视的问题。近年来，HCMV实验室诊断在原有的实验方法基础上，主要在早期、快速和定量方面进行大量研究。目前，HCMV实验室诊断方法主要有以下几个方面。

（一）检查巨细胞包涵体

在患者新鲜尿液，活检组织或尸检标本切片寻找巨细胞包涵体，此法现已不用。

（二）HCMV组织培养

1.培养基

RPMI 1640液，加入20%小牛血清，即常用的细胞培养液。

2.实验用细胞系

HDEL（human diploid embryonic lung），即人二倍体胚肺细胞系。

3.实验标本

精液、尿、血液、胸腔积液、腹水、支气管灌洗液、脑脊液等，均可用于本试验。

4.操作方法（以尿为例，其他类同）

将HDEL细胞系培养于含20%小牛血清的RPMI 1640液中，待HDEL细胞系长成细胞单层后，将患者新鲜尿液，经处理后（高速离心沉淀）接种人胚肺成纤维细胞，定期观察细胞病变（CPE）情况。如有CPE产生，证明原培养物中HCMV阳性；10天后，若无CPE，将细胞盲传一次，仍无CPE，可报告HCMV培养阴性。

5.报告结果

尿液（或其他标本）HCMV培养阳性（或阴性）。

（三）HCMV抗体检测

HCMV抗体检测的方法较多，包括补体结合试验（CF）、间接血凝试验（PHA）、免疫荧光试验（IF）、免疫印迹试验（IB）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及放射免疫试验（RIA）等。其中ELISA和RIA具有简便、快速、敏感性好和特异性强等特点，是较为常用的检测方法。目前市售的ELISA测定HCMV-IgG和HCMV-IgM试剂盒，是HCMV抗体检测最简便的方法。应该注意的是，HCMV-IgG抗体阳性，仅能说明患者有既往感染（或称原发性感染）史，HCMV-IgM阳性则表明有活动性感染。两种抗体同时测定，有助于判定患者HCMV感染及活动状况。

现以ELISA法为例，介绍HCMV-IgG，IgM抗体的测定方法。

1.试剂

HCMV-IgG，IgM抗体的测定试剂盒，购于深圳晶美生物工程有限公司。试剂盒组成进口纯化抗原包被的酶标板条，12（条）×8（孔）；强阳性对照血清1瓶（1ml）；弱阳性对照血清1瓶（1ml）；阴性对照血清1瓶（1ml）；标本稀释液1瓶（20ml）；酶联物1瓶（酶标记抗人IgG，1ml 10×）；底物A 1瓶（6ml）；底物B1瓶（6ml）；反应终止液1瓶（6ml）；浓缩洗涤液1瓶（25ml，20×）。

2.标本收集

不能使用溶血、混浊或脂血标本，最好使用新鲜标本，如需保存，可于2～8℃冷藏48小时或于-20℃冷冻4周。

3.试验步骤

①配制洗涤液1瓶浓缩洗涤液加475ml蒸馏水，配好的洗涤液短期内可置室温，长期可存放于4℃。②待试剂盒平衡至室温后，待测标本用标本稀释液按1∶200稀释，即取1μl血清加200μl标本稀释液混合。③各加100μl强阳性，弱阳性，阴性对照及已稀释待测标本上清液于相应孔内，空白对照孔加100μl标本稀释液，盖好反应板，37℃孵育30分钟。④甩尽板内液体，每孔用200～300μl洗涤液洗5次，每次均需拍干。⑤按一次用量吸取浓缩酶联物，以标本稀释液按1∶10稀释，每孔加稀释酶联物100μl（或2滴），盖好反应板，37℃孵育30分钟。⑥甩尽板内液体，每孔用200～300μl洗涤液洗5次，每次均需拍干。⑦加底物A及B各50μl（或1滴），混匀，37℃ 15分钟。⑧每孔加终止液50μl，用酶标仪450nm测其OD值，若肉眼观察则不加终止液，判断结果。

4.结果判断

①阴性对照平均OD值须小于0.2。②弱阳性对照平均OD值须在0.20～0.65之间。③弱阳性对照与阴性对照平均OD值之比须大于或等于2，符合以上三种条件，本次实验结果可信，否则重复试验。④若待测标本孔显色比弱阳性对照孔深则判为阳性，反之为阴性。但在弱阳性对照上下10%范围内最好再测一次，如确实高于弱阳性对照，则可判为阳性。HCMV-IgM抗体测定，方法同HCMV-IgG。

（四）HCMV抗原的测定

HCMV抗原组成非常复杂，有数十种之多。一般认为，患者原发性感染的早期所表达的蛋白为HCMV的即刻早期抗原，继发性感染表达的多为HCMV的晚期抗原，因此，可用单克隆抗体来鉴别患者血清中的病毒抗原成分，以判定患者为原发性感染或继发性感染。这对于某些患者，如早孕妇女，因为能判定其为原发性还是继发性感染，对于判定胎儿的损伤程度有一定的临床意义。

1.HCMV早期抗原的免疫荧光检查（detection of early antigen fluorescent foci，DEAFF）

此法是在传统的细胞培养的基础上发展起来的。细胞培养虽然是HCMV诊断经典的方法，此法费时费力，敏感性低，不利于HCMV的早期快速诊断。DEAFF法通过测定HCMV DNA合成前产生的早期抗原（EA）来确定HCMV存在与否。方法为：将待测标本接种到人胚肺成纤维细胞单层上，培养24小时后用荧光素标记的鼠抗HCMV单克隆抗体，直接测定HCMV感染的α和β蛋白。①试剂：培养基，RPMI 1640液，加入20%小牛血清。②实验用细胞系HDEL，即人二倍体胚肺细胞系。③实验用标本同HCMV组织培养法。④操作方法（以尿为例，其他类同）：将HDEL细胞系培养于含20%小牛血清的RPMI 1640液中，在培养皿中放入特制的小盖玻片，待HDEL细胞系长成细胞单层后，将患者新鲜尿液，经处理后（高速离心沉淀）接种人胚肺成纤维细胞，24小时后将玻片取出，用无血清RPMI 1640液洗3次，直接加入荧光素标记的小鼠抗HCMV早期抗原的McAb，37℃ 30分钟，洗片后直接用荧光显微镜观察结果。出现荧光颗粒为HCMV早期抗原阳性。⑤报告结果：尿液（或其他标本）HCMV早期抗原阳性（或阴性）。

2.HCMV白细胞中抗原测定

这是一种直接诊断活动性HCMV感染的方法。将白细胞固定在玻片上，加入HCMV单克隆抗体（抗PP65）温浴后，加入荧光素标记的羊抗小鼠抗体（二抗），洗片后可直接用荧光显微镜观察结果。也可用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠抗体染色后，加入底物显色，2mol／L硫酸终止反应后用普通显微镜观察结果。凡细胞中有显荧光颗粒（荧光法）或棕黄色颗粒的，即为阳性细胞。

（五）HCMV DNA的PCR测定方法

1.引物的选择

应用PCR进行HCMV DNA检测，首要的问题是引物的选择与设计。HCMV DNA在结构上含有三种感染细胞特异性多肽的区段，即刻早期蛋白区（IEP）、早期蛋白区（EP）和晚期蛋白区（LP）。这三种多肽均有免疫原性，在进行HCMV PCR时，引物的设计应考虑到这类不同抗原的编码基因。选取哪一段作为引物可根据不同的情况而定，应注意的是引物所在的区域为病毒较特异的序列，即该序列为其所特有，而且又存在于不同的突变株，以便检测不同的突变株，以保证DNA序列扩增的特异性及实用性。因此，一般引物均设计在HCMV特异的保守序列。Demmler等设计的位于900～925nt及2101～2125nt的一对引物，其序列为

p1：5′-CACCTGTCACCGCTGCTATATTTGC3′

p2：5′-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT3′

应用该对引物扩增HCMV可产生一条长约400bp，含HindⅢ切点的DNA片段，该序列编码HCMV的晚期抗原蛋白。

2.标本处理

精液、血清、尿液等液体标本可直接用苯酚-氯仿抽提，用酒精沉淀，蒸馏水溶解后用于PCR扩增，组织标本需绞碎，水溶后再用上法提取（详细方法请参阅聚合酶链反应一节）。

3.PCR扩增

①取5～10μl提取检样或其他模板DNA溶液，加入10×PCR缓冲液10μl，使最终反应液中含50mmol／L KCl，10mmol／L Tris-HCl（pH 8.4），1.5mmol／L MgCl ₂及0.01%明胶；②两种引物各2μl（60μg／μl）；③加入dNTP 10μl（最终为0.2mmol／L）；④加高纯水，使反应体积为100μl；⑤将反应液100℃煮沸10分钟，加入2U Taq DNA聚合酶及50μl液体石蜡以防蒸发；⑥94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，70℃ 1.5分钟，循环40次；⑦扩增产物的电泳分析20μl扩增产物加入1／10体积的终止缓冲液，在1%琼脂糖-溴化乙啶电泳后在紫外灯下观察结果，此法可测出原检样中0.15fg的HCMV DNA。

（刘夏铭　李保仝）

七、解脲支原体的实验室诊断

解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，Uu）是一种介于细菌与病毒之间，无细胞壁结构，能在人工培养基上生长增殖的最小的原核微生物，属于柔膜体纲支原体目支原体科脲原体属。Uu是成人泌尿生殖道常见的一种寄生微生物。近年来，大量的流行病学调查表明，Uu是引起非淋菌性尿道炎的（NGU）的重要病原体之一，它可引起其他多种泌尿生殖道疾病，如男子前列腺炎、附睾炎、尿道感染性结石、不育及女性阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎、习惯性流产、绒毛膜羊膜炎、早产、宫内感染、产后热、不孕及新生儿呼吸系统和中枢神经系统疾病。

（一）生物学性状

透视电镜下观察液体培养的Uu呈大小不等的无细胞壁的圆形、椭圆形、短杆状、发芽状，以圆形为主，不呈长丝状或长链状，直径约为0.05～0.3μm，能通过0.45μm的微孔滤膜。革兰染色着色困难，呈阴性，常用吉姆萨染色，染成紫蓝色。电镜下观察，细胞膜由三层组成，厚7.5～10nm，内外层为蛋白质及糖类，中层为脂类，主要为磷脂。

Uu能在人工培养基上生长，但营养要求较高，需要供给胆固醇和酵母。Uu不能分解糖类和精氨酸，磷酸酶阴性，四唑氮盐还原阴性，含有尿素酶，可分解尿素提供能量，同时产生NH ₃和CO ₂，pH上升，使含有酚磺酞指示剂的培养基由黄变红，最适pH为6.0±0.5。在液体培养基中，不论有氧与否Uu均能迅速生长，16～24小时即能增殖到最高峰，随着pH上升，Uu会迅速死亡，应及时移种，且移种时接种量要大，否则不易生长。Uu是支原体中体积最小的一种，因此在液体培养基中生长时，培养液呈透明颜色而不混浊，可与细菌在液体培养基中生长产生混浊现象相区别。在固体培养基上Uu生长缓慢，有陷入培养基生长的趋势。一般37℃，2%～5%CO ₂条件下培养72小时左右可形成15～50μm大小的粗颗粒状或有较窄周边的油煎蛋状边缘不整齐的菌落，如在培养基中加入硫酸锰指示剂则菌落呈暗棕色。

Uu对重金属盐类、苯酚、来苏和一些表面活性剂比细菌敏感，对热抵抗力较差，55℃ 5～15分钟即死亡，低温或冷冻干燥可长期保存。因无细胞壁，Uu对作用于细胞壁的抗生素不敏感，但对作用于核糖体或核酸的抗生素敏感，此特点可作为Uu选择性培养及治疗的依据。环境中渗透压的突然改变可使菌体破裂。

Uu含有脂多糖抗原、蛋白质抗原和尿素酶抗原，前两者存在于细胞膜，尿素酶抗原存在于胞质内，为非特异性抗原。根据脂多糖抗原的不同，Uu可分为14个血清型，在患者尿道分离的多为4型，正常人群以3型居多。Uu蛋白质抗原在各菌株间呈极为相似的多条带，故称为多条带抗原（MB-Ag），是Uu的主要膜抗原，具有种特异性，既包含血清型特异抗原决定簇，又包含血清型交叉反应抗原决定簇。

（二）致病性

Uu可产生IgA蛋白酶，破坏泌尿生殖道黏膜表面存在的特异性IgA1抗体，使Uu能黏附于泌尿生殖道黏膜的表面，其细胞膜上的磷脂酶A1、A2、C可直接以宿主细胞膜上的脂质与胆固醇为底物产生代谢物质，影响宿主细胞的生物合成、膜的生物与免疫功能。Uu定居在泌尿生殖道上皮后，其毒性代谢产物如NH ₃、H ₂O ₂等可进一步对宿主细胞产生毒性作用，引起宿主泌尿生殖道炎症。

Uu引起的尿道炎，临床症状较轻。男子主要为尿道内痒，轻度尿痛、尿频、尿急，少数患者尿道口有少量蛋清样分泌物；女性患者白带较多，会阴部有异臭味。下生殖道Uu感染可上行引起男子前列腺炎、附睾炎、女性子宫内膜炎。在Uu上行感染的动物模型中，已证明睾丸可发生明显的病理损伤。黄宇烽等发现精液中脱落的生精细胞内有Uu定位，说明早在精子成熟前，Uu就可侵入生精细胞，破坏精子的正常发生。商学军等也证实Uu感染的男子精液中凋亡的生精细胞增多。徐晨用免疫电镜证实Uu可吸附于精子表面，在局部膜上摄取胆固醇与磷脂，进行代谢和蓄积毒性产物，破坏精子膜功能。吸附于精子头部、颈部、尾部中段的Uu，可掩盖精卵识别部位，造成精子前进时的流体动力学阻力增大，精子运动速度减慢，运动方式呈锯齿形和原地转圈，畸形率升高。Uu与精子表面存在共同抗原，Uu感染可诱发抗精子抗体的产生。另外有学者认为附着于精子表面的Uu能分泌神经氨酸酶类物质，随精子进入卵母细胞时，引起胚胎死亡，终止早期妊娠导致不育。男子睾丸、附属性腺感染Uu后可造成精液黏稠度、渗透压改变。感染Uu的精液进入女性体内，可引起子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎，影响受精卵着床、妊娠，导致不孕。孕期Uu感染还可引起绒毛膜羊膜炎、死胎、流产、早产、胎儿生长迟缓、胎膜早破、低体重胎儿、产后热等。

（三）流行病学

Uu在男子常寄生于尿道和阴茎包皮，在女性多为阴道，很少寄居子宫颈和尿道，孕期妇女生殖道Uu的携带率较非孕期明显增高，据报道母体携带者经产道生产的婴儿38%也能在皮肤、咽、耳道或泌尿生殖道分离出Uu，但3个月后逐渐减少，直至2岁，较大儿童及无性活动的女子携带率低于10%。国内研究发现Uu阳性主要集中在21～40岁年龄段，21～30岁尤为明显，提示与性活跃有关。Uu在人群中广泛传播，其传播途径主要为性传播和母婴垂直传播。尽管下生殖道Uu的存在不说明其有感染或有疾病存在，但国内外大量的流行病学调查表明，泌尿生殖道感染、不育不孕患者中Uu的感染率明显高于健康对照组或无症状携带者，性乱人群中常出现Uu与其他病原体的合并感染。Uu已成为泌尿生殖道感染的主要病原体之一。

（四）实验室诊断

Uu的广泛流行及其引起的不典型症状或亚临床感染，使快速、准确进行Uu的实验室诊断显得尤为重要。Uu的实验室诊断方法包括Uu的分离培养、Uu抗原及其核酸成分、血清中Uu抗体的检测。

1.Uu的分离培养

根据患者性别年龄以及疾病的不同，在无菌条件下女性患者常取阴道宫颈分泌物，偶采尿道、羊水、胎盘标本，男子常取尿道分泌物，初段尿沉渣、精液、前列腺液。婴幼儿可采集血液、呼吸道分泌物、脑脊液，Uu不耐干燥，标本采集后应尽快送检，及时接种（如不能立即接种应置于低温在6小时内接种）。

取标本0.1～0.2ml接种于pH 5.5～6.5含酚磺酞和0.05%～0.1%尿素的液体培养基中，37℃培养24～72小时，每天观察2～3次，当指示剂由橘黄色变为粉红色时，提示可能有Uu生长。立即用0.45μm微孔滤膜过滤或直接再取此培养液0.05～0.3ml转种固体培养基，37℃，5%CO ₂，95%N ₂或微厌氧环境下培养1～3天，培养基变红后低倍镜下观察菌落，出现油煎蛋样或粗颗粒状典型菌落为阳性，7天无菌落生长则判为阴性。

生长在固体培养基上的Uu菌落可用尿素酶试验进行鉴定。此试验的原理利用了Uu可分解尿素，但不分解葡萄糖与精氨酸这一有别于其他支原体的重要特性。尿素酶试验分直接法与间接法。直接法是指用新鲜配制的0.1%尿素及0.8%氯化锰（MnCl ₂·4H ₂O）混合液滴于有菌落的平皿上，5～10秒后在低倍显微镜下观察，若菌落呈暗棕色，提示有尿素酶活力。应注意检测时Uu菌落生长不能超过48小时。间接法是指在固体培养基中添加0.05%尿素及0.015%硫酸锰（MnSO ₄），当将疑有Uu生长的液体培养基接种于此种固体培养基上，置37℃，5%CO ₂中培养1～3天后，若生长出的菌落呈暗棕色，则提示有尿素酶活力。

对液体培养基变红，疑有Uu生长的标本，在转种固体培养基的同时，还可对液体培养基中的Uu进行计数。常用的计数方法有：①菌落形成单位（CFU）计数，即在稀释的倾注平板上计数菌落；②颜色变化单位（CCU）计数，是在1∶10连续稀释的含指示剂液体培养基中，根据分解尿素的颜色变化来确定。

Uu的液固培养法是目前公认的敏感方法，是流行病学调查、新方法评价的“金标准”。

该法的影响因素较多，如采样运送因素，接种时标本伴有其他微生物生长或某些抑制物质，低倍镜下检测者对固体培养基上生长的不典型菌落的漏诊均可造成假阴性结果。有人认为该法能检测80%的Uu感染。另外，该法所需时间长，全程培养时间需5～7天，不利于早期诊断与治疗。

液体培养基配制：牛心消化液（牛肉浸出液或猪胃胨消化液亦可），加1%蛋白胨、0.5%NaCl、0.3%酵母浸膏粉（鲜酵母亦可）组成基础培养基。高压灭菌后，再加入10%～20%小牛血清（马血清更好）、0.002%酚磺酞、0.1%尿素和2万U／ml青霉素（最好是钾盐），pH 6.0±0.5。

固体培养基配制：在液体培养基的基础中加入1.2%～1.5%琼脂粉和MgSO ₄（250μg／ml），高压灭菌后，待凉至60～70℃，倾倒平板即成。MgSO ₄或MnSO ₄都可使Uu形成黑褐色菌落，易于辨认。

2.Uu抗原检测

（1）免疫荧光试验：

此法为最早使用的检测Uu抗原的方法。可对固体培养基上生长的不典型菌落和同一固体培养基表面的混合血清型株进行鉴定。其一般步骤为：在固体培养的菌落上加入特异的荧光标记一抗或二抗，在荧光显微镜下观察结果。经Stemeke和Naessens改进后，可将菌落从固体培养基转置微量稀释板或24孔板上，能进行大量的临床标本的血清学鉴定。此法需要特殊的荧光显微镜，荧光染色的菌落和未染色的菌落有时不易区分，实验结果亦会受免疫荧光抗体非特异性反应的影响。

（2）免疫酶试验：

操作步骤基本与前法相同，用酶标抗体代替荧光抗体，可在普通显微镜下观察结果，其敏感性和特异性均高于前者。但该法需要的抗血清较多，染色过程中有时会冲掉菌落。

（3）免疫结合试验：

在免疫酶法的基础上发展而来，采用硝酸纤维表膜（NC）为载体，利用该膜对蛋白质较好的吸附力，与免疫酶法相结合，完成对Uu表面抗原的测定。该法不仅可用于对生长于固体培养基上的Uu菌落进行测定，也可用于直接检测液体培养基和临床标本中的Uu，该法中单克隆抗体的应用提高了特异性，结果用肉眼观察，且操作简便、快速，使该法易于普及。免疫结合试验如斑点免疫结合试验（DIBA）和斑点免疫金渗滤试验（DIGFA），其主要步骤为：①在硝酸纤维素膜上不同部位包被抗Uu单克隆抗体和阳性对照（标准Uu 1-14型混合培养液），室温干燥后4℃过夜；②封闭未饱和的蛋白结合位点；③加样；④加入酶标抗体和底物或胶体金探针；⑤洗涤；⑥结果判断，阳性出现与包被抗体形状相同的界限清楚的显色斑点，阴性无显色反应。无论出现阴性还是阳性结果，阳性对照均应出现，否则该测试无效。

3.Uu核酸检测

（1）DNA探针技术：

用缺口翻译法制备 ³²P标记的DNA探针。测定时将标本100μl点加于硝酸纤维素膜，将薄膜与放射性标记的探针在30℃杂交过夜。可检测50～100pg的DNA。该法因需核素，难以推广，人们在这方面的尝试不多。

（2）PCR检测法：

目前已报道用于PCR检测的基因有三个，即尿素酶基因、多带抗原（MB-Ag）基因和16S rRNA基因。PCR法的特异性及检测意义因所采用的引物不同而不同，常用的引物及相关资料见下图。PCR技术具有特异、灵敏、快速的特点。近几年来临床中应用PCR与培养法检测泌尿生殖道Uu的比较研究很多，发现两者之间具有很好的一致性，但PCR技术对实验条件和检查技术要求较高，一般实验室的检测结果可靠性低。且PCR检测的是DNA，死菌的DNA也是阳性结果，因此患者在Uu感染治愈后的一段时间内，PCR还可持续阳性，故不能将PCR的结果作为疗效观察的指标。

4.血清Uu抗体检测

血清Uu抗体检测可为诊断Uu感染提供血清学依据，但有些无症状者可因携带Uu而存在低滴度的抗体，因此有些学者认为血清抗体检查在常规实验室检查中用处不大。

5.代谢抑制试验

在不含尿素的Uu繁殖液体培养基中加入含Uu抗体的血清和补体，可抑制Uu生长，再加尿素孵育，培养基颜色的变化由于Uu生长的抑制而被抑制，该法既可用于Uu分型，也可用于血清抗体的检测，但操作较难，一般需4天完成，且不能区分IgG、IgM类型。

6.ELISA

以溶解的Uu膜蛋白为抗原，待测血清中特异的抗体与之结合后，再与酶标记的抗人IgG（或IgM）抗体反应，根据底物颜色深浅可定性、定量判断结果。

第七节　生殖内分泌激素检查

生殖激素（reproductive hormone）是直接作用于生殖活动，并以调节生殖过程为主要生理功能的激素。根据来源和功能不同生殖激素大致分为3类：①来自下丘脑的释放激素，可控制垂体合成与释放有关的激素，如促性腺激素释放激素（GnRH）；②来自腺垂体的促性腺激素，直接关系到配子的成熟与释放，刺激性腺产生类固醇激素，如促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）；③来自两性性腺的激素，对两性行为以及生殖周期的调节，均起着重要的作用，如雄激素、雌激素、孕激素等。另外，还有来自附性器官的前列腺素，主要作用于子宫和卵巢。

一、促性腺激素释放激素（GnRH）

促性腺激素释放激素（GnRH）又称促黄体生成素释放激素（LH-RH或LRH），是下丘脑分泌的10肽激素，是神经、免疫、内分泌三大调节系统相互联系的重要信号分子，对生殖调控具有重要意义，能直接控制腺垂体促性腺激素的合成与分泌。GnRH类似物，包括促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）、性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH-A），现已成为近年来应用最广泛的多肽类激素药物之一。下丘脑GnRH神经元分泌功能的神经调节机制与内源性儿茶酚胺、多巴胺和内啡肽有关。儿茶酚胺和多巴胺起兴奋作用，但多巴胺作用远不如儿茶酚胺强，内啡肽起抑制作用。GnRH分泌还受到性激素的反馈调节。下丘脑含有丰富的雄激素受体，主要分布于室内侧核、内侧室前核和正中基底部，尤其是弓状核等部位。睾酮主要通过负反馈作用调节GnRH和LH分泌。人或动物去势后LH脉冲频率增加，幅度增高，下丘脑GnRH含量减少；睾酮替代治疗后LH脉冲可以恢复到去势前水平，下丘脑GnRH含量增加。因此，原发性睾丸功能减退症患者，LH脉冲频率增加，睾酮替代治疗也能使LH分泌恢复正常。GnRH神经元发育不全或在胚胎期丢失造成GnRH缺乏或分泌异常以及垂体促性腺细胞上GnRH受体突变或受体后异常均可引起特发性低促性腺激素型性腺功能减退症。

二、促卵泡素（FSH）

促卵泡素（FSH）又称卵泡刺激素，是腺垂体FSH细胞合成分泌的一种糖蛋白激素，正常参考值：0.8～15mIU／ml。对于男性，FSH主要作用于精子成熟的最后阶段，促进次级精母细胞发育为精子细胞和精子，刺激支持细胞发育，并促进产生一种能结合雄激素的蛋白质，使生殖细胞获得稳定高浓度的雄激素，促进生殖细胞发育分化为成熟的精子。FSH受支持细胞分泌的抑制素的负反馈调节，如果支持细胞病变或受损，会使抑制素分泌减少或缺乏，导致FSH选择性升高。对于女性，该激素在下丘脑-垂体-卵巢调节环路中发挥作用，控制月经周期。FSH升高提示：原发性性腺功能低下症（先天性睾丸发育不全、后天性睾丸功能障碍、卵巢性侏儒病）、真性性早熟（特发性性早熟和脑性、多发性骨纤维异样增生症、重度甲状腺功能低下等）、多囊卵巢瘤、促性腺激素瘤、女性阉人症、Turner综合征、Del castillo症、Bonnevie-Ullrich症、17α羟化酶缺乏症；FSH降低提示：继发性性腺功能低下症（分娩时失血过多致垂体萎缩、手术损伤、放射性照射、各种感染等）、高泌乳素血症、性腺缺如、多囊卵巢症、Kallman综合征、Prader-Willi综合征、选择性FSH缺陷等。

三、促黄体生成素（LH）

促黄体生成素（LH）是由腺垂体嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素，主要作用是促进睾丸的间质细胞生长，促进其合成和分泌睾酮，并使睾酮扩散入生精小管，供精子生成所需。在女性则作用于卵巢促使黄体生成。正常参考值：0.4～6.8mIU／ml。LH升高提示：原发性性腺功能低下症（先天性睾丸发育不全、后天性睾丸功能障碍、卵巢性侏儒病）；真性性早熟（特发性性早熟和脑性、多发性骨纤维异样增生症、重度甲状腺功能低下等）；多囊卵巢瘤；垂体LH瘤；XYY综合征；更年期综合征。LH降低提示：继发性性腺功能低下症（分娩时失血过多致垂体萎缩、手术损伤、放射性照射、各种感染等）、假性性早熟（如卵巢肿瘤、肾上腺肿瘤、肾上腺增生等）、高泌乳素血症、Kallman综合征、Prader-Willi综合征、Friedriech综合征、Laurence-Moon-Biedl综合征、选择性LH缺乏综合征等。

四、睾酮（T）

睾酮（T）是人体最主要的雄性激素，正常参考值：3.2～15.6ng／ml。在男性，睾酮在睾丸及其他组织中被5α-还原酶作用，可生成5α-二氢睾酮，其活性大大高于睾酮。男性血浆中睾酮95%来自睾丸，成年男性每天分泌睾酮约4～6mg，肾上腺分泌很少；女性则主要由肾上腺皮质分泌，卵巢分泌很少。血浆中游离睾酮仅占2%，98%为结合型，但只有游离态具有生物活性。睾酮分泌主要受LH的调节，LH作用于睾丸间质细胞，通过膜受体cAMP系统发挥生物学作用，促进睾酮的合成分泌。同时睾酮又可对LH的分泌起负反馈作用。胎儿时期睾酮促进附睾、输精管和精囊的发育。在青春发育期，促使外生殖器及第二性征的生长发育，同时还影响精子的生成。另外，睾酮能促进蛋白合成、骨质生成和钙盐沉积、增加促红细胞生成素合成，并对维持性欲有一定作用。睾酮升高提示：睾丸间质细胞瘤、垂体功能亢进、畸胎瘤、女性多毛症、睾丸女性化、先天性肾上腺增生症、皮质醇增多症。睾酮降低提示：性功能减退、垂体功能减退、发育迟缓、男性更年期、Kallman综合征、Klinefelter综合征、高泌乳素血症、附睾炎等。

五、泌乳素（PRL）

泌乳素（PRL）是腺垂体泌乳素细胞分泌的一种多肽类蛋白激素，正常值：70～480μIU／ml。其分泌是通过垂体门脉系统的双重调节。在男性，适量的PRL不仅能与睾丸间质细胞特异性结合，通过LH促进间质细胞分泌睾酮，还作用于附睾、前列腺以维持性腺功能和形态，并且促进精子的代谢、运动和获能。PRL过高使睾酮水平减低、精子发生减少，临床表现为ED或第二性征减退。PRL升高提示：PRL腺瘤、颅脑肿瘤、原发性甲状腺功能减退、原发性性腺功能减退、男性乳房发育症、肾功能不全、肾上腺皮质功能不全、异位PRL分泌综合征等。

六、雌二醇（E2）

雌二醇（E2）是生物活性最强的天然雌激素。对于排卵的女性，血液循环中的雌二醇起初来源于一组正在成熟的卵泡，最后则来源于一个完全成熟的即将排卵的卵泡以及由它形成的黄体。雌二醇检测时浓度变化很大，以月经周期的时期而定，对于绝经后的女性雌二醇来源于雄激素在性腺外的转化，血液循环中的浓度低且不呈现周期性。对于青春期前的儿童及男性血液循环中的浓度也很低而且不呈现出周期性。雌二醇的检测可以作为女性早熟的诊断指标之一，有助于男性乳房发育的分析，评定女性雌激素减少症和产生过量的情况等。此外口服避孕药、超排卵药物和雌激素替代疗法等都会影响雌激素的分泌。

（陈智　刘继红）

七、GnRH兴奋试验

GnRH兴奋试验，即LHRH兴奋试验，是指一次注射人工合成的GnRH，观察垂体分泌促性腺激素功能的变化，了解垂体对GnRH的反应性，从而判断病变位置是在下丘脑还是在垂体。GnRH兴奋试验可有效评价男性不同性腺疾病的下丘脑-垂体-性腺轴的功能，可为体质性青春发育延迟、低促性腺激素型性腺功能减退症、假性和真性性早熟等疾病的诊治提供重要依据。

方法：有单次静脉推注法，240分钟连续静脉点滴法，静脉推注和脉冲式给药联合刺激法。一般采用简单实用的单次静脉推注法。

单次静脉推注法：一次推注100μg人工合成的GnRH（戈那瑞林），注射前15分钟和注射后15、30、60、90和120分钟分别抽取血测FSH和LH。正常成年男性，注射GnRH 2～3分钟后，LH开始上升，20～30分钟后升至高峰，此后逐渐降落，以第1次或第2次为基值，高峰时LH上升可达基值的3～6倍，FSH上升较慢较少，一般不超过3倍。但是，约有15%的正常人FSH反应不显著。

试验结果低于正常人水平或无反应，可能存在原发性垂体病变。

如果病变位于下丘脑，首次GnRH兴奋试验时可不升高，应进一步进行GnRH泵试验。采用便携式微小输液泵每90～120分钟皮下注射5μg GnRH，连续输注7天。如果垂体的促性腺激素在接受这种GnRH预处理后，再接受GnRH激发试验时反应正常，则提示性腺功能减退的原发部位在下丘脑；如果对GnRH抵抗，则提示病变在垂体或存在 GNRHR基因的突变。原发性性腺功能减退症病例的LH、FSH峰值高于期望值。

八、HCG兴奋试验

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）兴奋试验，可用于检测睾丸的内分泌储备功能。HCG具有LH活性，能刺激睾丸间质细胞分泌睾酮。目前，该实验主要用于诊断隐睾、异位睾丸（有睾酮水平升高后降低）和无睾症（无睾酮升高）。

试验方法：第一天，于早上8：00～10：00采集基础血标本，然后马上肌内注射5000IU HCG，然后于48小时和／或72小时后采集血标本。

结果分析：正常人睾酮水平应该升高1.5～2.5倍，如果升高程度达不到这个标准，考虑为原发性性腺功能减退症；如果激发后睾酮水平仍处于去势水平，考虑为无睾症或睾丸萎缩。此外，在老年男性中，由于睾丸间质细胞的储备能力下降，所以，在HCG兴奋试验中老年男性的激发后睾酮水平的上升幅度有所下降。

第八节　遗传学检查

一、男科疾病遗传学检测方法

（一）染色体检测

1.染色体核型分析

染色体是生物遗传物质，是染色质的特殊表现形态，它仅出现在细胞分裂中期，一般情况下染色体数目和形态都是恒定的。人染色体有46条，23对，其中决定男女性别的一对染色体称为“性染色体”，其他22对称为“常染色体”。目前男性的染色体检查采用的是外周血染色体核型分析，男性染色体核型为46，XY，女性染色体核型为46，XX。核型分析主要研究染色体数目与形态，因而异常染色体包括数目异常和结构异常。不育男性染色体异常发生率显著高于正常生育力男性。男方染色体核型异常，如染色体平衡易位，与不育和配偶反复自然流产有关。20世纪70年代，高分辨G显带技术开始在临床应用，目前已成为染色体核型分析的常规检查方法。荧光原位杂交（FISH）技术可用于对一些异常核型的明确诊断。

目前用于染色体核型分析的技术主要包括人外周血细胞染色体制备技术、羊水细胞染色体制备技术和染色体分带技术等，其中外周血细胞染色体制备技术最为常用。

外周血细胞染色体制备技术的主要过程：肝素湿润注射器后，抽取静脉血约0.5ml，滴加于培养液（常用RPM11640）中，轻轻混匀，于37℃培养68小时后，加入秋水仙碱使其终浓度为0.2mg／L，继续培养72小时后，取出培养物，1500r／min离心10分钟，弃上清液，沉淀加入37℃预热的KCl溶液（0.075mol／L）8ml，37℃低渗作用25分钟，立即加入新鲜配制的固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）1ml，混匀，37℃固定30分钟，1500r／min离心10分钟，弃上清液后再加6ml固定液，37℃ 30分钟或过夜，再次离心去上清液，加入固定液0.5ml制备成悬液，滴至冰水中湿润的洁净玻片上，80℃烤片2小时后显微镜检查，计数染色体数目并拍照，按照染色体大小可排序。

羊水细胞染色体制备技术的主要过程：选择妊娠16～20周妊娠妇女行羊水穿刺，羊水1500r／min离心10分钟后无菌条件下吸取上清，留约0.5ml羊水，加入F10培养液，一般培养10～14天换培养液，当见圆形细胞较多时，如上用秋水仙碱处理。

目前，临床上常用的染色体分带技术可分为两大类，第一类分带遍及于整个染色体长度上，如Q带、G带和R带；第二类只能使少数特定的带或结构显色，如C带、T带和NORS带，这些技术只在特殊患者身上较少使用。

常见的染色体异常包括染色体数目和结构畸变，包括Klinefelter综合征、真两性畸形、47，XYY、46，XX男性综合征、Y染色体与常染色体之间的异位、常染色体非整倍体如21三体等。男性不育患者中染色体畸变占2%～8%，其中Klinefelte综合征（47，XXY）最为常见。部分Klinefelter综合征和嵌合型Klinefelter综合征（47，XXY／46，XY）患者精液中可见精子。少数Klinefelter综合征患者尝试用精液精子或睾丸精子行卵细胞胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗，但其遗传风险仍有待研究，建议采用植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）。

2.Y染色体缺失检测

部分无精子症和严重少精子症患者Y染色体长臂远端存在部分缺失，因此提出在Y染色体长臂Yq11.23存在控制精子发生的基因，将其命名为无精子因子（azoospermia factor，AZF）区域，并划分为3个相互独立的区域 AZFa、 AZFb和 AZFc。Y染色体微缺失是男性不育重要的遗传学病因之一。

（1）检测方法：

Y染色体微缺失检测一般采用多重聚合酶链反应（multiplex-PCR）特异性扩增Y染色体AZF区域的序列标签位点（STS），扩增产物用电泳或杂交等方法进行检测。

1）STS位点设计：

AZF每个区域应设置2个STS位点，推荐以下6个STS位点为必须包含位点。增加更多的位点或许有更多的科学发现，但其对临床指导意义有待进一步的探讨。

AZFa：sY84，sY86；

AZFb：sY127，sY134；

AZFc：sY254，sY255。

2）内对照位点：

一般推荐sY14（ SRY）和 ZFX／ZFY，也可以选择其他管家基因作为内对照。

3）PCR：

推荐使用多重PCR技术，由于多重PCR技术有内部互相对照的效果，可以分析阴性结果是否由操作失误引起，并可提高检测效率，减少操作次数和出错的可能。对某些标本多重PCR结果有疑问时可选择单项PCR的方法。

每次PCR检测可分成A、B两组进行。每组包含AZFa、AZFb、AZFc区域各一对引物和两对内对照引物。每组内的引物组合如下：

A组：sY14（ SRY）、ZFX／ZFY、sY86、sY127、sY254

B组：sY14（ SRY）、ZFX／ZFY、sY84、sY134、sY255

4）PCR产物检测方法：

PCR扩增产物最常见的检测方法是琼脂糖凝胶电泳。由于每个泳道有5条扩增产物，若其相对分子质量相差太小，电泳时间将延长。为了提高效率，选择引物时注意各产物条带之间的长度差别是否足够大，电泳时间控制在1小时以内比较合适。

5）质量控制：

Y染色体微缺失分子诊断实验操作要严格按照相应分子诊断实验室规范和质量控制的基本原则进行，合理的内对照和外部对照是控制实验质量的关键。

PCR时必须同时做外部阳性和阴性对照。选择正常男性DNA样品为阳性对照，正常女性DNA样品为阴性对照，灭菌蒸馏水为空白对照。

6）结果的判断与优化：

AZFc缺失是临床最常见的缺失类型。若AZFc区域的sY254和sY255出现单个缺失，通常是实验错误所致。如试剂设计不合理、标本保存或DNA抽提有问题。

AZFa区域的两个STS位点出现单个缺失非常罕见，在排除实验操作失误后，判断为AZFa区域的部分缺失，但得出结论前应仔细复核。AZFb区域情况类同。

对于PCR扩增，每个实验室应该结合各自的设备条件和DNA质量进行优化。如果结果不明确或者怀疑技术方面失误，应该重新扩增。如果针对某一个特殊DNA标本，多重PCR体系效果不好，建议做单项PCR扩增。同时也可以降低退火温度重复进行PCR扩增，至于循环次数并没有常规建议。实验应该不断优化，直到结果清晰并且可重复为止。

（2）Y染色体微缺失检测的适应证：

常规检测的适应证：①男性不育症患者；②非梗阻性无精子症患者；③严重少精子症患者（精子浓度＜5×10 ⁶ml）；④无精子症患者进行睾丸活检术前；⑤男性不育症患者（如精索静脉曲张）手术前；⑥原因不明的男性不育症患者用药前。

推荐检测的适应证：①少精子症患者（精子浓度＜15×10 ⁶ml）；②精子浓度正常，但原因不明的男性不育症患者；③男性不育伴隐睾和精索静脉曲张的患者；④妻子有不明原因习惯性流产的患者。

（3）临床意义：

与临床密切相关的Y染色体微缺失检测结果的临床意义如下：AZFa缺失较为罕见，整个AZFa区域缺失通常表现为唯支持细胞综合征（SCOS），表现为睾丸体积的缩小、完全无精子症等，一般不建议行睾丸取精术（TESE）诊治，建议供精人工授精（artificial insemination by donor，AID）。

整个AZFb和AZFb+c缺失的典型睾丸组织病理学特征是SCOS或精子成熟障碍，主要停滞在初级精母细胞阶段，不推荐给这类患者施行TESE。

AZFc缺失最为常见，临床和睾丸组织学表型多种多样。AZFc缺失患者尚存精子生成能力，总的来说，有60%～70%的患者可见精液或睾丸精子，罕见情况下，也可以在自然状态下遗传给其男性后代。部分AZFc缺失的少精子症患者，其精子浓度有进行性下降的趋势，最后发展为无精子症。因此，对AZFc区域缺失的少精子症患者，可及早进行辅助生育治疗或将其精液冷冻保存，如行睾丸手术取精手术获得精子行ICSI。对于AZFc区缺失合并严重少精子症患者，助孕时建议行PGD生育女孩，以避免遗传缺陷的垂直传播。

AZFa+b+c缺失类型，一般在核型分析中可见明显的Yq缺失。对于Yq异染色质区（Yq12）的缺失，其是否合并AZF缺失常需要进行Y染色体微缺失检测以明确诊断。AZFa+b+c缺失类型一般表现为无精子症，不可能通过任何手段从睾丸中获得精子。

另外，有研究发现，在精索静脉曲张、睾丸肿瘤和单侧隐睾的不育男性中也存在AZF区域的缺失，但机制尚不清楚。

（二）基因检测

1.致病基因的测序

当怀疑某一个特定基因发生突变时，可以直接进行DNA测序。将一份抗凝血样本送至实验室进行DNA提取和分析。Sanger的经典测序方法是基于四个单独的测序反应，并产生带有标记的DNA片段，这些DNA片段通过变性聚丙烯酰胺尿素凝胶电泳被分离。这种方法相对耗时，正在被现代高通量方法所取代。所谓的“荧光终止测序法”能够在一个单一的反应中进行，这一技术的反应速度快、自动化程度髙，并可以通过计算机控制的测序仪进行操作。每个测序反应可涵盖300～1000个核苷酸，因此太长的基因需要分几个单一的反应进行。然而，这个方法花费低廉，尤其适用于临床常规检测。与男性不育相关的基因突变有如下几种：

（1）囊性纤维化跨膜介导的调节子（ CFTR）基因：

CFTR基因定位于7q31，有27个外显子，翻译成含1480个氨基酸的肽链，形成1个磷酸化调节的氯离子通道。迄今发现的800多种 CFTR基因突变中70%的患者是ΔF508的缺失。 CFTR基因突变可导致囊性纤维化病（cystic fibrosis disease，CF）、输精管缺如和梗阻性无精子症。CF在欧洲人群中常见，东方人种的发病率很低，约为1／100 000，患者表现为反复的肺部感染，胰腺分泌不足，由于绝大多数男性患者有双侧输精管缺如（CBAVD）而表现为梗阻性无精子症。目前已知的 CFTR基因突变有2000多种，并且还在不断增加。理想的突变检测方式是采集外周血对整个 CFTR基因（包括启动子区）进行测序。但限于目前还缺乏中国人群大样本的研究数据，建议可以先从已知突变位点着手开展，未来再借助高通量测序的方法更为全面、有效地检测出基因突变和多态性位点。如果男方存在 CFTR基因突变，建议进行遗传咨询，避免子代的遗传学风险。

（2）雄激素受体（AR）基因：

AR基因位于Xq1，编码917个氨基酸的 AR，由具有调节功能的N末端区、DNA结合区和雄激素结合区组成。现已发现数百种AR基因突变，主要发生在DNA结合区和雄激素结合区。 AR基因突变引起雄激素不敏感综合征（AIS），临床分为4型：完全性睾丸女性化、不完全性睾丸女性化、Reifenstein综合征和激素与受体结合不稳定综合征。轻度AIS（MAIS）可仅有男性不育这一症状。基因突变约占未经选择男性不育患者的2%，是男性不育的遗传学原因之一。

（3）Y染色体上性别决定区域（ SRY）基因：

哺乳动物性别决定是由Y染色体上性别决定区域（ SRY）基因决定的。人类 SRY基因突变引起男性→女性的性反转。XY女性表型患者出现性腺发育不全，被称为Swyer综合征。 SRY基因在未分化性腺的支持细胞前体细胞中表达，使其分化为睾丸的Sertoli细胞，启动了睾丸的分化。没有 SRY基因的表达，支持细胞前体细胞则分化为卵巢的颗粒细胞，性腺分化为卵巢。 SRY基因是转录因子，它含有35kb的DNA片段，存在于Y染色体短臂上，编码204个氨基酸的DNA结合蛋白，其中80个氨基酸是与DNA结合的保守区域，称为high mobility group（HMG）区域。在HMG区域发现了30种以上的突变，表明HMG区域是个功能重要的区域。15%～20%的XY性腺发育不良的患者是由于突变，多数发生在HMG区域。 SRY蛋白的HMG区域有3个α螺旋，与DNA结合后其呈现松散和一定的弯曲角度，进而调节其表达。

SRY基因的检测通常通过PCR进行，首先提取DNA，进行PCR反应，产物电泳后在紫外灯下观察是否存在基因。对性分化异常患者进行检测，可明确患者是否由于基因易位或基因突变所致。对XY单纯性腺发育不全患者PCR产物还需进行测序。有时还需行FISH检测以及对其下游基因进行检测。基因检测的适应证包括：性分化异常患者、XY单纯性腺发育不全患者等。

（4）胰岛素样因子3（ INSL3）：

基因和富含亮氨酸重复序列的G蛋白耦联受体8（LGR8）基因。在男性睾丸下降过程中， INSL3基因和基因的编码蛋白控制索状引带和腹股沟韧带的分化发育，而这些都是睾丸下降所必需的。一般认为， INSL3激活 LGR8受体， INSL3或 LGR8基因的突变可能导致隐睾症。目前已在睾丸下降不良患者中发现 INSL3基因的5个突变位点　（ P49S、 R73X、 P93L、 R102C、 N110K）和 LGR8基因的1个突变位点（ T222P）。尽管 INSL3和 LGR8在隐睾中的作用是明确的，但是阻断 INSL3信号通路对男性不育以及睾丸癌的影响仍需要进一步研究。

其他如 AURKC基因突变会导致大头多鞭毛精子症， DPY19L2基因异常会导致圆头精子症，5α还原酶（ SRD5A）基因突变可能会导致46XY男性性发育异常等。地中海贫血是由于人类珠蛋白基因的突变引起，包括α和β两种类型，α地中海贫血的胎儿，在孕中晚期易出现宫内死亡或早产后死亡等不良妊娠结局；β地中海贫血可导致胎儿死亡或残疾。针对广西、广东和海南等地中海贫血高发地区全体人群及曾生育过地中海贫血患儿的育龄夫妇，进行地中海贫血基因突变检测，同时配合PGD或其他产前诊断可预防地中海贫血患儿出生。因此，有必要针对上述患者进行特定基因突变筛查和遗传咨询，指导临床治疗。

2.FISH检测

荧光原位杂交（fluorescence insitu hybridization，FISH）技术不仅可用于检测分裂期细胞染色体数目或结构变化的研究，而且还可用于检测间期细胞的染色体数目及基因改变的研究。其原理如下：在合适的温度和条件下，两条单链DNA根据碱基互补原理，待测DNA与标记有荧光素的探针DNA结合形成双链，使目的DNA片段显示荧光。再通过配有特殊滤光片的显微镜进行图像采集，从而检测染色体数目及结构的异常。根据不同的要求选择不同的探针，以下染色体区域能够被特异性染色：整条染色体、染色体的一个臂、一个或所有着丝粒、亚端粒区、任意一个染色体带或染色体区域。

根据杂交的目的片段不同，FISH探针可分为整条染色体涂染探针（whole chromosome painting，WCP）、位点特异性探针（locus specific identifier，LSI）、着丝粒探针（centromere probe，CEP）等。WCP探针将某一号染色体标记上突光，凡是属于这号染色体的基因组DNA都会通过杂交而发出荧光，这在检测染色体异位和衍生染色体时非常有用。LSI探针可以将实验者特别感兴趣的基因标记上荧光，如 LSI SRY探针，可将 SRY这个特定的基因标记上荧光，通过实验可以确定此基因的存在与否和位置是否发生了改变。 CEP探针为特异显示染色体着丝粒区域的探针，主要用于检测染色体数目的异常。

FISH技术应用得较多的是单色和双色FISH，但多色荧光原位杂交技术（M-FISH）能在一次实验中检测几乎所有染色体的畸变，特别能对不明来源的染色体片段进行检测，因而也得到了广泛的应用。

3.精子DNA碎片检测

精子DNA完整性是亲代将遗传物质正确传递给子代的前提，在受精和胚胎发育过程中发挥重要作用。精子DNA完整性检测可反应精子DNA的损伤程度，精子DNA的损伤与男性不育、自然妊娠率的降低和反复流产可能有关。临床上引起精子DNA损伤的主要病因包括：①精索静脉曲张、睾丸炎、附睾炎和生殖器肿瘤等疾病；②激素、放疗、化疗药物及免疫抑制剂等药物的使用；③抽烟、酗酒等不良生活习惯及农药、重金属等环境污染物；④年龄或心理因素等。

精子DNA完整性常见的检查方法有：精子染色质结构分析试验（sperm chromatin structure assay，SCSA）、彗星试验（comet assay，又称单细胞凝胶电泳，SCGE）、末端转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）、精子染色质扩散试验（SCD）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）测定法等，本节以SCSA法为代表介绍。

SCSA是应用流式细胞仪检测精子功能的方法之一。精子发生过程中，鱼精蛋白逐步取代组蛋白与DNA结合。精子进入附睾后，鱼精蛋白的组成不再改变，但附睾中精子在逐步成熟的过程中，鱼精蛋白中大量的巯基（—SH）不断被氧化成二硫键（—S—S—），与DNA结合更加紧密，使DNA更具抗酸能力，维持了双链结构的稳定性。而染色质异常的精子，鱼精蛋白中多数巯基未被氧化，在酸的作用下易变性为单链DNA。

根据上述原理，用酸处理精液样本，再行吖啶橙（AO）染色，可对精子染色质结构进行检测。双链DNA与AO结合发绿色荧光，而单链DNA与AO结合后发出红色荧光。红色荧光占总荧光强度的比值即α _t，代表了变性DNA在细胞总数中所占的量。流式细胞术分析后可测知样本中每个精子的α _t值。再通过专用软件进行数据处理可获得DNA片段化指数（DFI，COMPα _t），反映精子染色质结构／精子DNA受损伤的程度。SCSA另一项指标为高DNA可染性（HDS），代表强绿色荧光的精子百分比，可反映精子的成熟度。未成熟精子的染色质尚未完全致密，AO染料更易与DNA结合，HDS值较高。正常生育男性的DFI值＜30%。

4.其他遗传学检测手段

（1）短串联重复序列分析短串联重复序列（STR），也叫微卫星标记，是由长度为2～7个碱基的核苷酸序列重复构成的多态性DNA标记，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度可变性，因此在同一个基因位点创造了多个不同的等位基因。 STR绝大多数位于非编码区，不转录、不编码蛋白质和RNA，不受选择压力的影响，其2条带的扩增产量相等，不存在优先扩增和漏带现象。 STR具有高度多态性、杂合度和多态信息量，主要源于核心序列重复次数个体间的差异，这种差异在基因传递过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律，均匀地分布于人类基因组。微卫星分析通常被用来创建遗传图谱、连锁分析以及对遗传性状的追踪。不仅从分子水平证实患者的缺失和重复，还能确定畸变源自亲代的哪一方，为下一次妊娠提供产前咨询。

（2）基因芯片（gene chip），又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，从而迅速得出所要的信息，以达到疾病诊断、药物筛选、DNA序列测定和基因功能研究等目的。基因芯片的原理是基于核酸分子碱基之间（A-T／C-G）互补配对的原理，利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术将基因或DNA分子排列在特定固体物表面构成的微点阵。然后，将标记的样品分子与微点阵上的DNA杂交，以实现多到数万个分子之间的杂交反应，高通量大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因的存在。

目前影响基因芯片技术广泛使用的主要因素是基因芯片制备比较复杂，除了使用已经商品化的少数几种基因芯片外，多数用于临床检测的基因芯片还处于临床前的实验室研究中。另外，商品化的基因芯片价格昂贵，分析检测设备的成本较高也影响了基因芯片技术的推广。同时，这些基因芯片还需要在临床应用中去发现其潜在的缺陷，这些都导致目前在临床诊断中基因芯片还未成为一种常规的检测手段。目前临床常用的商业型芯片根据设计探针的不同大致分为3类：寡核苷酸的微阵列（oligonucleotide-based array）、BAC克隆的微阵列（BAC-based array）和SNP的微阵列（SNP-based array）。国家卫生健康委员会（原卫生部）办公厅于2009年11月13日印发了《基因芯片诊断技术管理规范（试行）》，标志着我国的基因芯片临床应用正一步步走向规范化，这必将推动基因芯片技术在临床的应用。

（3）比较基因组杂交由于比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization，CGH）能在一次实验中检测出所有染色体的不平衡变化，且有较高的分辨率，从而得到了迅速发展。近年来，利用比较基因组杂交技术的原理发展起来的微阵列比较基因组杂交技术（array-based comparative genomic hybridization，CGHa）能检测基因组水平和表达水平的改变，使这一技术的应用前景更为广阔。

CGH是建立在共杂交的基础上，将两种不同颜色荧光标记的DNA——患者待测DNA（test DNA）和正常对照DNA（control DNA）等量混合。若患者染色体某一片段存在缺失，正常对照DNA优先与中期染色体杂交；若患者染色体某一片段存在扩增，则患者DNA优先与中期染色体杂交，若患者染色体是平衡的，即不存在缺失和扩增，患者DNA和正常对照DNA等量与中期染色体杂交。杂交形成的图像再经计算机软件处理，计算中期染色体每一点上的绿红荧光强度比，得出所有染色体的绿红荧光信号的比值，最终确定患者染色体的核型。CGH技术检测缺失的灵敏度高于扩增的灵敏度，对缺失的分辨率在2Mb左右，而对扩增的分辨率在10～12Mb左右。

（4）多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，它利用简单的杂交、连接及PCR扩增反应，于单一反应管内可同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。到目前为止被广泛地应用于基因检测及基因诊断等多个领域，如染色体数目异常、遗传性疾病、基因缺失重复、基因甲基化检测等。MLPA在染色体拷贝数微小变异检测中具有独特的优势。2009年国际命名体制规范（international system of cytogenetic nomenclature，ISCN）已将染色体微阵列（chromosomal microarray，CMA）技术、MLPA等新技术列入其中，因此遗传学新技术逐渐被临床接受。

二、男科疾病的遗传学因素

（一）下丘脑-垂体水平异常相关疾病

1.Kallmann综合征（Kallmann syndrome，KS）

是一类排除其他下丘脑垂体激素异常的情况下，因下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）分泌不足或作用缺陷导致的以血清促性腺激素下降为特征的遗传异质性疾病，伴嗅觉障碍。临床表现主要包括微小阴茎、隐睾、青少年青春发育障碍、成人性功能障碍及不育，同时部分患者还伴有双手连带运动、听觉丧失、眼球运动异常、小脑共济失调、唇／腭裂、牙齿发育不全、硬腭高及单侧肾缺如等异常。Kallmann综合征可表现为X连锁隐性、常染色体显性或常染色体隐性等多种遗传方式，可由单基因、双基因或寡基因突变引起。目前国内外仅鉴定出部分致病基因。第一个致病基因 Kagil 1于1992年采用连锁分析方法被成功定位克隆，位于X染色体上，属于X连锁隐性遗传。

2.Prader-Willi综合征（Prader-Willi syndrome，PWS）

是一种罕见的先天性疾病，因第15号染色体长臂（位置15q11-q13）异常导致的终身性非孟德尔遗传的表观遗传性疾病，这一染色体区携带基因组印迹，基因组印迹可能依据其父母来源而修饰基因的表达。在各种候选基因中， SNRPN（即核小核糖核蛋白多肽N）基因是在Prader-Willi综合征病理生理学中最确定的基因。此疾病是多系统异常的复杂综合征，会造成低肌张力、性腺功能减退、智力障碍、行为问题及长期的强烈饥饿感导致过度摄食造成威胁生命的肥胖。

3.先天性肾上腺皮质增生伴低促性腺激素性腺功能减退症

巨细胞型先天性肾上腺皮质增生是一种罕见的X染色体隐性遗传性疾病，其患病数大约为1∶12 500。此病通常伴有低促性腺激素性的性腺功能减退。这些患者在1岁内并不表现LH和FSH缺乏，而在以后发生。在大多数病例，此病由 DAX-1基因突变引起。这一基因位于X染色体短臂Xp21.3-21.2区域。此病可以以“微缺失综合征”伴Duchenne肌营养不良（假性肥大型肌营养不良）及甘油激酶缺乏的形式出现。性腺功能减退的发病机制尚不清楚，有人推测为遗传异质性。在一个家族内其临床表现可能变异相当大。应当注意的是，肾上腺功能不全甚至在新生儿期即可发生。

4.体质性青春期延迟（constitutional delay of puberty，CDP）

是青春期发育延迟常见的原因。在男性其发生率可能高达1∶40。表现为身材矮小、青春期发育延迟或停滞。GnRH脉冲发生器的激活及随后内分泌器官（垂体及睾丸）激素产生和分泌增加启动青春期发育。在CDP男孩脉冲性GnRH分泌增加延迟。研究显示绝大多数CDP病例存在常染色体显性遗传形式。具有常染色体显性作用的单一遗传因素的遗传特性外显率被认为受其他遗传和环境因素所修饰。在几个受累成员的家族已确定CDP与2号染色体着丝粒周围区（2p13-2q13）的位点显著相关。

5.遗传性垂体功能减退症

先天性垂体功能减退症罕见，可能由转录因子基因突变引起。这些因子对于垂体发育很重要。转录因子 POUIF1的基因缺陷导致垂体生长激素、催乳素和TSH缺乏，但不引起性腺功能减退。转录因子 PROP1的基因缺陷可引起LH和FSH的进一步缺乏。 PROP1突变是全垂体功能减退最常见的原因，其遗传为常染色体隐性遗传。临床表现多变。在出生后1年内，主要表现为身材矮小和甲状腺功能减退。

6.单纯性LH或FSH缺乏症　是IHH异常罕见的形式，其仅有两种促性腺激素之一缺乏。在单纯性LH缺乏症，性腺功能减退的临床表现（青春期前已经很明显）与几乎正常的睾丸体积之间极不一致。睾丸组织学显示定性维持而定量上精子发生减少和Leydig细胞萎缩。内分泌检查显示血LH降低而FSH水平正常。该病可能与 GNRHR基因突变、LH-β亚单位失活、 FSHB基因突变等有关。

（二）睾丸水平异常相关疾病

1.Klinefelter综合征（Klinefelter syndrome）

也称克氏综合征或XXY综合征，是男性患者细胞中多出1条X染色体所致。多出的X染色体导致生精细胞发育障碍。位于X染色体上逃避X染色体的基因剂量效应可能是遗传病理之一。Klinefelter综合征的常见核型为47，XXY，占80%～85%，嵌合体（47，XXY／46，XY）约占15%，其余为48，XXXY、49，XXXXY等。患者通常身材高大（与父母相比），第二性征发育异常，体征女性化，男性乳房发育，胡须及阴毛稀少，阴茎小，睾丸体积小，睾酮低下和不育。可伴有多种出生缺陷，如隐睾、尿道下裂、腹股沟疝、腭裂等。成年后易发生多种并发症，如糖尿病、代谢综合征、肥胖和骨质疏松等。Klinefelter综合征的表型随着X染色体数目的增加而加重，主要表现在机体发育严重畸形和智力低下。约40%～70%临床表现为无精子症的非嵌合型Klinefelter综合征患者通过睾丸显微取精术能获得精子，通过体外受精-胚胎移植生育子代。

2.46，XX性发育异常综合征（disorder of sex development，DSD）

是一种罕见的男性不育遗传病，发病率1∶20 000。按发育情况可以将46，XX DSD分为3种表型：生殖器正常男性、性腺发育不良的男性和男女性腺（睾丸和卵巢）共同发育的男性。46，XX男性患者临床表现为睾丸体积小、身材矮小和决定精子发生的 AZFa、 AZFb、 AZFc区域缺失导致的不育。此疾病发生最可能的原因是Y染色体上决定性腺发育的基因易位，促使男性性腺的发育。

3.XYY综合征（XYY syndrome）

系染色体数为47条，性染色体为XYY，常染色体正常的疾病。XYY男性的表型是正常的，患者身材高大，偶尔可见隐睾，睾丸发育不全并有精子形成障碍和生育力下降，尿道下裂等，但大多数男性可以生育。

4.唯支持细胞综合征（Sertoli-cell-only syndrome，SCOS）

完全性生殖细胞发育不良时，生精小管直径缩小，其内除支持细胞（Sertoli cells）外不含其他生精组织细胞，患者无生育能力。在更常见的局灶性SCOS，其睾丸组织中不同比例的生精小管含有生殖细胞，但在这部分小管中生精过程无论数量还是质量都受限。SCOS是非梗阻性无精子症最常见的病因。Y染色体微缺失是SCOS一个重要的遗传学病因。这种生殖细胞发育不良综合征也可由严重的内源性或外源性损伤所导致，如睾丸下降不全、辐射、细胞生长抑制药物和病毒感染等，因此生殖细胞发育不良也代表睾丸对严重损伤的反应。

5.精子发生阻滞

是指从精原细胞到精子的过程中生殖细胞成熟过程的中段。可发生于精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞或圆形精子水平。精子发生阻滞的病因可为原发性遗传因素或继发因素，前者可为三倍体、常染色体对称性异常（易位、插入）或Y染色体缺失（Yq11），继发性因素包括毒性因素（放疗、化疗、抗生素）或某些全身性疾病（肝肾功能不全、镰状细胞贫血）。在部分精子发生停滞于圆形精子水平的患者，其环磷酸腺苷反应调节蛋白（cAMP responsive element modulator，CREM）水平下降或消失。因为CREM阴性的生精细胞无法继续发育成熟，该信号转导因子的缺失也被认为是精子发生阻滞的病因之一。

6.Noonan综合征

是由 PTPN 11、 KRAS、 SOS 1及 RAF1基因突变引起。据估计其发病率在1∶5000至1∶1000之间。身材矮小但比例协调是这种患者的典型征象，其身高常常低于正常的三分之一。可能出现青春期发育延迟或不完全发育、骨龄平均延迟2年、睾丸下降障碍及睾丸体积减小。有争议的是男性生育障碍常见。“典型的Noonan”面部特征包括轻度上睑下垂、两眼距离过远、耳朵位置较低、宽鼻梁及反先天性愚型样的眼睑斜面。其他身体异常有短而宽的颈部、翼状颈皮、肘外翻、第5指弯曲以及头侧鸡胸和尾侧漏斗胸的胸骨畸形。最严重的畸形是先天性心脏缺陷，特别是肺动脉瓣狭窄和室间隔肥厚，这见于80%的患者，并可经心动超声显像证实。

（三）外周效应器官异常相关疾病

雄激素与男性发育息息相关，雄激素只有与功能性受体结合后才能发挥作用。在染色体和性腺异常的男性，雄激素受体（androgen receptor，AR）基因的突变可引起不同形式的雄激素不敏感（androgen insensitivity，AI）。雄激素不敏感（AI）的范畴包括女性表型的完全雄激素不敏感（complete androgen insensitivity，CAI）、生殖器畸形的部分雄激素不敏感（partial androgen insensitivity，PAI）和男性不育表型的最低雄激素不敏感（minimal androgen insensitivity，MAI）。

CAI典型的临床表现是婴幼儿腹股沟肿块和青春期闭经。患儿女性体态，有正常的青春期发育和乳房发育，但表现为原发闭经，身高较同龄正常女性高。体检可发现腋毛或阴毛稀少或无，有阴道口，但阴道短呈盲端，无宫颈、子宫和卵巢，辅助检查发现性腺位于大阴唇、腹股沟或腹腔内，患者人工周期治疗后仍无月经产生。PAI与CAI主要区别在于尚存部分雄激素作用，临床表现变化大，由外生殖器对雄激素的反应性决定，可以从严重女性化外生殖器畸形表象到男性生殖器畸形表象。典型的临床表现包括小阴茎、严重尿道下裂和阴囊壁裂，可伴或不伴有隐睾。MAI病因同样是AR基因突变，但主要发生在AR基因N端结构域中谷氨盐酸（CAG）的重复扩增，此型很少见。该类患者男性体态，无外生殖器的畸形，但可表现为男子女性型乳房和不育。通过大剂量的雄激素治疗，如果精子量足够，该类患者可有生育能力。MAIS常合并X连锁神经肌肉疾病——Kennedy疾病（延髓及脊髓性肌萎缩）。

AR基因的完全和部分缺失可见于约6%的患者。数个核苷酸的缺失和插入见于约5%的患者。点突变发生率最高，而且约85%的错义突变位于类固醇结合区域，其余的突变发生于DNA结合区域。第1外显子的突变很罕见。大多数突变是家族特异性的，迄今只有极少的研究报道重复突变，因此诊断需完整的测序。AI是X染色体隐性遗传病。AR基因突变的女性携带者，可以将突变的等位基因传给下一代，其XY染色体核型的后代一半为AI患者，XX染色体核型的后代一半为携带者。

第九节　男性生殖系统肿瘤标志物检查

一、甲胎蛋白

甲胎蛋白（AFP）是由胚胎卵黄囊和肝脏产生的一种单链糖蛋白，分子量约70 000，半衰期为5～7天。出生后其肝脏内的合成很快受到抑制，因此它在正常人血清中的含量甚微，正常值应当小于40ng／ml。在生殖系肿瘤中，绒毛膜上皮癌和精原细胞瘤的肿瘤细胞不合成产生AFP，因此这部分患者的血清AFP值通常正常；而非精原细胞肿瘤（如畸胎瘤、胚胎癌和卵黄囊瘤）的肿瘤细胞可分泌AFP，50%～80%患者的血清AFP值升高。若精原细胞瘤的AFP值升高，则需考虑其中混杂有胚胎癌等成分。血清AFP值越高，提示肿瘤恶性程度越高，预后较差。血清AFP可能对精子生成产生影响，有研究发现隐睾动物模型的睾丸中AFP表达显著升高，AFP主要由精母细胞合成分泌，向正常睾丸组织内局部注射AFP可显著抑制精子的生成。

二、人绒毛膜促性腺激素

人绒毛膜促性腺激素（HCG）是由胚胎发育中由胎盘合体滋养层细胞所分泌是一种多肽链糖蛋白激素，在胚胎生精上皮及生精小管发育中起到重要作用，分子量为38 000，半衰期为24～36小时。男性HCG的正常值应当小于5IU／L。睾丸肿瘤内的合体滋养细胞可分泌HCG，因此睾丸绒癌含有大量合体滋养细胞，几乎100%出现HCG水平升高。其他肿瘤如40%～60%的胚胎癌和10%～30%的精原细胞瘤也可因含有绒癌成分而出现HCG水平升高。睾丸肿瘤中，HCG值越高，提示肿瘤恶性程度越高，预后越差。目前尚无研究证实HCG是否存在于精液中及HCG对精子生成的影响。

三、乳酸脱氢酶

乳酸脱氢酶（LDH）是一种广泛存在与机体各种组织中的糖酵解酶，分子量约为134 000，半衰期为24小时，因此LDH在疾病的诊断中具有较高的灵敏度，但是特异性较低。LDH共有5中同工酶，其中LDH-1是精原细胞瘤中升高最显著的LDH同工酶。LDH是一种特异性不高的血清肿瘤标志物，与肿瘤体积相关，在80%进展性睾丸肿瘤中升高。LDH显著升高提示肿瘤体积变大，容易进展，术后易复发，预后较差。乳酸脱氢酶C4（LDH-C4）主要表达于睾丸及精子中，具有器官特异性，可催化乳酸和丙酮酸之间的可逆反应。国内有研究发现部分不明原因不育的患者中，精子LDH-C4表达水平下降、活性降低，影响精子运动及获能。

四、胎盘碱性磷酸酶

胎盘碱性磷酸酶（PALP）是一种由胎盘合体滋养细胞分泌的一种碱性磷酸酶同工酶，分子量64 000，半衰期24小时。出生后其含量很快下降，但在一些肿瘤中其水平可有明显升高。95%的精原细胞瘤的PALP显著升高，40%的晚期睾丸癌也出现明显升高。由于在其他肿瘤如乳腺癌、肺癌及胃肠道肿瘤中均可升高，因此PALP特异性较差，目前临床已较少使用。目前尚无研究证实PALP与精液参数及男性生育能力之间的关系。

五、前列腺特异性抗原（PSA）

前列腺特异性抗原（PSA）是由前列腺导管上皮细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶，分子量为33 000，半衰期为33小时。通常情况下，PSA主要分泌到前列腺液中，继而进入精液，并发挥蛋白水解酶的作用而使精液液化，有利于精子的活动，与男子的生育力有关。精液中PSA浓度约为0.2～0.5mg／ml，以具有活性的游离形式（f-PSA）存在。正常男性血清中的总PSA（tPSA）以结合状态（cPSA）与游离状态（fPSA）两种形式存在，tPSA浓度＜4.0ng／ml，cPSA约占80%，而fPSA约占20%。PSA仅由前列腺上皮细胞产生，因此是前列腺特异性的，是前列腺癌诊断的重要肿瘤标记物。PSA水平可受到较多因素的影响，如前列腺损伤、前列腺炎、前列腺增生、性生活、非那雄胺药物等。因此，为排除这些因素的干扰，建议导尿或膀胱镜检查48小时后，前列腺直肠指诊1周后，前列腺穿刺1个月后，射精24小时后进行PSA检查。PSA检测时患者应无急性尿潴留和前列腺炎疾病，应考虑到非那雄胺口服药物的影响。通常情况下，tPSA＜4ng／ml时基本可排前列腺癌，tPSA＞10ng／ml时高度怀疑前列腺癌，tPSA位于4～10ng／ml时不能排除前列腺癌，需同时结合其他诊断指标综合评判。近年来为了提高tPSA灰区前列腺癌患者的诊断率，提出了一些新的指标如PSA密度、PSA速率及fPSA／tPSA比值等。另外，tPSA前列腺癌危险因素等级分析也具有重要意义，对指导治疗及判断预后等指导重要作用。尽管PSA在精液的液化中起到重要作用，但目前极少研究探索其水平的高低与男性生育能力的关系。

六、癌胚抗原

癌胚抗原是一分子量约为20 000的糖蛋白，电泳迁移率位于球蛋白位置。CEA已被广泛用于癌症手术前后的治疗、复发及转移的观察指标。研究表明，精浆CEA水平比正常血清CEA上限高约8.5倍，与精液参数之间未见显著相关，在正常生育与不育组（包括附属性腺感染、精索静脉曲张、原发性睾丸损伤等）之间，其含量也未见显著差异。在分段射精时，第一部分精浆CEA水平比后一部分高，而且精浆CEA水平与睾丸损伤、输精管切除以及精浆果糖均缺乏相关性，提示CEA主要来源于前列腺。有作者报道，精子活动率等参数不正常的精液比正常精液有显著低的CEA值，提示CEA对精子分化很重要。

七、糖链抗原-125

糖链抗原-125（CA125）是一高分子量糖蛋白，为细胞膜表面抗原，广泛存在于间皮细胞组织和米勒氏管上皮的正常细胞以及这些组织来源的肿瘤细胞表面，分子量约为130 000。在精浆中存在较高浓度的CA125，平均约为血清浓度的14倍。精浆内CA125水平个体间差异较大，个体内差异较小。研究表明，不育男子精浆CA125水平比生育男子高，未妊娠夫妇中丈夫的精浆CA125水平显著高于妊娠夫妇丈夫的精浆CA125水平，但精浆和血清CA125水平与精液特性都未见显著相关。据报道，在体外受精（IVF）中，未受精组精液测得的精浆CA 125水平比受精组高，提示CA125可能与生殖能力有关，其水平越高，生殖能力越差。CA125在生殖系肿瘤中的表达还有待进一步研究。另外还有研究认为，精浆中的CA125浓度与患者年龄呈正相关，而与精液量呈负相关。

八、糖链抗原-199

搪链抗原-199（CA199）是由5个糖单位组成的糖脂，是一种低聚糖类肿瘤相关抗原，分子量大于1 000 000。CA199主要存在于胎儿的胃、肠道、胰腺上皮中，正常成人组织细胞中含量极低。精浆中含有大量的CA199，约是血清的300倍。CA199在不育男子精浆中比生育男予趋向于高水平，精子发育正常者比异常者低，表明CA199是衡量精液质量的指标。但是，研究中还指出精浆中CA125、CA199的水平与生育率并无明显相关。

九、糖链抗原-50、糖链抗原-195

糖链抗原-50、糖链抗原-195（CA50、CA195）与CA125一样，均为糖类抗原。前列腺癌患者血清的CA50水平增高。在精浆中CA195水平比血清中高约22倍，而CA50则比血清高约300倍。精浆中CA50与CA125、CA195之间具有相关性，CA195和CA199之间具有相关性。提示这些糖类抗原表达机制可能类似，但其释放机制、生理学作用有待进一步研究。

（刘卓　李明超　凌青　刘夏铭　江弘炀　胡毓安　牛永华　杨竣　张岩　刘继红）

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