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第十六章 病理学检查
第一节 男性生殖系统器官的活体标本检查
活体组织检查是疾病诊断的重要方法。随着穿刺针及穿刺方法的不断改进,穿刺成功率及安全性大大提高。近代显微镜、免疫技术和分子生物学技术的发展,使穿刺活检的意义已不限于疾病的诊断,还包括对疾病病因的探讨、发病机制的研究、病理分型、指导合理治疗、观察疾病演变及估计预后等各方面的价值。男科学活体组织检查包括范围很广,如阴茎肿块、腹股沟淋巴结、生殖器溃疡等活检。本节仅介绍较重要的前列腺、睾丸及阴茎海绵体的活体组织检查。
一、前列腺活体组织检查
前列腺癌确诊依赖于组织的病理检查,前列腺穿刺活检是前列腺癌诊断的金标准,穿刺途径多采用经会阴或经直肠前列腺穿刺法,穿刺手法又分为手指引导及B超引导下穿刺活检法。以往对于可触及的前列腺癌常行直肠指诊(digital rectal examination,DRE)引导的穿刺活检,漏诊率较高。20世纪80年代初开始,文献报道了用各种超声探头引导的经会阴前列腺活检术。但经会阴途径患者疼痛较重,活检针道较长,易发生穿刺针偏离,常需反复调整穿刺针位置,操作时间长。1989年Perderson首先采用经直肠B超(transrectal ultrasonography,TRUS)引导的经直肠前列腺活检术,克服了经会阴途径的许多缺点,具有定位准确、快捷、取材满意、患者易耐受的优点。但TRUS引导的前列腺活检需带直肠探头的B超,在一些基层医院并未普及,仍有医院通过手指引导的经会阴及经直肠途径来诊断前列腺癌。
(一)适应证
①直肠指诊(DRE)发现前列腺可疑结节,任何PSA值;②经直肠前列腺超声(TRUS)或MRI发现可疑病灶,任何PSA值;③PSA>10ng/ml;④PSA 4~10ng/ml,f/t PSA可疑或PSAD值可疑;⑤当初次穿刺结果为阴性,但DRE、复查PSA或其他衍生物水平提示可疑前列腺癌时,或穿刺病理发现非典型性增生或高级别PIN时,可考虑再行穿刺。
(二)禁忌证
①处于急性感染期、发热期;②有高血压危象;③处于心脏功能不全失代偿期;④有严重出血倾向的疾病;⑤处于糖尿病血糖不稳定期;⑥有严重的内、外痔,肛周或直肠病变。
(三)术前准备
①常规行血、尿、粪常规及凝血功能检查,有肝肾功能异常病史需复查肝、肾功能;②如需通过MRI评估临床分期,建议在前列腺穿刺活检前进行;③经直肠前列腺穿刺活检之前,应用喹诺酮类抗生素3天,经会阴前列腺穿刺活检之前不需要预防性应用抗生素;④常规清洁肠道,开塞露可代替灌肠,穿刺前碘伏清洁肠道;⑤停用抗凝及抗血小板药物,阿司匹林及其他非甾体抗炎药穿刺前停用3~5天,氯吡格雷应停用7天,噻氯匹定停用14天,双香豆素停用4~5天。
(四)麻醉及体位
局麻。视不同方法及患者情况采用截石位、胸膝位及左侧屈曲位。
(五)操作方法
1.经会阴前列腺穿刺法
患者取截石位,常规消毒会阴,铺巾。用0.5%普鲁卡因沿会阴正中作皮及内皮下浸润麻醉。
(1)手指引导法:
左手示指肛门内摸准前列腺结节或穿刺部位。右手执穿刺针于局麻部位刺入达病变部位前方。应用Tru-cut针,针芯尖与针管水平齐同刺入抵达结节或穿刺部位前方,将针芯推入1~1.5cm,针芯固定而针管向前推进1~1.5cm,然后将针芯针管一并拔出,可得组织于针芯凹槽内。
(2)TRUS引导法:
直肠探头涂耦合剂及外套避孕套,缓慢插入直肠,在直肠超声定位下,从会阴部进针行前列腺穿刺活检。
2.经直肠前列腺穿刺法
患者取胸膝位或左侧屈曲卧位,肛门周围皮肤常规消毒铺巾,直肠内碘伏消毒2遍。局麻或不需要麻醉。
(1)手指引导法:
先作肛查摸准病变或穿刺部位。左手执针,针紧贴指尖腹侧,针斜面与指尖弧面相同,针随左手指轻轻插入直肠达病变或穿刺部位,右手将针芯推入1~1.5cm,针芯固定而针管向前推进1~1.5cm。将针芯针管一并拔出。退针后用示指按压直肠穿刺部位数分钟。
(2)RUS引导法:
直肠探头尖部涂一层耦合剂外套避孕套。将无菌活检针固定装置安装在探头上,探头缓慢插入直肠,用矢状面扫描定位可疑病灶区或穿刺部位。穿刺部位移至穿刺线上活检枪射程范围之内,把已装好无菌Tru-cut活检针的活检枪沿活检枪固定装置推进,至紧贴直肠黏膜时按动发射钮,枪击后拔出活检枪。取出活检组织,轻轻刮下置于活检瓶中。
(3)经直肠细针穿刺抽吸活检法:
患者取截石位,消毒方法同经直肠穿刺法,不需要麻醉。术者左示指戴上戒指式穿刺针导引器并涂上润滑剂,右手持配有23号细长针及10ml注射器的手枪式把柄,把细针插入导引器内,针尖露出戒指外,用戴戒指的示指插入直肠达到前列腺部,当触到病变区或穿刺部位时,将细针用力刺入穿刺部位内,右手利用枪式把柄使注射器造成负压,针尖在穿刺部位内移动,利用负压将病变部细胞或组织吸引到针腔内,应注意针尖不要退出到直肠,以避免吸入肠内容物污染标本。为避免针尖拔出后空气进入注射器,而使针腔内的标本也随之进入注射器。在拔除内套针前应先消除负压,轻轻地释放活塞压力,以便不再产生吸吮。针尖抽出后将其与注射器分离,让空气充满注射器,再安放好针头。将针内组织排到玻片上。此操作可重复几次以取得足够的标本。细针穿刺抽吸活检亦可在B超引导下进行。活检取出的标本并非完整组织,而是细胞。
3.穿刺针数和部位
前列腺6针系统穿刺法因穿刺阳性率仅为20%~30%,已不作为初次穿刺的首选。前列腺体积为30~40ml的患者,穿刺活检绝不少于8针,推荐10~12针系统穿刺作为初次前列腺穿刺,调整超声探头位置,在前列腺左侧叶的尖部、中部和基底部各穿刺1针。在左侧叶外周带外侧穿刺2~3针,同法对右侧叶进行穿刺,穿刺总针数为10~12针。
4.术后处理
活检当天卧床休息,勿进食刺激性饮食。给予抗生素3天,注意血尿及便血情况,严重时给止血药物。
5.并发症及防治
(1)血尿及大便带血:
穿刺后1~2天内有血尿及大便带血,一般不严重,不需要特殊处理。如血尿严重时可留置三腔导尿管牵引压迫止血。
(2)发热:
少数患者可有发热,多为菌血症所致,术后常规给予抗生素。经直肠途径较经会阴途径活检易发生感染,故术前术后给予抗生素是重要的。感染严重时应及时行细菌培养并调整抗菌药物。
(3)迷走神经反射:
主要表现为呕吐、心动过缓和血压下降,可将患者体位调整为头低脚高位并静脉输液。以缓解相关症状。
二、睾丸活体组织检查
睾丸活检在男科学中是一重要的检测方法。通过睾丸活检观察,能直接估价生精的功能及生精障碍的程度,估价生育能力并提供直接资料。对男子不育症的诊断,治疗措施的选择和判断预后是必不可少的方法。由于睾丸受到损伤后,淋巴细胞会进入生精小管内,导致睾丸自身免疫反应发生,精液溢出到睾丸输出道外,其抗原成分亦会刺激抗体免疫系统,产生精子抗体而发生睾丸自身免疫反应,抑制精子发生而引起不育,因此,睾丸活检应慎重选择,掌握好指征。在睾丸活检前应仔细检查及作精液细胞学、内分泌、细胞遗传学等检查,对通过这些检查就可诊断的疾病,如双侧输精管缺如、双侧睾丸容积小于10ml的小睾丸、Klinefelter综合征、Kauman综合征等,不必作睾丸活检。睾丸活检通常只作一侧,必要时可作双侧活检。
(一)适应证
鉴别生殖道阻塞或睾丸生精障碍的无精子症。至少两次精液分析均提示无精子症并排除逆行射精。严重少精症诊断和预后判断评价睾丸固定术、精索静脉曲张手术后的效果。
(二)禁忌证
睾丸肿瘤、全身出血性疾病、阴囊皮肤及内容物急性炎症。
(三)术前准备
清洁外阴,备皮。
(四)麻醉及体位
局麻,平卧位。
(五)操作方法
1.经阴囊皮肤穿刺活检
碘伏消毒皮肤,铺孔巾。1%普鲁卡因局麻及精索内神经阻滞。左手固定睾丸,右手用粗的组织穿刺针抽取睾丸组织条,或用带倒钩的细针钩取生精小管组织送检。
2.手术方法
碘伏消毒皮肤,铺孔巾。1%普鲁卡因局麻及精索内神经阻滞。阴囊前壁作1cm小切口,逐层切开达睾丸白膜,白膜上作小切口,可见睾丸组织从小切口内突出,用锐剪刀切除组织块约4mm 3左右,置于固定剂小瓶内,白膜用3-0可吸收线缝合,放置橡皮膜引流条,皮肤全层用1号丝线褥式缝合。固定剂不用甲醛溶液,因其破坏睾丸管道结构,通常选用Bouin液或Zenker液固定。若用做电子显微镜观察则用戊二醛液固定。
3.阴囊镜睾丸活检
碘伏消毒皮肤,铺孔巾。1%普鲁卡因局麻及精索内神经阻滞,阴囊前壁皮肤作1cm小切口,逐层切开达睾丸白膜表面,置入阴囊镜,可用膀胱尿道镜代替,观察鞘膜腔、睾丸、附睾、精索有否异常病变,附睾有否畸形及发育不良,睾丸白膜活检区域视野定位,退镜。白膜上作小切口,可见睾丸生精小管组织从小切口凸出,用锐剪刀切除组织约4mm 3左右,置于Bouin液或Zenker液固定剂小瓶内,白膜用3-0可吸收线缝合,再次置镜,观察活检处有否活动出血点。如有出血点应利用阴囊小切口加针缝合,置橡皮膜引流条,皮肤全层用1号丝线褥式缝合。
(六)术后处理
托起阴囊,卧床休息24小时,注意阴囊切口渗血情况,应用抗生素3天。
(七)术后并发症及防治
1.阴囊皮肤出血及皮下血肿
阴囊皮肤仔细缝合,局部处理。
2.感染
术后应用抗生素。
三、阴茎海绵体活体组织检查
近年来有很多临床试验和检测手段提高了阴茎勃起功能障碍的诊断水平,但还需要直接方法以评价海绵体功能。阴茎海绵体活体组织检查可直接评价海绵体的结构与功能。海绵体内的平滑肌细胞舒张可扩大血窦空间,使血液滞留其中,血窦内压提高,继而对阴茎白膜下静脉产生较大压力,阻断其血液回流使阴茎勃起,当平滑肌收缩时,血窦间隙缩小,对白膜下静脉的压力减轻,血液回流增加,勃起硬度减退。因此,平滑肌细胞在阴茎勃起中起关键作用,其本身的功能减退与丧失或结构的萎缩与消失是导致勃起失败的重要因素。心因性勃起功能障碍其结构正常而血管性勃起功能障碍平滑肌减少,结缔组织增多。通过直接方法来评价海绵体结构与功能,可以避免一些不必要的外科手术并能使手术成功率提高。
(一)适应证
判断勃起功能障碍类型,了解平滑肌密度和胶原纤维含量、海绵体结构、超结构病理变化。指导血管成建术及静脉结扎术的选择及术后疗效的估计。
(二)禁忌证
全身出血性疾病、阴茎皮肤感染者。
(三)术前准备
清洁外阴,备皮。
(四)麻醉及体位
局麻,平卧位。
(五)操作方法
碘伏消毒皮肤,铺孔巾。1%普鲁卡因阴茎根部阻滞麻醉。龟头冠状沟后,阴茎背侧皮肤切开2~3mm,术者一手使阴茎保持牵直,另手持活检枪,在皮肤小切口处进入与阴茎同轴方向通过白膜至海绵体,按动板机穿刺采集标本,取出组织放在盛有Bouin溶液的活检瓶中。
(六)术后处理
阴茎纱布环形包扎12~24小时,应用抗生素1~2天。
(七)术后并发症及防治
一般无并发症发生,偶可见阴茎皮下血肿。注意活检后阴茎包扎。
第二节 男性生殖系统器官的手术标本检查
一、标本的检查与取材
对手术中所得标本,均应在固定后作病理大体检查描写,再进行取材切片。检查包括描述标本的大小、形状、表面和切面颜色、硬度、病变的部位、大小、形状和特征性改变与周围组织的关系等,对于小标本如前列腺、睾丸组织标本应在取材时用试镜纸包裹后进行脱水处理。对阴茎癌等肿瘤标本描述时应将肿瘤的生长部位、大小、溃疡、向阴茎浸润情况、切缘与肿瘤浸润处的距离以及纵切面肿瘤的浸润情况描述。对于肿瘤标本,淋巴结取材十分重要。寻找淋巴结要耐心细致,淋巴结有时很小、不容易被检及或被周围的软组织掩盖,寻找淋巴结之前先取好组织切缘。前列腺切除标本应做多个切面,多点取材,防止漏取病变,对于经尿道前列腺电切除标本,应在取材时称重量后,多块取材,尤其取较硬组织。必要时应对前列腺标本全部包埋制片。
二、常规病理检查技术
(一)标本的固定
对于临床送检标本(包括前列腺、睾丸、阴茎等)脏器或组织在收到新鲜标本后应尽早做大体检查并适当处理,使标本保持良好的形状并得到充分固定。常用的固定液:
1.甲醛溶液(formalin)
①10%中性甲醛溶液:其配制是甲醛溶液10份,水90份,放入适量碳酸镁或碳酸钙作为中和剂,中和后,前者pH约为7.6,后者约为6.3~6.5。目前病理常规中常用10%中性甲醛溶液。②缓冲甲醛溶液:10%甲醛溶液每1000ml加入酸性磷酸钠(NaH 2PO 4)4g及无水磷酸氢二钠(Na 2HPO 4)6.5g,其pH为6.8~7.0。③甲醛溶液钙固定液:无水氯化钙1g,甲醛溶液10ml,蒸馏水90ml。甲醛溶液适用于各种组织及多种染色方法,可保存脂肪、脂类组织。
2.乙醇
具有固定兼脱水作用,固定速度较慢,易使组织变脆,故一般不作病理技术常规使用,但可以临时作为甲醛溶液的代用品。组织固定时,宜先用80%乙醇固定数小时再换95%乙醇继续固定。
3.睾丸组织固定液
睾丸主要组织(生精小管、间质纤维等结构疏松,在对其组织固定时应选择收缩作用小,染色效果好的固定液,以便于更好地观察生精小管及生精小管内各级生精细胞的形态和结构),常选用Bouin液、Carnoy液或Zenker液,配方如下:①Bouin液:饱和苦味酸水溶液75ml,甲醛水溶液(40%)25ml,冰醋酸5ml,三种溶液比例为15 ∶5 ∶1。通常所取睾丸组织较小,在此溶液中固定以10小时为宜,特别是需行免疫组织化学检测地标本应在Bouin液中固定。②Carnoy液:三氯甲烷30ml,冰醋酸10ml,无水乙醇6ml,三种溶液比例为15 ∶5∶3。该固定液渗透性较好,对睾丸组织固定以1.5~2小时为宜。③Zenker液:氯化汞50g,重铬酸钾25g,硫酸钠10g,蒸馏水加至1000ml即为Zenker原液。使用时,取Zenker原液95ml,加冰醋酸5ml,配制成工作液使用。固定时间一般不要超过24小时,在切片染色前,必须用碘除去汞盐的沉着。应用该固定液的组织,细胞核及细胞质染色十分清晰。
(二)组织的脱水透明和浸蜡
标本经取材后,进行脱水处理程序(标本未经充分固定,不得进入脱水处理)。脱水一般以乙醇为组织脱水剂,自低浓度向高浓度渐进并多次更换,使组织所含水分才能充分除去,透明浸蜡才能顺利进行。目前一般性的医院,其标本的脱水透明和浸蜡是由自动脱水机完成。其一般步骤和时间见表16-1。
表16-1 不同厚度组织块的脱水、透明与浸蜡步骤与时间
(三)组织包埋
在病理技术工作中,组织包埋是在标本经固定、脱水、浸蜡、透明之后,目前常用的包埋方法是石蜡包埋。包埋时应注意以下几点:①包埋用蜡除熔点适宜外,应清洁无杂质或异物,最好在熔融以后经沉演过滤才用于包埋。②包埋时先将熔蜡注入适当大小的模型,然后以热钝头镊夹取组织块,使病灶或指定面向下,埋入熔蜡中,并用镊子轻轻按压,使组织在蜡中安放平正。注意勿使组织碎屑或杂物混入其中。③组织埋入蜡块中后,随即将该组织的号码埋入蜡块一侧。④蜡屑凝后,即移入冷水中或冷冻台上使其加速凝固。
(四)染色
1.苏木素-伊红(HE)染色
此染色方法是病理常规检查技术的基本方法。其石蜡切片染色方法如下:①二甲苯去蜡(经2次)5~10分钟。②无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1~2分钟,然后蒸馏水洗3分钟(换数次)。③苏木紫液染色约5分钟(视染液种类和着色情况增减)。④水洗:1%酸性乙醇(盐酸1ml,7%乙醇99ml),或1%盐酸分化,显微镜下控制。⑤流水浸洗至少15分钟,至细胞核显蓝色。也可短时水洗后,浸于40℃温水使核变蓝。显微镜观察,若核染色过深或不足,应再分化或重染。⑥伊红液染1~2分钟后,95%乙醇2次,无水乙醇2次,每次约1~2分钟。⑦苯酚二甲苯(1∶3)5分钟。⑧用中性树胶或DPX以盖片封片,贴标签。
对于有些前列腺、睾丸或阴茎发生肿瘤,由于在HE染色下尚不能完全确定其肿瘤组织来源时,如鉴别上皮性肿瘤与间叶性肿瘤,一些黏液性腺癌,肌源性肿瘤与纤维源性肿瘤,可以通过特染技术提高诊断准确率。
2.Van Gieson染色
①切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至蒸馏水洗;②铁苏木紫液染5~10分钟(用哈里斯苏木紫浓染亦可),水洗3分钟;③苦味酸品红水溶液染3~5分钟;④苦味酸乙醇饱和液分化并脱水数秒至1分钟,镜下控制;⑤无水乙醇迅速脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。结果细胞核紫褐色,胶原纤维红色,平滑肌纤维和神经胶原呈黄色。
3.Masson三色染色方法
①切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至蒸馏水洗;②铁苏木紫或天青石蓝苏木紫染细胞核,分化至背景无色;③自来水洗5分钟,蒸馏水洗;④变色酸-亮绿染液染5~10分钟,镜下观察所需程度;⑤1%醋酸水溶液洗1分钟;⑥亮绿-橘黄G溶液染色5~10分钟,镜下观察到所需程度;⑦1%醋酸水溶液洗1分钟;⑧乙醇脱水,二甲苯透明,封片。结果胶原纤维绿色,平滑肌、纤维素和纤维素样物橘红色,细胞核棕色。
4.网状纤维染色
①切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至蒸馏水洗;②浸入0.25%高锰酸钾中5分钟,水洗;③浸入5%草酸液中漂白;④蒸馏水洗涤数次;⑤浸入碳酸铵银液中放入56℃温箱约30分钟,以切片呈现棕黄色为度;⑥蒸馏水速洗;⑦在20%中性福尔马中还原5分钟,水洗;⑧浸入0.2%氯化金水溶液5分钟,水洗;⑨浸入5%硫酸钠1分钟,充分水洗;⑩根据需要进行复染 乙醇脱水,二甲苯透明,封片。结果网状纤维呈黑色。
5.过碘酸-希夫(PAS)染色
①切片脱蜡,经各级乙醇至蒸馏水洗;②1%碘酸水溶液氧化10分钟,蒸馏水充分洗;③希夫试剂染色10~15分钟;④流水冲洗10分钟;⑤苏木紫淡染细胞核,流水洗;⑥乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。结果阳性物质(如含糖原或中性多糖等物质)呈红色。
6.阿尔新蓝-PAS染色(AB/PAS)
①切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇,入蒸馏水洗;②经3%醋酸洗2分钟,入阿尔新蓝染液10~30分钟;③3%醋酸洗2分钟,流水洗2分钟,蒸馏水洗;④1%过碘酸10~15分钟;⑤经蒸馏水洗后入希夫试剂10~15分钟;⑥流水洗5~10分钟后,常法淡染苏木紫;⑦乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。结果AB阳性物质呈蓝绿色,PAS阳性物质呈红色。
除此以外,还有如脂肪染色、脂褐素染色等在此不作介绍,可参阅有关产品方面书刊。
三、免疫组织化学技术
运用免疫组织化学技术研究或诊断前列腺、睾丸或阴茎的病变,尤其在肿瘤性病变的发生发展,组织来源以及判断预后均有十分重要的作用。目前,外科病理中常用的方法包括用于冷冻组织切片和石蜡组织切片中,下面以石蜡切片为例介绍其一般的要求和方法。
(一)直接法
石蜡切片方法为:①石蜡切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗;冷冻切片经冷丙酮固定10分钟后,冷风吹干;②切片浸于新配的0.5%过氧化氢甲醇液,室温30分钟,或3%过氧化氢,室温5分钟,封闭内源酶活性;③蒸馏水、PBS各洗3次,每次5分钟;④根据需要,用微波辐射处理,或蛋白酶消化处理,行抗原修复;⑤切片经PBS洗3次,每次5分钟;⑥无关动物的正常血清(适当稀释)培育切片,温盒内37℃培育30分钟;⑦去除多余动物血清,滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体,或增强的酶标多聚物一步法抗体于切片上,湿盒内37℃培育30~60分钟;⑧PBS洗3次,每次5分钟,再用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液pH 7.6洗5分钟;⑨切片用新配的底物显色,8~12分钟,镜下观察控制。底物配法:二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)50~70mg,0.05mol/L Tris-HCl缓冲液pH 7.6 100ml,3%过氧化氢1ml;⑩Tris-HCl缓冲液洗,流水洗。 苏木紫淡染细胞核。 脱水、透明、封片。
(二)间接法
石蜡切片方法为:①石蜡切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗;②切片浸于新配的0.5%过氧化氢甲醇液,室温30分钟,或3%过氧化氢,室温5分钟,封闭内源酶活性;③蒸馏水、PBS各洗3次,每次5分钟;④根据需要,用微波辐射处理,或蛋白酶消化处理,行抗原修复;⑤切片经PBS洗3次,每次5分钟;⑥无关动物的正常血清(适当稀释)培育切片,湿盒内37℃ 30分钟;⑦滴加第一抗体(适当稀释)于切片上,湿盒内37℃培育30~60分钟;⑧PBS洗3次,每次5分钟;⑨过氧化物酶标记抗体或用增强的酶标多聚物抗体滴加切片上,湿盒内培育,37℃ 30分钟;⑩PBS洗3次,每次5分钟,Tris-HCl缓冲液洗5分钟 切片入新配的底物显色(同直接法); Tris-HCl缓冲液洗,流水洗; 苏木紫淡染细胞核。 脱水、透明、封片。
(三)过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(PAP)法
①石蜡切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗;②切片浸于新配的0.5%过氧化氢甲醇液,室温30分钟,或3%过氧化氢,室温5分钟,封闭内源酶活性;③蒸馏水、PBS各洗3次,每次5分钟;④根据需要,用微波辐射处理,或蛋白酶消化处理,行抗原修复;⑤切片经PBS洗3次,每次5分钟;⑥无关动物的正常血清(适当稀释)培育切片,湿盒内37℃ 30分钟;⑦适当稀释的第一抗体覆盖切片,放湿盒内37℃ 30~60分钟。或于37℃培育后,再于4℃过夜;⑧PBS洗3次,每次5分钟;⑨第二抗体覆盖切片,放温盒内37℃ 30分钟;⑩PBS洗3次,每次5分钟; PAP复合物覆盖切片,放温盒内37℃ 30分钟; PBS冼3次,每次5分钟,0.05mol/L Tris-HCl缓冲液洗5分钟 切片入新配的底物显色(同直接法) Tris-HCl缓冲液洗 苏木紫淡染细胞核; 脱水、透明、封片。
(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法
①石蜡切片于二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗;②切片浸于新配的0.5%过氧化氢甲醇液,室温30分钟,或3%过氧化氢,室温5分钟,封闭内源酶活性;③蒸馏水、PBS各洗3次,每次5分钟;④根据需要,用微波辐射处理,或蛋白酶消化处理,行抗原修复;⑤切片经PBS洗3次,每次5分钟;⑥无关动物的正常血清(适当稀释)培育切片,湿盒内37℃ 30分钟;⑦第一抗体培育切片,放湿盒内,37℃ 30~60分钟;⑧PBS洗3次,每次5分钟;⑨酶联SPA培育切片,湿盒内37℃ 30分钟;⑩PBS洗3次,每次5分钟,Tris-HCl缓冲液洗5分钟 加入新配的底物显色(同直接法) Tris-HCl缓冲液洗 苏木紫淡染细胞核 脱水、透明、封片。
(五)其他方法
除了上述较常用的方法以外,临床病理工作中较少有的如免疫金法、免疫金银法、双重免疫酶染色、双重免疫荧光染色、双重免疫酶-荧光染色等。这些方法主要用于科研工作中。
随着新技术、新方法的应用,形态定量病理及分子病理技术,电镜检查技术已被广泛运用于男科疾病的研究和诊断工作中,有关内容可参阅相关书刊,在此不作介绍。
(杨金瑞 杨竣 凌青)
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