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第二节 微生物学检查
一、标本收集
痰液检查是帮助寻找呼吸系统疾病病原的方法之一。痰是气管、支气管及肺泡的分泌物，在正常情况下，呼吸系统分泌物甚少，不致引起咳痰，但若呼吸系统黏膜受刺激，呼吸系统分泌物借助于支气管黏膜纤毛上皮细胞运动及咳嗽动作，将其排向口腔。
（一）临床收集痰液标本时的注意事项
1.采集痰液标本的时间以清晨为最好，亦可随时采集送检。
2.年长儿采集时，最好嘱患儿先用清水漱口数次，再用力吸气后咳出痰液，尽量防止口腔内的杂菌混入。
3.婴幼儿咳出的痰液至口腔时即被吞咽入胃，此时可抽取胃液，进行检查。
4.要作培养的痰液，应收集到无菌容器内，并立即送检。
5.作结核菌培养的痰，如不能立即培养，应放于冰箱内，以防止杂菌生长。
6.作百日咳杆菌培养可用咳碟法，即当患者咳嗽时，将含血培养基平皿置于距患者口部5～10cm处，待飞沫入平皿内，立即将咳碟送37℃温箱培养，目前认为鼻咽拭培养法优于咳碟法。
7.支气管分泌物的采集，应由专科医师用支气管镜直接自患儿支气管内采取。
8.临床医师要亲自观察痰液的颜色、性状、是否带血等，嗅其气味，不应单纯地依靠实验室检查报告。
（二）咽拭子与鼻咽拭子样本的采集及注意事项
1.采集时间应在抗生素使用之前，以晨起采集为宜。
2.咽拭子采集时应嘱咐患者以清水漱口，将患儿舌头向外拉使悬雍垂尽量向外牵引，取出培养管中的拭子轻柔、迅速地擦拭两侧腭弓、咽及扁桃体上的分泌物，放入无菌容器及时送检。
3.鼻咽拭子采集时应嘱咐患者以清水漱口，用拭子深入鼻腔内约1cm，在鼻内灶边缘部分先用力旋转拭子，停留10～15秒放入容器及时送检。
二、检查内容
（一）显微镜检查
在作痰液显微镜检查前，必须先挑选最可疑部分作检验标本，如灰白色或黄色的干酪样物质、黄绿色或微红色的干酪样小粒及鲜红色的血丝等。
（二）涂片染色检查
涂片时应选择痰内白色条索状或白色颗粒状部分或血丝，抹成均匀薄片数张，按检验目的可分别以瑞氏、革兰氏或抗酸染色。
1.瑞氏染色
常见有上皮细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞，肺肿瘤患者可检出肿瘤细胞。上皮细胞来自肺泡、鼻腔、气管、支气管、喉头室处，圆形、柱状及鳞状的上皮细胞无临床诊断价值。嗜中性粒细胞、淋巴细胞在正常人痰内可少量存在，在呼吸道化脓性炎症时则大量增多。嗜酸性粒细胞几乎在任何痰液中都能见到极少量，在过敏性支气管哮喘、肺吸虫病、热带性嗜酸性粒细胞增多症患者的痰中，数量可显著增多。肺肿瘤并发肺部炎症时，亦可致痰内细胞改变，应注意与肿瘤细胞相鉴别，如鳞状上皮细胞化生（角质化上皮细胞）。吞噬细胞由吞噬异物不同而区分为心力衰竭细胞、载炭细胞及吞噬脂肪的泡沫细胞等。
2.革兰氏染色
在痰中存在的细菌很多，多属非致病菌，若要检验致病菌，必须作细菌培养鉴定。
3.抗酸染色
抗酸染色主要检验结核分枝杆菌及麻风杆菌，痰中常见者为结核分枝杆菌。直接涂片应选取标本中的黄色、绿色、有血丝及带颗粒部分。为提高抗酸杆菌检出的阳性率，可进行“浓集法”检查。
（三）呼吸道细菌检查
一般呼吸系统常见细菌，可以用革兰氏染色加以辨别。临床常见的细菌，见表4-1。
表4-1 痰液及支气管分泌物中常见的细菌
1.细菌培养
（1）分离培养：常规接种血平板、巧克力平板及麦康凯平板，35℃普通和二氧化碳培养箱孵育18～24小时。如发现可致病菌落，则继续培养至48小时观察。如在平板上未发现特定的致病菌，但常居菌（常居菌也称固有性细菌，是能从大部分人的皮肤上分离出来的微生物，是皮肤上持久的固有的寄居者，不易被机械的摩擦清除，如凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌类、丙酸菌属、不动杆菌属等。）比正常情况明显增多或近似纯培养，考虑可能为菌群失调或菌群失调症。
（2）为了检出特定的致病菌，可以使用选择性培养基，如脑膜炎奈瑟菌选择双抗平板、流感嗜血杆菌选择性平板等，可以提高检出率。
2.生化检查
根据细菌具有不完全相同的酶，分解不同营养物质的特点，以及新陈代谢产物的不同，各产物又具有不同的生物化学特性。因此可用生化方法来鉴定细菌的类别。常见的生化反应有以下几种：
（1）糖类代谢实验：
包括糖发酵试验、甲基红（M-R）试验、伏普试验（V-P试验）、β-半乳糖苷酶试验、七叶苷水解试验等。
（2）氨基酸和蛋白质代谢实验：
靛基质（吲哚）试验、硫化氢试验、氨基酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验、尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、明胶液化试验等。
（3）碳源和氮源利用试验：
枸橼酸利用试验、丙二酸盐利用试验等。
（4）酶类试验和溶菌抑菌试验：
脂酶试验、卵磷脂试验、磷酸酶试验、DNA酶试验、凝固酶试验、氧化酶试验、触酶试验、胆汁溶菌试验、CAMP试验、硝酸盐还原试验等。
（5）抑菌试验及其他：
Optochin试验、杆菌肽敏感试验、O/129抑制试验等。
3.细菌耐药性检查
抗菌药物不能有效抑制细菌生长繁殖或杀灭细菌，称为抗菌药物的耐药性。随着临床上抗生素的广泛使用，细菌出现耐药性，导致临床治疗失败。
（1）K-B纸片琼脂扩散法：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分，溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性。
（2）稀释法：
稀释法是定量测定抗菌药物抑制细菌生长作用的体外方法，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。
（3）E试验：
E试验是一种结合了稀释法和扩散法的原理及特点测定微生物对抗菌药物敏感度的定量技术，可以在琼脂培养基上判定某抗生素对微生物的最小抑菌浓度。
（四）呼吸道其他微生物检查
肺炎支原体和肺炎衣原体主要借助于分离培养、抗原抗体检测和分子生物学的方法进行检测。
（五）呼吸道病毒检查
引起呼吸道感染的常见病毒，包括呼吸道合胞病毒（RSV）A型和B型、腺病毒3、腺病毒7、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、柯萨奇B组病毒、埃可病毒。其中，多种病毒具有感染力强、传播速度快、潜伏期短、发病急等特点，且新的致病性病毒还在不断地被发现，如人类偏肺病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等，给临床疾病的诊断以及治疗造成了极大地困难。
呼吸道病毒检测目前国内外多采用病毒分离培养法、间接免疫荧光法、直接免疫荧光法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法（APAAP）、生物素-链霉亲和素-过氧化物酶法、酶联免疫吸附法、病毒快速检测法、分子生物学法。
（六）呼吸道真菌检查
痰中可找出的常见真菌有新型隐球菌、白色念珠菌、球孢子菌、曲菌等。深部真菌病诊断在很大程度上依靠痰液直接检查、培养以及病理组织检查。后者对诊断念珠菌病、曲菌病、毛霉菌病等更具有决定性意义。在不能作病理组织检查的情况下，直接检查就更为重要：①直接检查所见与病理组织真菌形态基本相同，由于标本未经浓缩、染色等处理，故真菌在直接涂片上更为鲜明逼真；②直接检查能发现培养基上不易见到的真菌形态，如新型隐球菌的荚膜、着色真菌的棕色厚孢子、球孢子菌的“孢子囊”、放线菌的硫黄色颗粒等；③直接检查可明确某些菌种是否处于致病状态，如念珠菌和曲菌在致病状态下常呈菌丝型、病原性隐球菌具有特别厚的荚膜、放线菌颗粒外围的菌鞘代表致病性等。
真菌培养可补充直接检查的不足，确定菌种的性质，病原性真菌培养阳性，即使一次也有诊断意义，如新型隐球菌、孢子丝菌等；但对条件致病菌如念珠菌、曲菌等，必须反复培养阳性，且为同一菌种，同时结合临床除外其他可能性时方能确诊。
由于深部真菌病的临床表现与其他肺部疾病极易混淆，因此鉴别诊断时应考虑多种可能性。
（沈立松 刘宏景 陈 惠）