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第三章 结核病实验室诊断
第一节 结核病的细菌学诊断
结核分枝杆菌的感染是结核病的致病因子与确诊依据，在临床患者样本中寻找结核分枝杆菌是实验室检测的主要内容。理想的细菌学诊断技术应具有快速、特异、敏感、准确简便和价格低廉的特点，是近百年来技术研究的方向。
一、涂片染色镜检
（一）理论依据
结核分枝杆菌复合群（M. tuberculosis-complex，MTC）包括人结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis var hominis）、牛结核分枝杆菌（ Mycobacteriumtuberculosis var bovis，也称牛分枝杆菌 M.bovis）、非洲分枝杆菌（ Mycobacteriumafricanum）、田鼠分枝杆菌（ Mycobacterium microti）、卡介苗（ Mycobacteriumbovis BCG，减毒牛分枝杆菌）和最近才列入的1967年发现的肯尼迪分枝杆菌（ Mycobacterium canettii）。
Koch最初在1882年采用的是含亚甲蓝复合染液对结核分枝杆菌进行染色，显微镜下看到的是蓝色细菌，他指出染色不成功的原因是染色液需要空气氨碱化，而之后Ehrlich发现结核分枝杆菌着色的抗酸洗脱特性和经过Ziehl 和Neelsen对其加以修改促使了至今常用的抗酸染色法的诞生。抗酸染色特性是指细菌在被苯胺染料染色后，能够对酸、醇或含酸醇的脱色显示耐受，保持着色持久的特性。分枝杆菌一般用萋尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法，以5%苯酚复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用亚甲蓝复染，结核分枝杆菌能抵抗酸酒精脱色，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。
结核分枝杆菌细胞壁的分枝菌酸与胞壁含量较高的脂质是抗酸染色的基础。脂质约占干重的60%，有大量分枝菌酸（mycolic acid）包围在肽聚糖层的外面。抗酸性染色阳性是分枝杆菌属特有的，只是对染色结果的一种表述，而不是结核分枝杆菌鉴定的绝对指征，只能作为初步提示。棒菌属、诺卡菌属、玫瑰红球菌属和部分细菌孢子也有抗酸染色的特性，只是程度各异，其染色基础也有赖于各自的棒状杆菌分枝菌酸和诺卡分枝菌酸。
当分枝菌酸发生变化时，抗酸染色特性也随之发生变化，其并不是稳定不变的。如若胞壁损伤、人工培养物或陈旧培养物在缺乏甘油和某些糖苷成分的情况下，抗酸染色性会减弱甚至消失。体内外的青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响结核分枝杆菌细胞壁中肽聚糖的合成，而异烟肼可影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞在吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，这些因素都会导致结核分枝杆菌变为L型，导致抗酸染色呈现阴性。在干酪性病灶和冷脓肿中的样本菌体也呈现抗酸染色减弱或消失，这在肺内外结核感染标本中很常见。
认识结核分枝杆菌的多形态十分重要，其菌体直或略微弯曲，直径0.3～0.6μm，长1～4μm，单个排列，不同种可呈现丝状、球状、串珠状等多形性，似有分枝生长倾向，牛分枝杆菌则比较粗短。结核分枝杆菌聚集呈同轴向平行索状生长，有人将此特征作为快速鉴定的依据，但新的研究显示其他类型的分枝杆菌也存在索状生长形态。
微生物具有多样性特征，结核分枝杆菌形态通常被分为杆菌相、球菌相、颗粒相和滤过相等。杆菌相是常见而且典型的，伴随着长度、弯曲度和串球状的各异。病灶中的结核分枝杆菌如临床痰标本或患病淋巴结中常可观察到更为修长、弯曲和多种串珠样、颗粒样、球样形态，在巨噬细胞内也可观察到其呈明显索状生长。球菌相一般被视为细胞壁发育不全或缺陷球样，如诺卡菌样变异型和L-型细胞壁缺陷型，后者可在抗结核药物和血清诱导下产生。目前从临床样品中分离出L-型结核分枝杆菌的患者多有病程迁延。颗粒相又称为莫赫颗粒，是由Much于1907年在结核性冷脓肿、浆液性渗出液、淋巴结和痰标本中检出的Much-Weiss染色法阳性颗粒，一般认为其是结核分枝杆菌非抗酸性的“非细胞相”。滤过相是可以通过细菌滤膜的颗粒，Khoomenko于1991年证实其存在，这种超小型菌体体积约为正常菌体的1/20，外壳致密，蛋白含量低，能长期存在于宿主体内，有研究显示滤过相在患者体内的百分比可随着化疗的时间延长而升高，化疗可增加形态多样性出现的概率。
在临床标本中，一般以标准的杆菌相作为阳性诊断依据。不典型相则需要其他方法的辅助，对抗酸染色特性减弱或消失的标本需要慎重对待。
涂片染色镜检是诊断结核病的第一个步骤，对样本的浓度要求较高，通常要含菌量在5000～10 000/ml才可检出阳性，故灵敏度不高。如痰液的含菌量大于30 000/ml，用萋尼抗酸染色法检查300视野，阳性率可大于90%。
（二）痰样本采集与处理
临床收集的痰样本合格与否直接决定着痰菌检出率的阳性与否，取痰者需要意识到样本质量对诊断的重要性。
1. 采集对象 包括：一类是因出现临床症状来就诊、或因可疑肺结核而转诊的患者，均应作痰涂片镜检。二类是对已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间定期复查痰菌作疗效考核，包括：①疗程满2、5、6个月的初治涂阳患者，疗程满2、5、8个月的复治涂阳患者，各查痰一次；②疗程满2个月时的初、复治涂阳患者痰菌仍显示阳性者，应在治疗满3个月时增加1次查痰。复治涂阳患者若于治疗满5个月时仍痰菌阳性，则在满7个月时增加1次查痰；③确诊、登记的涂阴肺结核患者应在登记后满2和6个月时行痰菌复查。
2. 采集要求
（1）数量与时间：对初诊的患者最好应作3份痰标本：夜间痰、清晨痰和即时痰。无夜间痰时则在取清晨痰后2～3小时再采1份痰标本；或者采集2份即时痰。对于正在治疗中或复诊随访的患者按期每次送检2份痰样本（清晨痰和夜间痰）。行细胞学检验时以上午9～10时痰为佳。若作漂浮或浓缩集菌检查应采集12～24小时内的痰样本。
（2）痰标本采集：痰样本要求最好为深咳痰，不能为唾液。门诊患者可采集即时痰（即为患者就诊时咳出的痰液）。清晨痰是患者清晨深咳出的痰液。夜间痰是患者就诊前夜间咳出的痰液。合格痰标本应为脓样、干酪样或脓性黏液样，痰量3～5ml。痰标本应由检验人员或专人验收，对于不合格标本需嘱重新采集送检。若获得合格标本有难度，仍应对其进行细菌学检查，同时注明标本的性状，以便作分析结果的参考。研究显示高渗盐水雾化引痰可有助于获得满意标本。支气管灌洗和纤支镜检可以在临床需要确诊而多次涂片镜检为阴性时使用，但需注意的是支气管镜有可能因灭菌不彻底而导致假阳性和交叉感染的发生。痰标本最好采用国家结核病参比实验室推荐的国际通用痰瓶作为容器，也可使用4cm×4cm×2cm的塑料或涂蜡纸密封盒。应将患者姓名、编号（门诊序号，或患者登记号）及日期在留痰容器上注明。添加少量苯酚可有助于对测定24小时痰量或观察分层情况时容器内的防腐。若为做细菌培养的标本，需注意无菌采集，使用无菌水先行漱口，可减少口腔内正常菌的污染。将用过的标本进行灭菌以防止痰液污染。增加样本数量可提高阳性检出率，有报告指出多份样本阳性检出率可达60%～70%，而单份样本阳性率只有30%～40%。
采集痰样本的方法可以影响结核阳性反应，并因性别而有所差异。2007年 6月份第9期《柳叶刀》研究报道，在许多低收入国家，女性的结核阳性反应率低于男性可能与痰样本的采集方法有差别相关。作者以巴基斯坦拉瓦尔品第为研究中心，将1494名疑似结核的女性患者和1561名男性患者随机分成两组：指导组和未给予指导组。指导组在采集痰样本时接受适当的咳痰指导。与未指导组的女性相比，前者检出结核阳性的可能性增加63%。女性结核的阳性涂片率从8%上升至接受咳痰指导后的13%。相反，接受咳痰指导的男性患者的涂片阳性反应和样本质量则未受到显著影响。
3. 样本运送与保存 尽快送检所取样本是首要的，最好在4℃下送检实验室。送检时，县（市、区）结防所（科）医师应填写检验单。填写项目包括：①实验的序号：将初诊患者的3份样本和随后每次检查的痰样本采用同一实验序号进行编号；②痰标本的来源：初诊患者采用门诊序号，并以门诊登记本为依据；随访的患者登记号则以患者登记本为依据；③痰标本的性质，分类登记按脓样痰、干酪样痰、血性样痰、脓性黏液痰和水样痰进行。患者姓名、地址、登记号（或门诊序号）、送检日期（或初诊日期）、送检原因（初诊患者或随访患者）。对于无法马上行分离培养的标本置于4℃下存放，防止痰液干涸或污染。将检验单与痰标本分别置入不同容器中，外送上一级实验室的痰标本前应仔细核对痰标本容器上的标注并保证其与化验单一致。痰容器应使用专用结核分枝杆菌痰标本冰盒运送，或者用纸张和塑料袋封装扎牢，按顺序置入包装袋内。盒外注明勿倒置标记。当距离较远时，添加等体积十六烷吡啶 
氯化物有助于防腐，采用双套管包装，标记直立放置，痰标本容器注意密封，切勿倒置并防止痰液外溢。
氯化物有助于防腐，采用双套管包装，标记直立放置，痰标本容器注意密封，切勿倒置并防止痰液外溢。
4. 对于收到的痰标本，实验室检验人员应认真对其进行核对并检验单各项及确认痰标本合格。按顺序编号进行检查和登记，对不合格痰标本需要求重送。
5. 处理 处理废弃痰标本及污染物：①压力蒸汽灭菌痰盒和废弃标本等污染物后方可丢弃或清洗，严禁随意不经灭菌的处理；②把采用焚烧处理的痰盒等污染物于焚烧炉内进行彻底焚化。焚化得不彻底或者进行暴露焚烧都是有危害的；③痰检工作面消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，痰涂片操作在操作柜中进行。
（三）涂片、染色和镜检 1. 涂片 （1）直接涂片法：
直接挑取痰液，可用竹签或接种环等挑取脓性或呈干酪样部分痰液0.05～0.1ml，置于载玻片正面右侧2/3处，然后均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形膜状。标本实验编号书写于玻片背面左端1/3处。自然干燥，使用火焰固定两三次。
直接涂片出现的问题往往由于痰液的黏稠、抗酸杆菌分布不均，而制片一般不厚，限制了抗酸杆菌被涂到玻片上的机会和数量，另外难以避免与其共存的杂菌和细胞，导致背景杂乱，互相有可能遮掩，而造成漏检，致检出率不高。关键是在此之前进行充分地液化和稀释，浓缩涂片和培养，否则结果可由于沉渣和上清液中少菌或无菌误判。
有报道使用ASK痰前处理液有助于加快对痰液中的黏液、上皮细胞、白细胞及杂菌等成分进行溶解，使镜检的背景呈现清晰，视野洁净，抗酸杆菌更易发现。通过离心后，整份标本的所有抗酸杆菌均可以集于管底并浓缩在玻片上，均匀的分布性使阳性标本的发现率得到提高。
（2）离心浓缩法：
将液化后的痰液用灭菌蒸馏水或者磷酸盐缓冲液进行稀释，置于离心机内，以3000r/min离心15～30分钟。弃去上清液，余液混匀后涂片。自然干燥，使用火焰固定两三次。
（3）漂浮集菌法：
①普通处理的集菌法：取3～5ml的24小时痰标本，加入20ml的1g/L氢氧化钠溶液，置入压力蒸汽灭菌器，经103.43Pa高压灭菌20～25分钟（或煮30分钟），然后取出，冷却，随后加二甲苯（此后的步骤同以下甲醛次氯酸钠处理集菌法）；②甲醛次氯酸钠处理集菌法：取3～5ml的24小时痰标本入玻璃瓶中，添加等量的20g/L甲醛次氯酸钠溶液，瓶口加用玻璃纸加塞，振荡摇匀后静置10分钟，打开瓶塞和玻璃纸，加入1ml二甲苯加塞，使用振荡器或手摇振荡10分钟，加蒸馏水平满至瓶口而不外溢，静置10～15分钟，把已编好号的洁净载玻片盖于瓶口上，静置15～20分钟，则悬浮于瓶口平面上的含菌油膜全部被吸附于玻片上，而后取下载玻片并迅速将载玻片翻转，使浸膜向上，或使用接种环采集瓶口液面物涂抹于载玻片上，自然干燥，火焰烘干固定后进行抗酸染色镜检。研究显示普通处理集菌法在1.0×10 3/ml以上时才可见（+），而甲醛次氯酸钠处理集菌法在0.5×10 3/ml时即可见（+），其液化痰标本的效果较氢氧化钠和氨水更佳。
涂片操作完成后，采用压力蒸汽灭菌处理使用过的盘与废弃物等，也可用3%苯酚或0.5% （5000mg/L）过氧乙酸及1000mg/L二氧化氯消毒液擦拭操作台面，再用紫外线照射30分钟灭菌（距离1m）。
2. 染色 （1）传统萋尼抗酸染色法（Ziehl-Neelsen法）：
萋尼染色法使用0.5%或0.8%（厚涂片法）碱性苯酚复红染液。涂片行自然干燥，火焰固定2～3次。染色分冷染色法和热染色法，前法不加热玻片而需提高复红浓度和延长染色时间，后法制片加染色剂，覆盖痰膜，微火加热至出现蒸汽，离开火焰，保持染色时间5分钟（勿使玻片上染液干掉），或在痰膜上覆盖一滤纸片再加染色液进行热染色。脱色前去掉滤纸，水洗染色液。由痰膜边缘滴加5%盐酸乙醇覆盖痰膜，脱色3分钟至红色不可见。水洗去脱色液。滴加复染液，直接痰涂片复染30分钟，集菌痰涂片复染1～3分钟，水洗去复染液，自然干燥。
（2）改良萋尼抗酸染色法： 1）标本处理：
干酪样痰、血痰或脓痰直接进行涂片。若为黏液痰或稀水痰则加1～2倍1.8%碳酸钠水溶液，混匀后用121℃高压灭菌15分钟，冷却，再置入离心管内以3000转/分离心15分钟，倾去上清液留取沉淀。
2）涂片：
所取载玻片要求干燥、清洁、无油污、无划痕，使用95%乙醇擦拭进行脱脂，用酒精灯火焰于玻片正面右侧2/3处加热5秒，用接种棒挑取0.05～0.10ml痰液或沉渣，均匀涂抹于刚加热过的玻片上，形成大小为1cm×2cm。接种棒挑取弃去多余的痰液，涂片与干燥可同时进行，涂片厚薄程度以能透过涂片看清报纸上的字为最适宜，于酒精灯火焰上快速扫过3次，固定。
3）制片：
①初染：将一片小滤纸放在固定过的结核分枝杆菌痰标本涂片上，滴几滴苯酚复红液使其盖满整个痰膜，用酒精灯火焰外焰把标本片进行缓慢加热直液体出现蒸汽（不可煮沸），离开火焰，染色时间3分钟，稍冷却玻片，补充染液（防止干燥或玻片断裂），保持染色3～5分钟，冷却，取走滤纸片，用水洗净染色液，轻甩干；②脱色：从痰膜边缘加几滴5%盐酸乙醇液直到覆盖整个痰膜，第1次1分钟，轻晃玻片至无红色液体流下，经背面进行流水冲洗，第2次加脱色剂5分钟，经背面进行流水冲洗，甩干，脱色完全；③复染：于涂片上滴加几滴0.3%亚甲蓝液，复染1分钟，经背面进行流水冲洗，沥去水分，于37℃烤箱干燥3～5分钟，或用吸水纸印干，或进行自然干燥。
方法评价：①传统冷染色法在涂片前不对玻片进行加热，易导致痰液不易黏附于玻片上，很难涂抹均匀。改良法建议先加热玻片5秒，停留5秒，然后再涂片，先行加热干燥的玻片能使痰液易于附着且均匀涂抹开，涂片大小厚薄适宜，且缩短了制片完成的干燥时间；②传统法通常将标本涂好1份后再涂另1份，全部涂好后自然干燥30分钟，所需时间过长，例如将10份标本涂抹干燥完成至少需要1小时。改良法建议涂开1份标本后可暂时放一旁进行干燥，竹签放片子上，待涂毕最后1份再返回至第1份，依此类推，制10份标本边涂抹边干燥只需30分钟；③传统法染色通常需时5分钟，染色时间较长，着色较深，如果痰液中含有食物残渣，着色时间过长可导致脱色不够彻底，可能影响镜检。改良法建议染色为3分钟，染色后的抗酸杆菌着色良好，底色显示较清晰，减少了脱色次数，缩短了时间；④传统法加脱色剂后每次保持1分钟，反复至痰膜无可视红色，次数较多，试剂用量较大。改良法建议加脱色剂第1次1分钟，第2次5分钟，便完全脱色，脱色不仅有效且节省试剂用量，操作得到简化；⑤传统法复染时间30秒，时间短则着色浅，若片子稍薄则有可能无着色。改良法建议复染保持1分钟，可呈现蓝色或淡蓝色，背景更清晰，与抗酸杆菌的红色对比更明显，镜检效果良好；⑥传统法制片完成后自然干燥，夏季需时15分钟以上，冬季则可能需时1.5小时，达不到临床痰检报告及时快速的需求。改良法建议制片完成后以37℃烤箱行干燥，只需3～5分钟，干燥时间缩短了10倍。以上改良的操作能较大缩短整个检验完成时间，例如10份标本不做前处理可1小时内出报告，涂片、制片过程更易于控制，制成的玻片质量佳，镜检效果良好。对于除干酪样痰、血痰、脓痰和黏液痰合格样本外的“无痰”病例及有来自可能检出大菌量抗酸杆菌的水样痰样本的病例不应轻易放弃，应给予检测并要求其正确咳痰后重新送检，以减少漏检阳性病例。沉淀集菌法可浓缩痰液，痰液经由高温消毒后抗酸杆菌可完全释放集中在试管底部，将所含结核分枝杆菌的约5ml的痰液浓缩至0.1ml，提高了痰中抗酸杆菌检出的灵敏度，尤其是含菌量在1～8条/300视野到2+之间的阳性率可明显提高。
（3）荧光染色法 1）配制荧光染色液：金胺
“O”1g溶于100ml 95%乙醇，加900ml的5%苯酚液后混匀。脱色剂：3%盐酸酒精。复染剂：高锰酸钾0.5g溶于蒸馏水100ml制成。
2）将痰液涂片：
以荧光染色液行染色10分钟，水洗，以3% 盐酸酒精行脱色1～2分钟，直至无黄色可见，水洗，滴加复染剂1～2分钟，水洗，晾干待检。
萋尼抗酸染色法与荧光染色法比较：传统萋尼抗酸染色操作烦琐且染色加热过程可产生气溶胶，技术能力要求较高，100×油镜视野较小，镜检时间过长可使检验人员易感疲劳，对于涂片中细菌含量较少则不易发现。研究显示荧光染色和抗酸染色阳性率差异主要集中在1+样本 （含菌量较少的痰液），这对于病变轻且排菌量少的肺结核病例诊断有重要意义，荧光染色法可明显提高阳性检测率，有助临床上的诊断。荧光染色镜检在暗色背景下发出黄绿色荧光，醒目清晰，容易观察，使用的40×物镜视野大，加快了镜检速度，适用于大批量标本的检测。
3. 镜检与报告 （1）萋尼抗酸染色法镜检：
用双目光学显微镜（目镜10×，油镜100×）镜检，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。
按下列标准报告镜检结果：
抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌数：1～8条 / 300视野。
抗酸杆菌阳性（1+）：3～9条 / 100视野。
抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条 / 10视野。
抗酸杆菌阳性（3+）：1～9条 / 每视野。
抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条 / 每视野。
集菌涂片结果，按“发现抗酸染色阳性细菌”或“未发现抗酸染色阳性细菌”报告。
（2）荧光法：
在荧光显微镜下，暗色背景中的抗酸菌呈现黄绿色或橙色。40×物镜观察菌体形态，20×物镜下扫视全痰膜横向和纵向，计数。
镜检结果按下列标准报告：
荧光染色抗酸杆菌阴性（-）：镜检50个视野内未发现抗酸杆菌者。
荧光染色抗酸杆菌阳性（报告抗酸菌数）：1～9条/50视野。
荧光染色抗酸杆菌（1+）：10～99条/50视野。
荧光染色抗酸杆菌（2+）：1～9条/每视野。
荧光染色抗酸杆菌（3+）：10～99条/每视野。
荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：≥100条/每视野。
4. 注意事项与质控
抗酸染色法镜检注意事项：染色过程要单片进行以防止交叉污染。每张载玻片只许涂抹1份标本，禁止涂抹2份或以上的标本，防止染色过程菌体发生脱落而引起阴阳结果不准确。用过的玻片需彻底清洗干净方可再次使用，避免抗酸菌残留于玻片。切勿使用染色缸。吸水滤纸须1片1张，严禁反复使用。镜检每检查 1份样本完成均需擦拭油镜头。用于滴加香柏油的玻璃棒或竹签严禁触碰到玻片。结核分枝杆菌脱色时间长至10～20分钟不被脱色；而非抗酸菌则易脱色，延长脱色时间能对此进行鉴别，故抗酸染色的脱色时间宁长勿短。先将待检的结核分枝杆菌样本高压灭菌再行涂片染色可避免实验室感染，增加安全性且不影响实验结果（此法用于大规模实验）。
荧光染色镜检的注意事项：荧光染色后涂片镜检过程最好在24小时内完成，若需隔夜则应4℃下保存并次日完成镜检，否则荧光减退可能造成阳性结果缺失及漏检；荧光素染色液需于棕色瓶中置暗处存放，时间不超过2周；若遇到菌体在40×暗色背景下难以区别的抗酸杆菌，应转至100×油镜下确认。
（四）临床评价
涂片染色镜检是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，并被WHO推荐在发展中国家的结核病控制中使用。此法设备简便，对于经济不发达的地区易于检出作为主要传染源的涂阳病例。其局限性主要有：大量涂片阴性患者不易被发现，有可能发展成为涂阳患者；现代的分子指印技术证明涂阴患者由于密切接触和免疫抑制，其传染性不可忽视；此法无种特异性；灵敏度差，并受痰样本数和病情的影响。通常活动性肺结核涂片阳性的只有40%～50%。
抗酸性是分枝杆菌复合群或种的特异性性状，不是结核分枝杆菌的独有性状，临床将抗酸性等同于结核分枝杆菌的做法是凭经验产生的，是不全面的。除技术污染外，地区非结核分枝杆菌和HIV流行也对抗酸染色特异性产生制约。有不少报道指出曾在临床结核患者体内分离的野生株中发现4%左右的非结核分枝杆菌。因此，临床诊断时除了涂阳还应结合临床表现综合判断。HIV患者易感鸟分枝杆菌群等非结核分枝杆菌，因此痰涂片抗酸特异性、阳性和阴性预期值均明显降低，导致诊治延误。
另外，非杆菌态的异型结核分枝杆菌如L型、颗粒型等也不在常规涂片镜检阳性之列。
我国有关菌阴肺结核患者的诊断标准为：初诊患者直接涂片3次痰菌阴性为涂阴，2次培养阴性为培阴，1次涂片阴性和1次培养阴性为菌阴。PCR扩增检查结果可对涂阳标本复合群和种水平予以直接支持。
二、分枝杆菌分离培养
（一）理论依据
Robert Koch是病原学的奠基人和开拓者。他把研究传染病的重点放在纯菌培养上。几次细心观察使Koch获得了灵感，摒弃了原有方法，转向新的实验方向，从液体培养基和土豆纯菌培养改进为后来用肉汤和其他动物成分制成的凝固透明动物胶制成细菌培养的简单易行且可靠的固体培养基。现代细菌学由此取得一大进步。1881年他创立了固体培养基划线分离纯种法。1881年8月，他在伦敦展示了细菌的培养基。
培养法的检测灵敏度较涂片镜检法更高，阳性痰样本检测浓度为100菌/ ml。这是由结核分枝杆菌的生长特性决定的，即生长速度很缓慢的单细胞胞内兼性寄生菌，14～18小时才分裂1次；具有的疏水性外层使营养物质不易被吸收是生长缓慢的原因之一，其具有由简单无机物合成自身所需全部结构成分的酶系统，可在合成培养基中生长。临床分离培养物可进行结核分枝杆菌复合群和种的鉴定，并通过药物敏感性测定提供被检患者诊断的细菌学依据。
培养法在试管内培养学结核分枝杆菌，但是生长缓慢是结核分枝杆菌的特性，是由一系列遗传基因决定的。医学界致力于快速培养的努力研究，但只有部分大菌量样本能达到2周诊断的时间要求。在液体培养基中结核分枝杆菌的生长速度因株而异，倍增时间约为15～20小时。单菌在固体培养基中形成1mm菌落的时间约为4周。在化疗时代，临床分离株尤其是耐药株原代生长尤为缓慢。我国的规程已将临床原代培养结束观察报告最后阴性结果的时间制定为8周。此时间也受标本中菌含量多少、营养要求不同的影响。在临床中，由于临床样本含菌量不固定，通常测定多例样本，并以其在某段时间内的阳性率来做出判定。20世纪末期，人们采用微量检测如生长代谢中释放的二氧化碳或氧的消耗进行快速检测。
目前采用的临床分离培养基补充了多种有机物成分，以缩短调整期长度和提高增长速度和丰度。用于临床样本分离原代培养物的培养基有：以鸡卵为支持剂及补充营养物和无机盐基础液组成的罗氏培养基和小川培养基，以琼脂为支持剂的Middl brook 7H10琼脂培养基和7H9及7H12的合成液体培养基等。由于宿主体内的实际环境为缺氧性，使用5%～10%的二氧化碳大气可能刺激结核分枝杆菌原代培养物的初期生长。
涂阳而培阴的现象在临床细菌学上很突出，所报道的比例不一。对此的认识目前尚局限于正常抗酸染色和正常形态的菌体，而对于非杆菌形态了解甚少。持留菌可能是培阴的原因之一，其在试管中的生长需要唤醒机制。我国已制定结核分枝杆菌培养国家标准和生产了相应的标准化培养管、离心机、培养基蒸汽灭菌凝固箱等设备。
（二）痰样本前处理
由于临床痰样本痰液中含有坏死组织，内含各种糖蛋白等包裹着结核分枝杆菌，而且其他各种微生物与之共存，故对痰样本进行预处理以去取这些干扰物是非常必要的。分枝杆菌有较其他细菌强的抗弱酸弱碱和表面活性剂的能力，因此可使用一些稀无机酸、稀碱和某些脱污剂作为处理液，以此来杀灭杂菌和水解糖蛋白，如2%～4%的硫酸、2%～4%氢氧化钠溶液、N-乙酰半胱氨酸表面活性剂等。
按WS 288—2008《肺结核诊断标准》中规定的前处理方法，包括简单法和中和离心法：
（1）简单法（用于酸性罗氏培养基）
消化液4%氢氧化钠：取4g氢氧化钠。溶于80ml蒸馏水，待全部溶解后加蒸馏水至100ml。
处理方法：取痰标本，视标本性状加入1～2倍体积的4%氢氧化钠于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡1分钟，使痰液充分匀化，室温放置：自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15～20分钟。
（2）中和离心法（用于改良罗氏培养基）
消化液N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）-NaOH：50ml 8%NaOH与50ml 2.94%枸橼酸钠混合，临用前加入0.5g N-乙酰-L-半胱氨酸混匀。
处理方法：取痰标本置于50ml离心管中，加入等量的消化液，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡1分钟，使痰液充分匀化，室温放置20分钟后，加入磷酸盐缓冲液（pH6.8，0.067mol/L）至50ml，3000×g离心20分钟，弃上清，加入1～2ml磷酸盐缓冲液（pH6.8，0.067mol/L），混悬。
各实验室可以自行选择最适合的方法、作用浓度和反应时间等，通过预处理来减少样本内分枝杆菌的损失，提高培阳率。如处理不当，有可能导致50%～90%的死亡。掌握最佳的临界反应浓度和时间是重要的，处理完后立刻接种或中和处理。前处理残留的污染问题一般通过在罗氏培养基中添加孔雀绿，在7H12中添加一种或多种抗生素来解决，使分离培养能够成功。在这个过程中，消灭污染菌和损伤分枝杆菌是同时存在的。分离培养污染率高于5%，示前处理不足，若其低于2%，则示前处理过度。在前处理之后，对于缓冲性强的培养基如罗氏可直接进行接种，若缓冲能力弱的培养基如琼脂培养基和液体培养基，则应先施行酸碱中和或大量中性磷酸盐缓冲液中和，稀释后离心收集沉渣接种，以此提高培阳率。
（三）培养方法 1. 培养基种类 （1）按性状分类如下 1）固体培养基：罗氏（
Lownstein-Jenson，L-J）培养基最具代表性，其余有小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。固体培养基的优势在于可直接观察菌落的形态并做细菌鉴别，故而适用于临床标本的分离培养、鉴别、保存菌种及对抗结核药敏试验测定等方面，不足之处是结核分枝杆菌生长速度较缓慢。改良罗氏培养基（Lowestein-Jensen medium）现在临床实验室最多用，其优势有价廉、制作方法简便和易于观察菌落形态等。
2）液体培养基：以苏
通（Sauton）培养基、Middle brook7H9等液体培养基为多见。结核分枝杆菌在液体培养基中的优势为其接触营养成分的面积更为广泛，故而在液体中生长的速度相对固体培养基较快，菌体主要生长在液体表面，当搅动时可下沉至管底部，由此可获得大量结核分枝杆菌。不足之处在于临床标本的收集、采样、运输不够简便；菌落形态无法由肉眼观察出来；培养基受到污染的机会增多，结核分枝杆菌的生长易受影响，受到污染后与结核分枝杆菌鉴别困难，需要经涂片染色镜检来判断是否有结核分枝杆菌生长。改良的苏通半流体琼脂培养基为一种人工综合培养基，兼具了以上培养基的优点，具有透明的呈半流体状态的基质，生长的结核分枝杆菌能以白色颗粒状菌落悬浮于培养基中段，因此易于观察。
3）固液双向培养基：有国
外应用较早的Septi-Check AFB双相培养基，设计为BD专利式封闭式固液双相一体化。液相为Middle brook 7H9分枝杆菌专用增菌培养基，有利于分枝杆菌迅速繁殖，固相有3种固体平面：Middle brook 7H11和改良的L-J培养基可及时分离纯化增菌肉汤内的分枝杆菌，从而获得单个菌落，而巧克力琼脂有助于早期发现污染菌，减少耗费的时间。以液相培养基作基础可利于结核分枝杆菌较快生长，故效率较高。国内有利用平菇浸出液为基础的平菇双相培养基，其中添加了小牛血清、琼脂等成分配制而成，依据琼脂不同的量来制成液相、固相培养基，优势为成本低，制备简单，适合基层使用，具备一定研究价值。
（2）按成分分类如下：
主要有分别以鸡卵和琼脂为基础，加上血液、椰汁、平菇液等不同营养成分以促进结核分枝杆菌快速生长配制而成的各种培养基。
1）以鸡卵为基础的培养基：有
L-J培养基、Ogawa培养基、丙酮酸钠培养基和丙酮酸钠细胞色素C培养基等。这些培养基中关键成分是鸡卵液，在制备时需考查鸡卵液的新鲜程度及营养成分是否有损耗。
罗氏L-J培养基：为最经典培养基，其主要成分有天门冬素、KH 2PO 4、MgSO 4•7H 2O、枸橼酸镁、甘油、鸡卵液等，使用血清凝固器对其进行凝固，为满足长时间培养的需要，应保证培养基中存在一定的凝固水。依成分种类及剂量区别分为酸性和碱性L-J培养基。若把L-J培养基中KH 2PO 4的量从2.4g增至14g，即为酸性L-J培养基，若KH 2PO 4的量2.4g增加至K 2HPO 4 3.6g，即为碱性L-J培养基。L-J培养基制备简单，通常用于分枝杆菌的初次分离培养、传代培养、菌落观察、保存菌种、药物敏感性测定及菌种鉴定等。进行分枝杆菌分离培养时，酸性L-J培养基和碱性L-J培养基标本分别用碱和酸进行处理。改良罗氏培养基的成分则主要有基础液、谷氨酸钠、KH 2PO 4、硫酸镁、枸橼酸镁、甘油、蒸馏水、全卵液、2%孔雀绿水溶液。中性改良罗氏培养基基础物质有天门冬素、KH 2PO 4、硫酸镁、枸橼酸镁、丙三醇和水分，基础物质仍为鸡卵液，主要成分的作用是为细菌的生长繁殖提供无机盐、碳源、氮源和水分，而镁、钾元素能调节菌体渗透压，保持分枝杆菌细胞膜通透性良好。卵黄中的磷、磷脂和一些盐类是营养物质，卵白可以中和脂肪酸的毒性并起到缓冲作用。KH 2PO 4作为缓冲剂调节培养基的pH值。孔雀绿的作用是抑制标本中一部分杂菌的生长，但并不能完全抑制所有普通细菌的生长，对于结核分枝杆菌培养仍存在一定的干扰。改良罗氏培养基目前已经广泛应用，其缺点是培养时间过长，通常需4～6周才能作出报告，故常常不能满足临床快速诊断和治疗的需要，仅作为其他快速诊断的参照和结核分枝杆菌诊断的标准。
许多实验室依罗氏培养基自行改进配制，依据结核分枝杆菌特性加入促生长因子来缩短培养时间。如最优的促生长剂植物血凝素（PHA），能改变细胞膜通透性，促进RNA及蛋白质合成，促进RNA聚合酶加速合成，从而促进细菌生长。烟酸衍生物3-羧甲基吡啶或吡啶3-羧醛能被分枝杆菌转化成烟酸及其降解产物而促进结核分枝杆菌生长。吐温-80可使细菌呈现分散均匀地生长。某些无机盐类和微量元素、有机物、氨基酸等生长因子在基础成分中的添加也能满足结核分枝杆菌生长的需要。5.0%的CO 2环境有促进结核分枝杆菌增殖作用。研究发现结核分枝杆菌在新型改良罗氏快速培养基上比在改良罗氏培养基上生长所需时间明显缩短（ P=0.001），能缩短近1周以上。不同耐药型结核分枝杆菌的生长所需时间也不同，对抗结核药物全敏感的菌株生长所需时间相对更长，其在改良罗氏培养基上结核分枝杆菌生长不良或一般，而在新型改良罗氏快速培养基上生长快速且菌落茂盛，易于结核分枝杆菌生长的初级判别。
Ogawa培养基：成分少，没有天门冬素，因此成本比L-J培养基更低，主要成分含谷氨酸钠、KH 2PO 4、甘油、鸡卵液等，能通过调整KH 2PO 4及谷氨酸钠的量制备成改良培养基（Modified Ogawa），此培养基的用途与L-J培养基相同。由于其经济型的特别，非常适合发展中国家开展使用。
丙酮酸钠培养基：为L-J培养基中加入丙酮酸钠而减去甘油成分制备而成，主要应用于在标本中分离牛型分枝杆菌或作为本菌的传种及保存。丙酮酸钠细胞色素C培养基是在Ogawa培养基基础上杨乐荫等用0.1%丙酮酸钠代替甘油，并加入2.5%葡萄糖液及细胞色素C制成。丙酮酸钠培养基与Ogawa培养基进行临床标本比较，显示前者培养的培阳率更高，具有相当的优越性。
2）以琼脂为基础的培养基：主要有苏
通（Sauton）培养基Middle brook 7H9、7H10、7H11、7H12，匡氏培养基Proskauer培养基和Beck琼脂培养基等，其主要成分为无机盐类和一系列的有机化合物等成分。琼脂主要起到赋形剂的作用，根据调整琼脂不同的量，在能制备成不同性状的培养基的同时，少量存在于液体培养基中的琼脂更有利于结核分枝杆菌在中层形成菌落而易于观察。
Sauton培养基：以天门冬素、K 2HPO 4、MgSO 4•7H 2O、枸橼酸、枸橼酸铁铵、甘油等为主要成分，依据是否加入琼脂及加入琼脂不同的量，制备成液体培养基或半固体培养基（也称改良苏通半流体培养基）等。此培养基的制备不需特殊设备，经由高压灭菌法即可处理培养基，操作简单，主要应用于培养牛型分枝杆菌、生产卡介苗及研究中草药对结核分枝杆菌的作用等。
Middle brook系列培养基：国外最常用于结核分枝杆菌研究和诊断目的的培养基之一，其成分的最大特点为成分种类多、配制复杂，但培养所耗费时间短，故而越来越受到国内外学者的重视，其中7H9、7H12为液体培养基，7H10、7H11为固体培养基。在培养基中加入了标记 14C的棕榈酸，在分枝杆菌生长时利用培养基中的标记 14C来产生具放射性的 14CO 2，然后通过BACTEC TB 460监测系统检测 14CO 2的含量，敏感度很高。Middle brook系列培养基主要应用在分枝杆菌培养及药物敏感性的测定。
Proskauer培养基和Beck琼脂培养基：优势为使用简便，缺点为菌落形状不典型，呈现有扁平状或露滴状，一般表面光滑。
（3）按目的分类如下：
以上述培养基为基础，一些特定物质可依不同研究目的制备成分别用于快速培养、鉴别、药敏等各种用途的培养基，以此达到满足临床需要的要求。
1）用于快速培养：以B
ecton Diskinson（BD）公司研制的全自动培养系统系列与Organon Teknika公司研制的培养系统为代表。其余还有Difco公司的ESP系统、生物梅里埃公司的VITAL系统等。这些系统的优势在于和现代先进的仪器设备、技术相结合，具有高的检测灵敏度，耗时短，缺点为相应的价位明显偏高。19世纪70年代末，由BD公司研制的早期BACTEC 460 TM TB培养系统成为全球第一台专业的全自动分枝杆菌培养鉴定仪。此系统的培养基以Middle brook 7H12为基础，在其中特别添加含有标记 14C的棕榈酸，因此此法又名放射同位素液体培养法。但其具有突出的技术缺陷，即探针空刺开放性检测和存在的废弃物可能造成放射性环境污染等，随后公司推出的BACTEC 9000MB及BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统对此加以改善，无放射性污染，使分枝杆菌快速、安全、无放射性检测真正得到实现。BACTEC MGIT 960培养基以Middle brook 7H9为基础，含有配方良好的BBL PANTA TM抗菌剂和OADC营养剂，分枝杆菌生长指示剂使用了一种荧光物质，因此也称为分枝杆菌生长指示管法（mycobacteria growth indicator tube，MGIT），此为目前全球最快的分枝杆菌培养、鉴定、药敏系统。通过应用研究显示，其对结核分枝杆菌的阳性检出耗时平均为14.4天，最快的可达10天。对多种标本来源的各种分枝杆菌检测均适用。MB/BacT分枝杆菌培养系统由Organon Teknika公司开发，在结核分枝杆菌培养中应用了血液培养中判断细菌生长的pH指示剂。其原理为通过化学感受器监测结核分枝杆菌代谢中产生的CO 2浓度变化，从而引起酸碱度的变化致pH指示剂颜色产生改变，再通过发光光度计来检测其颜色变化程度。此法平均检测时间能比LJ培养基缩短2周。该系统采用的也是Middle brook 7H9液体培养基，当信号显示阳性时需进一步取培养液涂片和鉴定确认。Difco公司ESP系统则为能连续监测细菌生长的全自动血培养系统，其优势特点为无放射性，在检测时间上与BACTEC TB 460比较无显著性差异，可以互相替代。Williams-Bouyer N等将ESP与BACTEC MGIT 960进行了详细比较，报告前者的整体检测时间较后者稍长，对戈登分枝杆菌检测率高。其作为一种液体培养基，最好和固体培养基进行联合使用，不应作为单一的独立系统应用。我国许多学者结合国内具体情况，利用血液、椰汁、植物激素、平菇液、豆浸液等不同营养成分，自行配制了各种不同的快速培养基。有用平菇制备的平菇双相培养基、豆浸液培养基和植物激素培养基等。
2）用于选择：
相比于生长缓慢和营养要求高的结核分枝杆菌，其他的微生物显得更易于生长繁殖，因此在培养基中往往需添加抑菌成分。如罗氏培养基中含有的微量孔雀绿成分，其抑制杂菌生长的同时又促进了结核分枝杆菌的生长。Gynft把孔雀绿的浓度加以提高，并加入青霉素、萘啶酸制作成具有选择性的改良罗氏培养基。在Middle brook 7H10、Middle brook 7H11的基础上添加多黏菌素B、羧苄青霉素C、两性霉素B和三甲氧氨嘧啶则可制成结核分枝杆菌的选择培养基，此主要目的为减少污染率且提高阳性率。
3）用于鉴别：
以对硝基苯甲酸和TCH（噻吩-2-羧酸肼）鉴别培养基为代表。在制备L-J培养基的同时加入二甲基甲酰胺或丙二醇可制成PNB培养基，若加入噻吩-2-羧酸则制成TCH培养基。此种培养基应用在结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步鉴定。
4）用于药敏：
由我国自行研制的匡氏培养基在结核分枝杆菌快速药敏试验中具备优良的应用价值。虽然BD公司的产品具备快速检测结核分枝杆菌的特性及在药敏试验上的优势，但存在早期培养系统的放射性和新系统的高污染率问题，而传统的含药罗氏培养基则存在抗结核药物易受热失活和蛋白质吸附这两个主要问题尚未解决，相比之下，匡氏培养基的优点在于不存在高蛋白组分对药物的吸附反应，也无可能因加热后凝固面导致药物失活等问题，故而在药敏试验上优越性显著。其主要成分为无机盐、维生素、琼脂、甘油和小牛血清等。研究显示药敏试验出报告时间比罗氏培养基提早平均29天，大部分的药敏结果可在3周内报告，有利于结核病的临床治疗过程的指导。BACTEC系列培养系统、ESP系统等都可用于药敏试验，一些液体培养基（苏通培养基和胆固醇液体培养）可用于中草药对结核分枝杆菌抑菌试验。
5）用于L型细菌的培养：
L型结核分枝杆菌的营养需求与原菌基本相同，但通常需加入一定的渗透压稳定剂及血清。国外主要应用的L型结核分枝杆菌培养基有巯基醋酸盐培养基、PPLO琼脂、VSY肉汤和高桥的胰腺大豆蛋白陈琼脂培养基（TSA-I）等。国内庄玉辉等已成功应用改良TSA-L培养基进行L型菌培养。有报道安徽蚌埠医学院的L型液体培养基（代号92-3TBL）可于培养15天后取沉渣镜检。
在结核分枝杆菌的培养研究过程中出现过许多培养基，新研制的培养基固然缩短了培养时间，亦存在多种问题，选择应用时仍需仔细考虑。如仅想使用单一种培养基而达到多种目的非常困难，故许多实验室往往需同时使用几种培养基进行互补以适应临床或科研的需要。
2. 简单法（Petroff法）培养操作
此法在世界范围内广泛使用。在标本中加入等体积的4%的氢氧化钠，使其最终浓度为2%，震荡混匀，反应15分钟后直接接种在酸性罗氏培养基上。此方法简单、价廉、性能稳定。
（1）酸性罗氏培养基制备 1）成分：谷氨
酸钠（纯度95%以上）7.2g，KH2PO4 2.4g，MgSO4•7H2O 0.24g，枸橼酸镁0.6g，丙三醇12ml，蒸馏水600ml，马铃薯淀粉30g，2%孔雀绿水溶液20ml，新鲜鸡卵液1000ml。
2）制备方法：
消毒清洁桌面，量取600ml蒸馏水，添加无机盐、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加入马铃薯淀粉混匀，行沸水浴煮沸30～60分钟使其呈现糊状（防止凝块），冷却后制成基础液。用肥皂水洗净新鲜的鸡卵表面，将其浸入70%乙醇消毒液20～30分钟，取出擦干后开口，收取鸡卵液于灭菌容器内，控制新鲜度，搅匀，用无菌棉纱布过滤制成鸡卵液。混匀600ml基础液与1000ml鲜鸡卵液，加入20ml 2%孔雀绿水溶液，缓缓混匀以防止出现气泡，分装入容量为25ml的无菌塑料培养管，液量为每管6～8ml，搁置架上时维持一定倾斜度，专用的蒸汽凝固灭菌器或血清凝固器内放置1～2层为宜，斜面高度为试管2/3，85℃1小时；也可将培养基装入经121℃高压灭菌的中试管（18mm×150mm），每管液量约7ml，斜置于蒸汽凝固灭菌器或血清凝固器内加温消毒。新制成的培养基标准为色泽鲜艳，表面光滑无气泡，具备一定韧性及酸碱缓冲能力。此过程中的注意事项为： 各成分量取必须准确；制备过程的所有物品需经高压灭菌处理；分装应符合要求，若量多或量少都可能对结核分枝杆菌的生长造成影响，斜置摆放应控制好斜面高度；务必控制好凝固器的温度与时间，否则会对培养基的灭菌和培养基中营养成分的质量产生影响，当试管温度达室温时应旋紧螺旋盖，否则冷凝过程可产生过多的水。
3）保存：
37℃下的24小时无菌试验后，将培养基密封直立，最好置于塑料袋或容器内，标记接种效期，置于4℃冰箱避光保存，使用期限为2个月。
（2）标记培养基：
把酸性罗氏培养基从冷藏室取出后，放置至平衡室温，检查污染情况，如培养基已变成黄色或蓝色，与蓝绿色或黄绿色有明显区别时，应视为污染弃去。在斜面的背面标记患者姓名、实验序号、接种日期，每份痰标本接种2支培养基。
（3）前处理 1） 痰标本：
采用碱处理，于生物安全柜中把1～2ml痰标本放入前处理管中，视其黏稠度加入等体积4% NaOH或几倍的2% NaOH，旋紧螺旋盖，在涡旋振荡器上振荡30～60秒，使标本得到充分液化，置于生物安全柜内试管架上室温静置15分钟，整个处理过程一般不超过30分钟。
2）其他标本：
脑脊液、胸腹水、胃液、气管洗涤液类无杂菌的标本可直接进行3000r/min离心30分钟取0.1ml沉淀行接种。尿液、脓液、伤口分泌物等污染标本需同痰标本一样进行前处理。
（4）接种：
弃去培养管内过多冷凝水，用无菌吸管吸取痰标本，均匀接种到培养基斜面上，每支培养基接种2滴（约0.1～0.15ml）。将培养基放在斜面放置架上使培养基斜面水平朝上。
（5）孵育：
与放置架一起把培养基放入恒温培养箱内，36±1℃孵育24小时，拧紧螺旋盖或塞紧试管的胶塞，直立放置继续36±1℃孵育。
（6）登记与报告：
接种第3天和第7天观察培养情况，此后每周观察1次，直到第8周末。每次观察结果需要记录在培养结果记录本上，若出现培养阳性则随时进行结果报告。
（7）结果报告
无菌落生长：报告分枝杆菌培养阴性；
菌落生长不及斜面面积1/4：报告实际菌落数；
菌落占斜面面积1/4：报告（1+）；
菌落占斜面面积1/2：报告（2+）；
菌落占斜面面积3/4：报告（3+）
菌落布满培养基斜面：报告（4+）
3. 注意事项
培养过程中需要注意防止涂片标本交叉感染，注意以下事项：
（1）标本较多时，如果已知涂片结果，应将涂片阴性和阳性标本分开，避免交叉污染。
（2）将所使用的试剂进行分装，避免试剂污染导致假阳性。
（3）同一时间只打开一份标本或一支培养管。
（4）离心或振荡后，静置标本五分钟后再打开，防止产生气溶胶。
（5）培训操作人员的操作技能。
（6）有条件的地区应对可疑的分离菌株进行分型。
（四）质量控制
培养基制备质量控制内容包括颜色、质地、湿度、匀质性、无菌性和敏感性。同一批培养基颜色不同可能由于混匀不足或存在金属沉渣，颜色过深绿色为孔雀绿过量或pH值过低，黄色则示孔雀绿质量不好或pH值过高，温度过高会引起培养基颜色变浅。质地液化或易碎，可能由于凝固温度过低。底部留存过多冷凝水示螺旋盖拧紧过早或培养基成分不标准。培养基中出现小泡可能由于凝固温度过高，块状出现表明匀质性差。新制备的一批培养基需要进行无菌试验，36℃孵育2天应无细菌生长。
前处理操作可直接影响细菌培养的阳性率，如加入过量2% NaOH量，标本就被稀释；若太少则导致不完全消化而易发生污染，这两项误操作均有可能引起培养阳性率出现降低，故视痰标本的黏稠程度来适当增或减碱液的加入量非常重要。当遇标本数量较多时应采取分批处理。严格的无菌操作、接种量足量、恒定的培养温度是接种步骤的关键。对分枝杆菌生长情况进行观察时，若发现非分枝杆菌生长应报告培养污染，并重新送检。要提高培养的阳性率意味着要控制污染率，使其被控制在2%以下，若污染率高则可能原因为培养基灭菌不佳、存在污染或标本前处理操作不当等，对于不当无菌接种操作的出现应给予原因分析，采取措施以保证培养质量。每批培养应接种标准菌株（H 37Rv）10 -3mg/ml菌悬液，4周内出现菌落生长为合格。
（五）临床评价
结核病患者的诊断和治疗、结核分枝杆菌的耐药检测都离不开分枝杆菌培养检查，其较涂片镜检敏感性、高特异性强，对涂阴肺结核、结核病/艾滋病双重感染患者的诊断起着重要的作用，在基层实验室得到普遍推广和应用，并有可能在未来成为判断患者治疗效果的方法。通过分枝杆菌培养所获得的分离菌株可用于药物敏感性试验，对制定合理的化疗方案、提高患者治愈率及减少耐药结核病的发生和传播具有重要意义，值得推广。在基层实验室广泛使用的简单法分枝杆菌培养，是经国际防痨及肺部疾病联盟推荐的成熟检查方法，简单易行，严格按照标准化操作流程操作后，能使涂阳培阴率和污染率降低至规定要求。综上，分枝杆菌分离培养检查是一项实用的常规结核病临床诊断法。
三、分枝杆菌快速培养法
为了突破传统的改良罗氏培养基所需时间过长的这个局限，医学界一直不断努力于“快速培养”的研究，以期适应临床诊断的需要。有不少自制培养基通过添加各种营养成分在一定程度上缩短了调整期生长度，提高了生长丰度，但结核分枝杆菌生长缓慢的特性本质是由遗传属性即一系列遗传因子所决定的，故人们把研究方向由促进其快速生长转向快速检出，以观测到细菌的早期生长来帮助诊断。
（一）检测分枝杆菌的代谢 1. BACTEC 460 系统
1977年Middlebrook等介绍了使用具有放射性的 14C棕榈酸作底物的7H12培养基，专用于检测结核分枝杆菌及其他分枝杆菌（BACTEC法），JOHNSTON实验室公司（TOWSON，MD）随后推出了BACTEC 460 TB全自动分枝杆菌培养鉴定仪，实现了结核分枝杆菌快速分离。目前此仪器已在世界范围内广泛应用，进行血液、脑脊液、胸腔积液及其他无菌体液中细菌的专门快检。其主要原理为测定分枝杆菌的代谢产物，于7H12或12B培养瓶中加入放射性 14C棕榈酸产物后，将经过处理的检测标本接种于上，若有分枝杆菌存在，则分枝杆菌代谢利用 14C标记底物产生的 14CO 2能被检测到，测定其气体量进行换算。操作方法：经由自动传送系统把待测培养瓶移至检测位置，一支针头将气体抽送至电离室进行放射活性检测，以生长指数GI表示。BACTEC 460 TB初代分离标本阳性报告所需时间平均为9.7天，快速生长菌（在7天以内生长出来的非结核分枝杆菌）需要3天，阳性报告快速灵敏，不足是对于有放射性的废弃物处理起来有困难。目前，部分发达国家和我国的部分城市对其禁止使用，而该系统配套试剂供应的紧缺也对其继续使用产生制约。
2. BACTEC MGIT960系统
BD公司在快速分枝杆菌培养、鉴定、药敏系统国际金标准BACTEC460之后推出BACTEC MGIT960系统，国际市场上应用较多。BACTEC MGIT960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪运用荧光增强原理，其荧光指示剂对培养管内氧气浓度高度敏感，被包埋于MGIT培养管底部，从而培养管内的氧气浓度能直接被感应。当分枝杆菌在培养管内生长时，氧气出现消耗，则二极管激发荧光显示剂发出荧光，每隔60分钟，内荧光强度记忆探测器会对培养管内荧光的强度变化进行测定，若荧光强度出现加速度变化，系统将以生长单位GU（Growth Unit）形式报告该标本阳性，且直接打印出结果。对于阳性的培养管可以即刻取出，行涂片和抗酸染色，判断是否为分枝杆菌，并可分离菌种，制备菌悬液，第二次接种于预先配制好的含药物敏感试验所需的标准浓度药物之MGIT培养管（含OADC）和空白对照MGIT（含OADC）培养管，再置入仪器内培养，以分枝杆菌的生长对比情况来判断药物的敏感性如何。由NAP、PNB及TCH的药敏实验结果可作出分枝杆菌菌种的初步鉴定。对阳性标本进行涂片后如确认为分枝杆菌则发出报告。
BACTEC MG IT960快速培养操作： 根据痰标本的性状加入相当于其体积1～2倍的4% NaOH，在涡旋振荡器上混匀2～3分钟，以加入4% NaOH 溶液为始于室温下静置15～20分钟待标本消化处理。随后移入50ml离心管，加入0.1mol/L无菌的 PBS（pH6.8）缓冲液直至50ml后旋紧封盖。在3000r/min下以低温进行离心15分钟。缓慢倾去上清液，加入0.1mol/L无菌pH6.8磷酸盐缓冲液1～2ml进行混匀。在杂菌抑制剂PANTA试剂瓶中倒入营养添加剂Growth Supplement，使其充分溶解并混匀后加至MGIT 7ml液体培养管，每管液量为0.8ml，从中吸取0.5ml的样本加入至MG IT 7ml液体培养管里开始培养。培养管内荧光强度由荧光强度记忆探测器每隔60分钟进行测定并以生长指数GI值来报告结果。
BACTEC MGIT960系统的优势：①设计先进：其采用BACTEC TM系列的连续荧光探测技术十分灵敏，能直接测定由于分枝杆菌生长而消耗的O 2浓度的变化，进而监测到培养管内分枝杆菌的生长情况；②阳性检出耗时短：被认为目前最快的分枝杆菌培养、鉴定、药敏系统，原因之一可能由于MGIT960培养基中所含的营养成分较全面及配制较合理。与改良L-J培养基比较，分别观察比较接种后的第3天与第7天的结果和随后每周1次的情况，由于BACTEC MGIT960能每隔60分钟自动测定培养管内荧光强度，仪器会自动发出报警提示有阳性菌株的出现，故菌落的生长情况就无需人工来定时观察，尽早发现阳性菌株就更为简便快捷。阴性报告时间与传统L-J罗氏培养法规定的56天相比，减少为42天，因此使诊断与治疗时间大为缩短，其对分枝杆菌的快速培养阳性检出耗时平均为9天，而对鉴定、药敏试验时间平均为4天。对链霉素（STR）、异烟肼（INH）、利福平（RIF）和乙胺丁醇（EMB）全耐药菌株的阳性报告时间较其他耐药菌株更早；③阳性检出率高：与传统培养方法相比，提高了10%，与BACTEC 460相比则提高了4.97%；④适用标本广：适用于来自痰、胸腹水、脑积水、体液、脑脊液、组织块状标本和其他非血液标本；⑤内置质控系统全自动：系统具有内置的每小时自动校正的定标管。BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪还可用于药效学的动态基础研究，从而大大减轻了工作人员的工作负担，并有助于操作安全性的提高。
BACTEC 960的不足：其配备的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂均为国外进口，故价格高昂。关于系统的污染率，则说法各异，有报道称污染率与传统改良L-J培养或无显著性差异，另一方面也有资料称BACTEC 960的污染率为2.3%，相比L-J法6.5%的污染率有显著差异。如能对此系统进行更规范的操作，降低其污染率，进口耗材转为国内自行研制开发和改进培养基，则能更好地降低实验成本，使BACTEC 960 培养法能在基层结控机构也有良好的应用前景。
3. Bact/ALERT 3D
Bact/ALERT 3D是法国生物梅里埃公司研发的血液及无菌体液检测系统，自1990年进入市场，已超过10 000台以上在全球各地担负起血液、体液培养和（或）分枝杆菌检测任务。其应用原理为培养全封闭式的比色法，此举解决了放射性的污染问题。
（1）原理：
假定测试样品中存在微生物，当其在培养基中代谢消耗基质时，会产生CO 2。置于每个标本瓶底部的传感器随之发生变色，由蓝绿色变浅。发光二极管（LED）将光线投射到传感器上，使用一个光电探测器来测量反射光。产生的CO 2量与被反射的光成比例增长。故通过比较产生CO 2的量值与标本瓶中初始的CO 2水平能判断出结果。如下情况可确定样品为阳性：CO2产生的速率持续增加，初始CO2含量高，和（或）CO2生成速率异常高。对BacT/ALERT MP标本瓶中的生长，亦能视所产生的微量CO 2或CO 2缓慢持续的变化状态，对样本报告为阳性。若处于理想条件下，超过规定的时间后CO 2水平仍无明显变化则系统会自动报告样本为阴性。
（2）操作 1）前处理：采
用N-乙酰-L半胱氨酸-氢氧化钠法（NALC-NaOH），临用前新鲜配制的消化液所需成分为50ml的4%氢氧化钠、50ml的2.94%枸橼酸钠、0.5g的N-乙酰-L半胱氨酸。用吸管从痰液干酪样部分（或胸腔积液、肺泡灌洗液、混浊的脑脊液离心后取沉淀物）吸取2ml加于50ml容量的无菌尖底离心管内，再注入等量的消化液，置入旋涡混匀器上15～20秒，使样本混匀至液化，在室温下静置15分钟，随后加入50ml无菌的pH6.8 PBS缓冲液至刻度，平衡、封盖，颠倒混匀，在离心机3000×g下进行15分钟离心。弃去上清液，将1.5ml的pH6.8 PBS加入沉淀中，充分混匀使其成为悬浮液。
2）上机方法：按B
acT/ALERT 3D的主菜单（Main Screen）上的加瓶键进入加瓶屏幕（Load Bottles Screen）。手持培养瓶将其放在条码扫描区扫描。读取条码后，加瓶屏幕显示培养瓶条码区，其余信息可不必录入。空余瓶位的箱体绿色的指示灯随之闪亮，打开箱体，可见空余瓶位指示灯闪亮，此时遂把培养瓶放入任意的有亮灯的瓶位，此信息可被系统自动记忆。培养瓶条码区空白时，则继续加入其余培养瓶。箱体的配置为：用于MP瓶培养检测的A箱和B箱，用于放置药敏试验需使用的MP瓶的C箱，用于放置接种血液样本的MB 和SA培养瓶的D箱。
3）阳性报告：
仪器通过屏幕显示黄色对阳性培养瓶进行自动报警，阳性瓶的数量显示在培养瓶的计数框内。按阳性瓶的取出键，在主菜单（Main Screen）上进入取瓶屏幕（Unload Bottles Screen）。绿色指示灯闪亮示箱体内有阳性瓶，打开箱体，即可发现阳性瓶指示灯闪亮。取出阳性瓶，稍稍晃动，于光亮处对培养液进行观察。若培养液的性状表现为澄清而透明，则需放回原位，继续进行培养。若培养液性状表现为浑浊，一般考虑为被污染；若发现内有明显的颗粒悬浮，则视为分枝杆菌生长。以上两种情况均需取出培养瓶，混匀，抽取培养液进行涂片，抗酸染色法确认。取出阳性瓶后，则培养瓶计数框内的阳性瓶数量相应减少，阳性瓶取完后计数为零。对培养阳性出现的日期在登记本上进行登记。
（3）评价：
BacT/ALERT 3D的特点有：新培养瓶可随机放置，对培养瓶的种类能即时进行分辨；具备临界值判断功能，对阳性标本能即时检测；当操作者有不规范操作时，系统可对其发出提示；对阴性瓶能批量进行移除，无单个扫描的步骤，全程行未知瓶的侦测，节省了处理错误和未知瓶上消耗的时间，加快了工作进度；操作无侵入性，监测连续；灵敏度较高，广泛适用于多种细菌检测，检测时间缩短。图文指令简便，只需简单操作即可完成全部数据管理，对所有检测位连续检测的功能可确保实验结果能被及时报告，48小时内可报告90%的阳性结果，与传统的L-J法比较，最短培养时间达6天，最长为22天，低假阳性率，阳性分离率较高，污染小，更安全，自动化程度较高，能达到现代化检验医学的要求，不失为较理想的分枝杆菌快速培养法。值得在有条件的实验室进行推广应用。
4. ESP培养系统Ⅱ
美国Difco公司研制的最新ESP系统也是如今在中国推广使用的自动化非介入性连续瓶外检测的血培养仪代表之一。
（1）原理：
系统对需氧菌12分钟、厌氧菌24分钟行持续监测，由于细菌在生长代谢过程中消耗氧气，产生二氧化碳、氢气和氮气，培养瓶内的压力就随之发生改变，系统采用的为气压传感技术，经由压力传感器，随时检测到瓶内新变化，如细菌生长就会发出报警提示。系统使用的培养基为改良Middle brook 7H9液体培养基。
（2）操作 1）临床血标本采集和处理：无
菌法采集血标本（成人5～10ml/瓶，儿童1～3ml/瓶），加入ESP需氧菌的专用瓶。
2）痰标本采集和处理：痰液
标本各1ml，分别加入2～3ml的2%～4% NaOH液，充分振荡，放置10～20分钟离心、弃去上清液，加入PBS缓冲液进行中和，离心、弃去上清液，再加入1ml缓冲液混匀，加入Myco培养瓶，并添加1ml Myco GS助长剂与0.5ml Myco AS抗生素。痰标本同时作结核分枝杆菌常规培养。
3）处理阳性培养瓶：
仪器提示阳性时及时将标本转种血琼脂、巧克力（CO 2环境）和麦康凯平皿，35℃条件下培养18～24小时。对每一阳性培养瓶行涂片、革兰染色与直接药敏试验，将涂片结果通知临床以作为血培养一级报告；培养次日将直接药敏结果通知临床医生以作为二级报告；对分离出的菌落进行生化鉴定和药敏试验，经18～24小时培养后，作出最终报告（即三级报告）。Myco报警提示阳性时，取培养液涂片、抗酸染色、镜检。
4）处理阴性培养瓶：
若培养监测5天仍未显示阳性者，对其作无菌生长报告。用无菌注射器抽取血瓶中的肉汤转种血琼脂和巧克力平皿，培养18～24小时，如出现细菌生长，进行鉴定并补发报告。
5）判断假阳性与假阴性：
当报警提示有菌生长却分离不到细菌时即为假阳性；5天未显示报警但转种后能分离出细菌的即为假阴性。
（3）临床评价 1）阳性检出率和检出时间：分枝
杆菌初代分离率为63.9%，与BACTEC MGIT960系统报道的71.2%无显著差异。阳性检出时间最短为4.74天，最长为30.93天，平均15.9天，比常规LJ培养法快2～3倍，较BACTEC MGIT960系统的13.1天稍慢。
2）假阳性：报
道提示为2.7%，比BACTEC MGIT960系统的0.7%高。假阳性的出现可能受痰标本处理操作中杂菌杀灭不完全的影响。对痰结核标本的消化处理并同时行普通细菌培养 可排除假阳性。停电也可成为假阳性的原因之一，有条件者应使用不间断电源降低假阳性发生率。
（二）显微镜观察 1. 显微镜观察药敏性检测技术 （1）原理：
显微镜观察药物敏感性检测技术（microscopic observation drug susceptibility assay，MODS）为近年建立的新技术。Caviedes于2000年发现结核分枝杆菌在液体培养基中生长速度较固体培养基快，且会有特征性索状结构形成，而该特征结构能通过显微镜直接观察，以此确认结核分枝杆菌的生长及对药物的敏感性。
（2）操作：
将2ml痰标本加入15ml离心管，添加等体积NaOH-NALC溶液，盖紧后涡旋振荡20秒，混匀使溶液附着整个管壁与盖，静置消化15～20分钟使其得到充分液化。添加磷酸盐缓冲液（pH6.8）进行中和，3000×g离心15分钟，弃上清液。用2ml 7H9-OADC-PANTA重悬离心沉淀，加入1ml重悬液，混匀。将重悬标本接种至无菌24孔细胞培养板，密封入塑料袋，置37℃温箱内培养。从孵育后第3 天行倒置显微镜观察（10倍目镜×40倍物镜），每天观察1次；如可观察到特征性索状结构，提示有MTB生长。观察到的早期结核分枝杆菌生长类似弯曲的绳索。若21天仍未见结核分枝杆菌生长则视为阴性。如孔内混浊，提示污染菌过度生长。
（3）评价：
此法直接用显微镜观察培养物中的分枝杆菌，条件简单，仅需离心机、孵育箱和显微镜就能进行，相对其他如MGIT 960系统需昂贵仪器的方法，更为适用于经济不发达且医疗资源有限的地区。研究发现在菌液浓度为3×10 3CFU/ml 时，运用MODS技术检测判读结果的时间为7天；另有4种NTM的标准株（草分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌）也可能在液体培养基中被观察到索状结构的生长性状，则在镜下要与之区分MTB形成的特征索状结构就较困难；以对硝基苯甲酸800μg/ml、噻吩-2-羧酸肼2.5μg/ml为检测条件，有助于提高检测的正确率；临床分离株检测结果表明，该法与传统罗氏培养和鉴定法结果符合率为97.0%，美国伯明翰阿拉巴马大学Arias报告MODS 检测MTB的敏感性、特异性分别为97.5%、94.40%。出现阳性结果的中位时间为5～10天，平均7天，较L-J法的平均21天短了许多，而与MGIT 960系统的平均8天相似。综上，MODS技术检测MTB与传统罗氏培养和鉴定法结果符合率较高，且具有快速、操作简便、价廉等优点，适合MTB快速检测。
2. 薄层琼脂法 （1）原理：
薄层琼脂法是一种新型的低成本结核病诊断方法（Thin-layer agar，TLA），其使用的是固体培养基，也用显微镜来观察早期生长的结核分枝杆菌菌落。阳性检测出的时间为9～10天，并可依据镜下能观察到的结核分枝杆菌特征杆状表型进行初步鉴定。使用的培养基为Middle brook 7H11培养基和含有PNB的Middle brook 7H11培养基平板。鉴别时要观察这两种培养基上的菌落生长情况：结核分枝杆菌在前者上生长而在后者上受抑制。此法也应用于快速药敏试验。
（2）操作：
1）临床标本前处理使用氢氧化钠和N-乙酰-L-半胱氨酸处理，标准方法离心。
2）将0.1ml沉淀涂抹接种在60mm×15mm米氏Middle brook 7H11薄层琼脂培养板上，培养板含50mg/L哌拉西林、20mg/L两性霉素B和甲氧苄啶、100mg/L油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢（OADC）。
3）接种完成后TLA板用封口膜封闭，并置于CO2孵育箱内36℃培养。
4）在接种后48小时后用普通显微镜100倍视野观察培养板一次，检查是否存在污染，之后观察2次/周，持续6周。依据菌落出现和特征形态行初步鉴定。
5）如出现阳性，比较观察7H11培养基上生长的菌落是否在7H11+PNB培养基上也有生长。
6）对生长出的菌落进行萋尼染色确认。
（3）药敏试验：
用四象限培养皿，在每个象限配制5ml 7H11琼脂培养基。将其中一象限作为对照（growth control，GC），其余三象限分别含1μg/ml RMP、2.0μg/ml Ofx、6μg/ml Km。首先用不同浓度的已知耐药谱的菌株对TLA法进行标化，然后从新鲜标本培养基刮取菌落并经过悬于灭菌去离子水中后调至与麦氏1号管（McFarland No.1）相同浊度，进行1∶100或1∶50稀释（菌液浓度高有利于避免假敏感结果）。每象限接种10μl菌液。用封口膜封闭培养皿，置于5% CO 2孵育箱内37℃培养。每周使用常规10×显微镜物镜观察，持续21天。若生长对照象限出现阳性，而含药象限出现菌落生长，则定义耐药；反之与对照象限相比，含药象限没有菌落生长则定义敏感。
（4）评价：
TLA是实现早期诊断的快捷技术，其优势在于对实验室要求不高，仅需要一般的标准设备、标准显微镜和简单的培训。有Schaberg研究报告使用昂贵的CO 2孵育箱与否仅使检测结果时间相差一天。TLA与其他液体培养基相比，潜在气溶胶危险减小，且不像MGIT一样费用昂贵且无法观察到菌落形态。用四象限培养皿能节省成本且缩短MTB耐药的检测时间，直接使用痰标本进行TLA可以避免药敏前培养需要2周时间的分离步骤，从而节约了时间提高效率。L-J或7H11培养基的传统方法，常需要1～2个月才能获得结果。TLA的平均生长时间涂阴和涂阳标本分别为7天和11.5天，与其他快速培养系统相比结果类似或更好。有研究评价TLA方法直接应用于痰标本检测对RFP和INH的药物敏感性和特异性均为100%。对于涂阳标本的耐药检出时间为11天。
（三）变色液体培养基 1. 原理
德国最早研发的为MB-Redox系统。分枝杆菌变色液体培养基为营养丰富的选择培养基，内含抑制杂菌生长的多种抗生素。改良米氏7H9培养基、促生长添加剂（加速结核分枝杆菌生长的血清、复合维生素）、抗生素混合物PANT（多黏菌素B、两性霉素B、萘啶酸、甲氧苄啶）和氧化还原显示器（与显色有关），在国外已广泛应用。近几年国产的变色液体培养基已投入应用，其主要成分有磷酸盐缓冲液、谷氨酸钠、多种维生素、多种微量元素、甘油、马血清、变色剂以及甲氧卡氨嘧啶、氨苄西林、多粘菌素B、两性霉素B和萘啶酸等多种抗生素。显色原理为：当分枝杆菌在液体培养基中生长时，通过氧化还原系统，培养基中含有的氧化还原指示剂四唑 
盐就被还原，显示粉红色、红色或紫色的不溶于水的甲臜，在细胞表面呈现出来，能用肉眼直接观察菌落的变色。取培养液涂片、染色镜检。阳性结果报告时间与阳性检出率和BACTEC TB 460相当。
盐就被还原，显示粉红色、红色或紫色的不溶于水的甲臜，在细胞表面呈现出来，能用肉眼直接观察菌落的变色。取培养液涂片、染色镜检。阳性结果报告时间与阳性检出率和BACTEC TB 460相当。
2. 操作
培养：采用2～4倍体积4% NaOH消化痰标本20分钟，以5000～10 000r/min离心10分钟，用pH6.8磷酸盐缓冲液对沉淀进行洗涤2 次，加入上述缓冲液1ml混悬沉淀，各取0.5ml，分别接种于变色液体培养基，37℃下培养。每天观察1次，2周后隔天观察1次，若培养基变紫红色或有紫红颗粒沉淀则作涂片抗酸染色，证实有分枝杆菌时发出培养阳性报告。
3. 评价
变色液体培养基总阳性率与L-J培养基总阳性率相比无显著性差异。变色液体培养基细菌生长周期平均为13天，较L-J培养基的26天缩短了一半。比较两种培养基接种 15天时的培养阳性率，变色液体培养基的83.6%比L-J培养基的21.5%明显提高，提示变色液体培养基上的分枝杆菌生长速度更快，检出耗时明显较L-J培养基短，操作简便，经济实用，不需特殊仪器，但有报告污染率略高于L-J培养基，可能与痰标本前处理及洗涤沉淀中尚未严格掌握无菌操作程序有关。此外，变色液体培养基的结果判断具有主观性，变色时间亦持续较短，仅2～3天，随后紫红色即有可能消失，提示及时地观察结果很重要，在选择稳定性强的指示剂上或有待进一步探索与改进。变色培养基还可进行耐药性的检测，具有基层临床推广的价值。
（四）其他新快速检测法 1. 新鲜椰汁与马血清为基础成为液体培养基
Vasanthor等1998年曾采用新鲜椰子汁混合马血浆为基础成分制成培养基，培养出结核分枝杆菌仅需6天。国内有医院报告对其加以改进后的类似培养基，使用新鲜椰子汁、马血清和甘油来制备新型液体培养基来培养结核分枝杆菌，比较其所需培养时间，新型液体培养基培养耗时平均为（9.66±3.14）天，而L J培养基培养耗时平均为27.56±7.74天，前者平均提前了17.9天，明显缩短了培养时间，可及时为临床提供细菌学依据，这可能与培养基中的椰子汁含较丰富的氨基酸、矿物质及维生素等促细菌生长因素有关。检测操作需注意加强空气消毒及无菌操作，避免污染影响检测结果。另外，国内金法祥、孙小军等也仿效以上方法采用新鲜人血浆代替马血浆研制成的液体培养基，报告最快达5天培养出结核分枝杆菌。
2. 固液双相培养基
结核分枝杆菌通常在鸡蛋或血清琼脂等固体培养基上的生长表现缓慢，原因之一可能为标本经酸或碱进行前处理，直接接种在培养基后，至少需2～3天方可缓冲达到pH7.2左右。另外，结核分枝杆菌的细胞无法高效率地吸收营养成分也导致细菌对数生长期的延滞。而细菌细胞在液相培养基内时，完全浸泡在营养成分中，有利于新陈代谢的对数生长期提前。但液体培养基培养出的阳性菌落表现为白色颗粒状，使鉴别菌落特性产生困难，相反，固相培养基上生长的菌落则更典型而容易判断，有利于进行药敏试验菌落的挑选。相比之下，分枝杆菌的固液双向培养基则具前二者优点互补之势，其以改良L J培养基为基础，加入4ml的7H9液相培养基（约至斜面一半处），pH为6.5～6.7接种氢氧化钠与痰的混合液，使pH升高至7.0～7.2。双相培养基中的液相部分能实现快速培养，而固相部分则可使分枝杆菌菌落典型化，这就是双相培养基的特点。
有关结核分枝杆菌于固液双相培养基上生长情况的实验显示，H37Rv 10 -1mg/ml菌液在液相培养基接种后的第3天，培养基中段出现略微混浊，出现5～8个白色颗粒状菌落。第5天菌落则达到15～20个，8天时培养基中段表现为乳白状混浊，转动试管进行观察，可看到无数菌落。与之相对比的固相培养基则为第6天始有明显小菌落产生，于第9天可布满整个斜面。菌落稍显粗糙，此点与改良罗氏培养基上的菌落表现相同。在固液双相培养基上的结核分枝杆菌平均生长耗时14.4天，较改良罗氏培养的23.5天平均生长快了9.1天。固液双相培养基生长的结束时间为30天，与传统罗氏培养基规定的8周相比，结核分枝杆菌的培养时间缩短了1个月。
固液双相培养基使用磷酸盐溶液调节pH为6.5～6.7，痰标本经由2%氢氧化钠液处理后不必中和、不需离心，可直接接种，操作更为简便，并能使固相培养基上生长的菌落表现典型，挑取容易，对于药敏实验菌悬液的定量制作有利。传统的含药罗氏培养基存在两个尚未解决的主要问题：抗结核药物受热失活、蛋白质可发生吸附，与之相比，固液双相培养基不存在高蛋白组分对药物的吸附，也没有因加热凝固会导致药物失活的问题，故在药敏试验上显现较大优越性。固液双相培养基的污染率与改良罗氏培养基相比并无显著差异。改良罗氏培养基内的微量孔雀绿对杂菌的生长有抑制作用，同时可促进结核分枝杆菌的生长。固液双相培养基的固相培养基中的结核分枝杆菌生长较液相稍慢，但优于罗氏培养基。使用固液双相培养基进行的药敏实验，使报告的平均天数（11.7天）比改良罗氏培养基的药敏实验平均报告天数（20.5天）提前了8.8天。2周内即可报告多数药敏结果，对结核病的临床治疗具重要指导作用。应用固液双相培养基培养结核分枝杆菌及进行药敏实验的成本和改良罗氏培养基差不多，价格却远低于液体培养基。其菌型鉴定应用PNB固液双相培养基，利用 10天即可达到结核分枝杆菌初筛的目的。
总的评价为，固液双相培养基能刺激结核分枝杆菌的生长，尤其因为价格低廉，制备方便，操作简单，对我国广大基层医院和结核病院来说具有较高应用价值。
3. 硝酸盐还原实验（NRA）
硝酸盐还原酶试验（nitrate reductase assay，NRA）技术原来为：结核分枝杆菌代谢过程中会将硝酸盐分解为亚硝酸盐及氮氧化物，而亚硝酸盐能与显色剂反应呈现浅红色、紫红色、深紫红色。加入的锌粉能防止氮氧化物所导致的假阴性，从显色与否即可判断有无结核分枝杆菌的生长。Affolabi等利用 NRA 技术直接检测痰涂片中的结核分枝杆菌取得了比较满意的结果。
Gupta M等对药敏实验进行报道称NRA法于第7天时能观察到结果的达84.78%，第10天能达98.91%，至14天即可全部观察出结果。试验操作为：将临床新分离分枝杆菌及标准菌株经与标准麦氏比浊管比浊后配成1mg/ml的菌悬液，取部分1mg/ml的菌悬液用盐水稀释至10～2mg/ml，在1支含硝酸钾的改良罗氏培养基加入0.1ml盐水作为空白对照管，在3支含硝酸钾的改良罗氏培养基中（不含药）分别加入10～2mg/ml的菌悬液0.1ml为对照管，在其他含硝酸钾的含药改良罗氏培养基中分别加入1mg/ml的菌悬液0.1ml，37℃培养7天，取空白对照管一支加入0.5ml显色剂，出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。当空白对照管阴性时取1支对照管，加入显色剂，如阳性则向其他含药管各加0.5ml显色剂，阳性结果，表明耐药；阴性结果，表明对药物敏感 如对照管阴性，则继续培养到第10天、第14天并重复以上操作。
类似研究表明NRA法的耐药性检测对RFP、INH、SM、EMB这四种一线药物的检测灵敏度分别为 96.83%，97.22%，94.11%，88.89%；特异度为92.59%，85.0%，87.80%，96.43%；符合率为 93.48%，96.74%，91.30%，93.48%。
对NRA 法总的评价是廉价、快速、操作简便、耗时短，不失为快速检测结核分枝杆菌药敏的方法，但仍需通过改进实验室方法降低假阴性与假阳性，进一步提高准确度。
4. 氧化还原指示剂比色测定
氧化还原指示剂比色测定（colorimetric redox-indicator assay）又称比色法。检测原理：于液体培养基中使用各种不同浓度的抗结核药物和氧化还原指示剂，加入标本后孵育一定时间，以指示剂颜色的改变来判断标本中是否有耐药MTB的存在，若指示剂有还原反应出现，提示MTB生长，该菌株在此药物浓度下对此种药物耐药。常用指示剂有XTT、MTT、刃天青和阿拉马蓝等。此法不需特殊仪器，成本低，回报结果平均10 天，灵敏度为 91%，特异性较弱为71%，如有杂菌污染可出现假阳性。
5. 噬菌体生物扩增法 （1）原理：
噬菌体生物扩增法（phage amplified biologically assay，PhaB）已被用于结核分枝杆菌的快速检测及药敏试验。此方法利用分枝杆菌噬菌体D29对缓慢生长的结核分枝杆菌及快速生长的耻垢分枝杆菌的亲噬性，使用杀毒剂灭活未进入菌体内的噬菌体，让已进入菌体内的噬菌体在其中大量增殖而最终使菌体裂解，则观察到琼脂平板上会出现透明状噬菌斑，由于噬菌斑的数量与待检标本中结核分枝杆菌的含量成正比，故可因此推算出标本中结核分枝杆菌的含量。行药敏实验时在培养基内加入抗结核药物，由于药物对结核分枝杆菌有抑制作用，噬菌体就无法进入菌体，噬菌斑便不能形成，以此判断为敏感；反之若有噬菌斑形成，则判断为耐药菌株。
（2）操作
前处理：将临床标本用NALC-NaOH进行处理，以去除污染，采用15ml PhageTek MB Medi Plus进行冲洗，37℃条件下过夜。（菌液不必去污染，行药敏试验时添加相应药物，S、R孵育24小时，H孵育48小时，使终浓度分别为S1μg/ml、R 2μg/ml、H 0.1μg/ml）。
感染噬菌体：向临床样本中加入噬菌体（Actiphage）100μl，37℃条件下孵育1小时。
清除TB体外游离噬菌体：向临床样本中加入强效病毒剂（Virusol）100μl，充分振荡后静置5分钟。
中和：向临床样本中加5ml Medium plus，静置片刻。
表达：向临床样本中加帮助细胞（Helper cell）1ml，倒入瓶皿中，加入5ml融化的琼胶（50～60℃），旋转混匀，静置，37℃条件下过夜。
结果判定：0～19个菌斑为阴性，提示标本中无活结核分枝杆菌；20个或更多菌斑为阳性，提示标本中有活的结核分枝杆菌。（药敏结果判定：药敏培养基菌斑数小于20或药敏培养基菌斑数/对照培养基菌斑数小于10%，判定为敏感；药敏培养基菌斑数/对照培养基菌斑数大于50%，判定为耐药；10%～50%之间的判定为可疑）。
（3）评价：
目前，国外还用该法测定一线药物的敏感性。据Wilson等报道，该法对INH耐药株的检出率达88.2%，与常规药敏试验符合率超过95%。2005年起，国内已有医院将此纳入新的结核检测项目进行临床应用。何成彦等对116例胸腔积液结核患者胸腔积液标本检测研究中报告其敏感度为79.3%，而肖国琼等对150份标本的检测报告则显示其阳性率仅为63.3%，与季瑞云等报道的63.7%相同，较李洪敏等报道的86.5%阳性率低。其优点是能区分死菌和活菌，耗时短，1～2天便能观察结果。噬菌体的裂解作用能在实验过程中杀死结核分枝杆菌，保护了操作人员，无需特殊仪器，成本低廉，易于在实验室推广。应用噬菌体法检测铜绿假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌这4种呼吸道常见细菌均为阴性。但噬菌体 D29 除了感染缓慢生长的MTB，对另外少数几种快速生长分枝杆菌也能感染，故该法特异性不高；且判定结果还受标本中 MTB含量多少的影响，这两点不足限制了其于痰涂片标本中的直接应用。
四、分子药敏试验
分子生物学技术的发展也促进了对MTB耐药分子水平上的机制研究，许多耐药基因的直接检测已成为现今研究的热点。编码MTBRNA聚合酶亚基的rpoB的突变使酶活性发生了改变，无法和利福平进行结合，故表现对利福平产生耐药。rpoB的突变存在于86%的临床分离MTB耐药株。临床最常选用的抗结核药为异烟肼和利福平，研究显示约有90%的MTB在对利福平耐药的同时也会发生异烟肼耐药，故可通过检测rpoB的突变作为MDR-MTB的筛查。katG和inhA调控区域的突变则与高、低水平异烟肼的耐药机制有密切关系，各国对此报道其突变率为50%～90%之间，提示种族及地区差异的存在。相比之下，MTB对其他药物发生耐药的可能性则低一些，在分子药敏实验上表现并不突出。
多种检测耐药MTB突变基因的分子药物敏感实验依据以上基础理论研究建立，不必进行培养，能对各种标本行直接检测，又称为直接药敏实验。
（一）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析
PCR-RFLP通过检测DNA于限制性内切酶切割后形成的特定DNA片段的大小来进行基因是否有突变的判断。此法的缺陷为仅能视已知突变位点来选择限制性内切酶，故现多应用于katG315及embB306的突变检测。进行PCR-RFLP分析时，样品以高纯度的为佳，样品所需的用量较大，多态性水平与限制性内切酶的种类和数量紧密相关，操作步骤烦琐、工作量大、成本高，限制了其对临床样本的耐药性检测的应用。
（二）DNA测序
此法为检测基因突变的金标准，常用作其他方法的辅助验证实验，对分析数量较大的临床标本不适用。
（三）PCR-单链构象多态性（PCR-singlestr and conformational polymor phism，PCR-SSCP）分析
单链 DNA于低温条件下会呈现出由内部分子相互作用形成的二级结构，单个碱基突变就可引起 DNA于非变性凝胶内的迁移率发生改变。相关的163株耐砒磷酰胺MTB检测报告显示PCR-SSCP的灵敏度与特异度分别为85%、96%。PCR-SSCP只适用于检测基因是否存在突变，不能阐明突变的原因，仍要经过DNA测序来进一步证实。Negi等以PCR-SSCP报道与利福平耐药相关的rpoB突变位点最多发生于第516、526及531位密码子，为设计以检测耐药基因点突变为基础的分子药敏实验研究提供了进一步线索。
（四）线性探针技术（line probe assay，LiPA）
LiPA利用数个寡核苷酸探针对耐药相关的基因进行扩增。Hain Lifescience生产的Genotype M TBDR和Genotype MT BDRplus正是依据此原理建立，其能检测rpoB、katG和inhA的突变，进而预测菌株对利福平和异烟肼耐药的可能性。基因突变存在复杂性，此法需使用多种寡核苷酸探针，操作较复杂，费用昂贵，故限制了其在基层实验室的开展。
（五）DNA芯片技术
此技术自动化操作，同时检测多种MTB耐药基因具备快速性与特异性，不足之处在于费用过高。
（六）评价
分子生物学近年得到了快速发展，对结核病诊断与治疗的认识不断更新，检测手段也随之有了新发展，分子药敏实验的不足在于其往往操作烦琐、对于痰标本涂阴培阳的标本检测灵敏度较低。综上，使分子药敏实验的操作步骤进一步简化，提高其灵敏度和特异度成为该技术的发展方向。和传统MTB药敏实验比较，分子药敏实验不必进行活菌培养，则生物安全性较高，实验快速，汇报结果只需1～2天，对制定合理治疗方案的指导及预防耐药 MTB的流行传染有重要意义。
五、分枝杆菌菌种鉴定
（一）PNB、TCH鉴别培养基初步鉴定 1. 对硝基苯甲酸（PNB）培养基
在L-J培养基中加入用二甲基甲酰胺溶解制备成的50mg/ml的100倍母液PNB，其终浓度为0.5mg/ml。分装、凝固。
2. 噻吩-2-羧酸肼（TCH）培养基
用无菌蒸馏水溶解TCH成0.5mg/ ml母液，按1∶100加入罗氏培养基中制备培养基，TCH于培养基内终浓度为5μg/ml，分装、凝固。
3. 接种
行药敏实验同时各接种PNB、TCH培养基1支，菌液浓度为10 -3mg/ml，每支接种量为0.1ml。
4. 观察结果与记录
观察同药敏记录，结果记录如表3-1。
表3-1 观察结果与记录
（二）培养特性 1. 生长速度
于改良罗氏培养基上接种原始分离株的次级培养物10 -2 mg/ml菌液0.1ml，分别于37℃、45℃、28℃下进行孵育，若1周内有菌落生长则判定为快速生长分枝杆菌，1周后生长的判定为缓慢生长分枝杆菌。
2. 色素产生
在两支改良罗氏培养基上接种分离菌株，用锡纸或黑纸包将其中一支缠住密封遮光，另一支则不遮，随后一同置37℃下进行孵育。发现不遮光的培养基有菌落生长时，则打开遮光的一支进行观察。如有色素产生则为暗产色菌，若无色素可见，则开启试管塞，用100瓦钨灯泡距离50cm行照射2～3小时，持续37℃孵育3天，每天观察1次，如有色素产生则判定为光产色菌。如无论光照或黑暗与否均不产生色素的菌落判定为不产色菌。
（三）生化试验 1. 耐热触酶试验方法
使用在L-J培养基生长3～4周菌落，磨菌比浊制备10mg/ml菌悬液，取0.5ml，加入0.15mol/ml PBS 1.0ml，置68℃下进行水浴20分钟，冷却，慢慢滴加30% H 2O 2和10% 吐温-80液等量混0.5ml。结果判定：阳性为持续有小气泡产生，阴性为10～20分钟仍有气泡产生。空白试剂对照无气泡产生。对照菌株：堪萨斯分枝杆菌为阳性，结核分枝杆菌为阴性。
2. 硝酸盐还原试验
使用在改良罗氏培养基生长3～4周菌落，磨菌比浊制备10mg/ml菌悬液，取0.5ml，加入硝酸盐溶液内，置37℃下进行水浴2小时，取出，每管加2倍稀释的浓HCl液各1滴。随后加入0.2%氨基苯磺胺水溶液与0.1% N-萘乙烯二胺盐酸盐水溶液各2滴。结果判定：阳性为1分钟呈红色者，阴性为无色者。空白试剂对照无色。对照菌株：结核分枝杆菌为强阳性，牛分枝杆菌为阴性。
3. 吐温-80水解试验
使用在改良罗氏培养基生长3～4的菌落，磨菌比浊制备10mg/ml菌悬液，取0.5ml，加入中性红溶液中，置37℃下孵育10天，第3、5、10天观察颜色变化。结果判定：阳性为菌液由琥珀色变为紫红色，阴性为不变色。空白试剂对照不变色。对照菌株：堪萨斯分枝杆菌为阳性，瘰疬分枝杆菌为阴性。
4. 尿素酶试验试剂
使用生长在改良罗氏培养基3～4周的菌落，磨菌比浊制备10mg/ml菌悬液，取0.5ml，加入尿素溶液内，每管加0.1%酚红各1滴，置37℃下进行孵育3天，观察结果。结果判定：阳性为菌液呈现红色，阴性为不变色。空白试剂对照不变色。对照菌株：结核分枝杆菌呈阳性，蟾蜍分枝杆菌呈阴性。
5. 芳香硫磺酯酶试验
使用生长在改良罗氏培养基3～4周的菌落，磨菌比浊制备20～40mg/ml菌悬液，取2支二硫磺酚酞三钾盐溶液，各加0.5ml菌悬液，37℃孵育，3天和10天各取1支，加0.5ml的10.6% Na 2CO 3水溶液，观察颜色的变化。结果判定：阳性为菌液呈现紫红色，阴性为不变色。空白试剂对照不变色。对照菌株：偶然分枝杆菌呈阳性，结核分枝杆菌呈阴性。
6. 铁离子吸收试验
使用生长在改良罗氏培养基3～4周的菌落，磨菌比浊制备1.0mg/ml菌悬液，取0.1ml接种于改良罗氏培养基，将管内冷凝水于接种前吸弃，在培养基底部加入4%枸橼酸铁铵水溶液，在管塞上插针头以便通气，置37℃下进行孵育3周，每周观察一次。结果判定：阳性为菌落呈铁锈色者，阴性为不变色。对照菌株：偶然分枝杆菌呈阳性，龟分枝杆菌呈阴性。
7. 亚碲酸盐还原试验
使用生长在改良罗氏培养基3～4周的菌落，磨菌比浊制备1mg/ml菌悬液，取0.1ml，接种在0.5%苏通琼脂培养基，置37℃下进行孵育7天，加亚碲酸钾液2滴，再孵育3天，观察结果。结果判定：阳性为有黑色或深棕色沉淀物出现，阴性为无沉淀物出现，空白试剂对照无变化。对照菌株：胞内分枝杆菌为阳性，次要分枝杆菌为阴性。
8. 烟酸试验
使用生长在改良罗氏培养基3～4周的菌株1支，另沸水2ml于培养基斜面，振荡5～10次，平放台上静置5～10分钟。取0.8ml上清液。分别放0.4ml入两支小试管内，各加0.1ml的3%联苯胺乙醇溶液，其中一管再加0.1ml的10%溴化氰溶液，观察菌液变化。结果判定：阳性为加10%溴化氰溶液管内的菌液有红色或桃红色沉淀出现，阴性为白色沉淀出现。空白试剂对照不变色。对照菌株：结核分枝杆菌者为阳性，牛分枝杆菌为阴性。说明：阳性结果仅当烟酸含量为2μg以上时才出现，因此菌株菌落要求需大于50个，否则可能产生假阴性；若溴化氰液发生沉淀，于使用前置于室温中，待溶解后再行使用；对INH高度耐药结核分枝杆菌的结果可能出现假阴性；试验完毕后在试管中加等量4% NaOH液，需24小时后才能使溴化氰毒性消除。
（四）鉴别培养基 1. 5% NaCl培养基
将0.1ml的10 -2mg/ml菌悬液接种在5% NaCl培养基上，置37℃孵育，每周观察1次直至第4周，使用改良罗氏培养基作对照。结果判定：阳性为对照管及试管均有菌落生长，阴性为只有对照管生长菌落。快速生长分枝杆菌不产色菌中龟分枝杆菌龟亚种为阴性。
2. 苦味酸培养基
在苦味酸培养基斜面接种0.1ml的1～2mg/ml菌液，37℃孵育2周。结果判定：有菌落生长为快速生长菌，龟分枝杆菌亚种不生长，龟分枝杆菌脓肿亚种可生长，二者依此进行鉴别。
3. 谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基
取0.1ml的1mg/ml菌悬液接种于斜面上，同时接种改良罗氏培养基作对照，37℃孵育3周，进行结果观察。结果判定：胞内分枝杆菌生长，鸟分枝杆菌不生长。
4. 麦康凯琼脂生长试验
在麦康凯琼脂培养基平板上接种被试菌株，不含NaCl，5～11天时观察生长情况，平皿置于铺湿纱布的有盖容器中。结果判定：阳性为菌落生长，并经涂片抗酸染色为抗酸性者，阴性为无菌落生长或非抗酸性菌者。偶然及龟分枝杆菌为阳性，千田、塞内加尔、耻垢等非产色快速生长分枝杆菌为阴性。
（五）结果判断 1. 光产色分枝杆菌鉴定表
表3-2 光产色分枝杆菌鉴定表
2. 暗产色分枝杆菌鉴定表
表3-3 暗产色分枝杆菌鉴定表
3. 不产色分枝杆菌鉴定表
表3-4 不产色分枝杆菌鉴定表
4. 快速生长分枝杆菌鉴定表
表3-5 快速生长分枝杆菌鉴定表
六、结核分枝杆菌L型的检测方法
（一）分枝杆菌L型的生物学特性
分枝杆菌L型（mycobacterial L-forms）是于药物诱导、免疫因子作用过程和其生活周期中，菌体发生细胞壁部分或全部丢失而导致细胞壁出现缺陷的一型（Cell wall-deficient bacteria，CWDB）。研究显示结核患者体内分枝杆菌存在的L型形式与结核病恶化和复发有紧密关系。分枝杆菌L型仅保留了原菌（original formor classical form）的一部分生物学特性和致病性，与原菌相比有较大的差异。细胞壁缺陷使分枝杆菌L型拥有可塑性及滤过性，形态也由典型的抗酸分枝杆状改变为镜检形态下观察到的抗酸或非抗酸的圆球体（coccoid forms）、巨型体（large body）、丝状体（filamentous forms）、原生小体或棒状体等。抗酸染色时可呈现出红色、紫色或淡红色。结核分枝杆菌原菌的细胞壁有2层的结构，内层是较厚的肽聚糖层，外层是分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖。当这两层细胞壁发生一定程度的缺失后，就出现形态多样、染色多变的分枝杆菌L型。在罗氏培养基上分枝杆菌L型表现为不易生长。索状因子（海藻糖-6，6□二分枝菌酸）的存在可能与涂片时常观察到的抗酸颗粒呈串珠状或长丝成团状有关。
青霉素、环丝氨酸或溶菌酶均能对分枝杆菌细胞壁中肽聚糖的合成产生影响。异烟肼则影响菌体壁分枝菌酸的合成。以上因素都有可能诱导分枝杆菌发生变异成为L型菌。分枝杆菌原菌和L型分枝杆菌还能在动物体内或组织细胞内互相发转化。实验报道，经过腹腔内或鼻腔的途径来感染豚鼠，自感染第2周后就可发现L型菌的存在，第8周时其数量最高。原菌型与L型菌落数呈现此消彼长的趋势。随着感染时间的推移，L型的细胞壁破坏愈加严重使得多形性呈现得也随之愈来愈明显。其中的细胞质电子密度发生降低，菌体内部结构不清。在巨噬细胞内多见L型菌。
（二）分枝杆菌L型的致病性
由于L型结核分枝杆菌对药物常不敏感，给其长期在病灶中的潜伏提供了条件，在适宜环境下，L型菌又能返祖，恢复为典型原菌，致病力也得到恢复，成为结核病恶化与复发的根本原因。Dorozhkova等报道，对处于加重和复发期间持续存留空洞的肺结核患者，能持续分离出L型结核分枝杆菌的达到了46.6%，在体外培养的L型回复子（L-form revertants）与复发患者体内分离到的结核分枝杆菌具备相同的生物学特性。研究显示活动性肺结核患者痰样本检出阳性达64.7%，其中86.3%和42.7%能分离出典型杆菌及L型菌。报告证明了L型菌为潜在活性因子，临床医学检查和预防性治疗有理由随之进一步进行加强。有回复倾向的L型，又称不稳定的L型（unstablemycobacterial L forms）已被认为结核病复发的高危因子。
Bobchenok等认为，在对临床样本培养时，同时进行典型菌和L型的培养可有助提高培养阳性率，针对L型结核分枝杆菌的临床检查对明确感染的性质、发展及选择正确有效的治疗策略和疗效评价、预后判定、纠正预防措施都有重要意义。现行结核病常规检测报道阳性率只达到30%左右，另约70%为菌阴病例，肺外结核的阳性结果更低。其中结核分枝杆菌L型阳性率占菌阴肺结核标本中的20.0%～29.4%。故检测L型结核分枝杆菌对结核病诊断具重要意义。
分枝杆菌L型所致的临床病征表现也失去了原菌的典型病变特征，而以间质性炎症或“无反应性结核”为主，病程进展慢性化，预后更差。近年新发现垂直感染、克罗恩病、多种肿瘤等也与分枝杆菌L型有关。在慢性肉芽肿性结节病患者体内标本，应用血培养、组织PCR及原位杂交等方法有助于检测到高比例L型菌或分枝杆菌的DNA，提示二者具密切关系。
（三）分枝杆菌L型的检测方法 1. 涂片染色
由分枝杆菌L型对染料具备比原菌更强的抗染力，操作时需要加强抗酸染色，如IK抗酸染色。抗酸染色：①Ziehl-Neelsen抗酸染色法：染色结果可呈现不同的鲜红、紫红、紫色或淡红色等。L型多成簇，有可能与少量原菌共存。检查时需注意区别L型与非微生物结构（各种染料沉渣等）；如长丝中发现巨型体或圆球体，则能和其他纤维鉴别；②IK（Intensified Kinyoun’s）或改良IK抗酸染色：加苯酚品红液，于湿盒中置室温下12～24小时，或37℃下3小时，随后用细水冲洗。结果观察可见抗酸菌巨型体、圆球体呈现亮红色。切片中抗酸菌L型多聚集成堆并于巨噬细胞胞浆内常见；③FFCT三联染色法（Fite-Faraco-Czaplews-ki-Triple acid-fast stain）：用过碘酸或Oil-xylol覆盖玻片，加热至出现蒸汽保持2分钟；细水进行冲洗；FFCT染液室温染30分钟；0.2% H 2SO 4脱色；用亚甲蓝行复染；④Almenoff染色法：第一液中加入5%碳酸氢钠液0.1ml，染色5分钟；3%盐酸酒糟脱色，用0.05%米塔尼尔黄进行复染1分钟，镜检。若采用荧光染色法，则与一般结核分枝杆菌原菌的荧光染色操作相同。
2. 分枝杆菌L型培养
常规应用高渗培养基进行分离，但对于等渗培养基，生理性等渗L型（physiological isoton-ic L-forms）或细胞膜代偿性增厚的L型也能在其中生长。对利福平依赖的分枝杆菌在不含利福平的培养基上呈现L型生长。标本或培养物分别接种于92-3TBL培养基、0.25mg/ml PNB培养基和2.5μg/ml T 2H培养基各1管，对菌型行初步的判定。
（1）固体培养基培养法：
分枝杆菌L型可呈煎蛋状（L型）、颗粒状（G型）、丝状（F型）、不典型的微小菌落等，与野生株（wildtype）明显不同。以改良TSA-L固体培养基为例，平板上最初以十几个到数十个球状体组成的颗粒状（G型）幼小菌落呈现。随着培养时间的增加，典型的“油煎蛋”状菌落数量逐渐增多。偶见丝状菌落出现。对菌落可行涂片抗酸染色镜检。
（2）液体培养基培养法：
结核分枝杆菌L型在92-3 TB-L等液体培养基中多呈现沉淀生长，取沉淀物涂片镜检就能进行鉴定。
（3）血液中分枝杆菌L型的培养：
①溶血离心培养法：肺结核患者体内病灶的结核分枝杆菌L型能进入血液循环，或侵入其致敏的细胞、红细胞，或免疫黏附在细胞膜上。检测血液中的分枝杆菌或L型菌通过使红细胞裂解并离心富集即可；②VSY培养法：在20ml培养基上接种抗凝血；混匀，36℃进行培养；取生长物10ml移入另一试管，加0.1ml二甲苯，振摇5分钟；垂直静置10分钟；取上层进行涂片。
3. 分枝杆菌L型确认 （1）回复法（返祖试验法）：
次第转种渗透压较低的培养基能使分枝杆菌L型回复为细菌型，则可作菌种鉴定。利福平依赖结核分枝杆菌L型转种至含利福平的培养基进行回复。通过动物返祖法回复也可。对于大部分的稳定株仍需用另法鉴定。
（2）生化反应与菌种直接鉴定：
采用API 20E生化板对15例肺结核血培养物生化反应的研究发现分枝杆菌L型与链球菌属、葡萄球菌属、埃希菌属的L型菌差别较大。耐热触酶试验可以初步鉴别液体培养的沉淀物（涂片镜检10～50个/HP）中的结核与非结核分枝杆菌L型。
（3）多聚酰胺梯度凝胶电泳：
L型结节病血分枝杆菌培养上清液可观察到两条大分子量的蛋白质带，而结核病的同一区带则呈现缺如或染色淡，两者的电泳区带均较铜绿假单胞菌等的L型菌更明显。
（4）电子显微镜：
①扫描电镜：结核分枝杆菌原菌呈现菌体完整光滑的杆状，而L型菌为多形性，有时可现扭曲状；②透射电镜：可看到结核分枝杆菌L型细胞壁的缺失状，菌体内电子密度比较低，可见大小不等出芽；结节病的血源性分枝杆菌L型内观察到的小体大小相对一致，而结核病患者观察不到小体。
（5）免疫学方法上常用的有免疫酶染色及免疫荧光法。免疫荧光法操作：
用甲醇液行固定3分钟；待其干后用0.01M pH7.6 PBS湿润；加0.01M pH7.6 PBS稀释的鼠抗H 37 R v单抗，37℃湿盒孵育持续30分钟；用冷PBS轻洗掉未结合抗体；加入FITC标记的羊抗鼠IgG，置37℃黑湿盒中20分钟；洗掉未结合物，加入甘油/PBS（10ml甘油+1ml pH9.0 PBS）；盖上盖玻片，使用荧光显微镜进行检查。
（6）基因诊断技术鉴定：
Vishnevskaia等报告用PCR鉴定肺外结核的临床非呼吸道标本分离的分枝杆菌L型时有85%（51/60）呈现阳性。对分枝杆菌L型进行分离及应用PCR对其检测能明显提高肺外结核病诊断效率。另一方面，PCR结果可能由于增厚的细胞膜及结核分枝杆菌L型的稳定型DNA不便提取而导致假阴性结果。此外还可应用原位杂交、基因芯片等其他分子生物学方法进行检测。
4. 分枝杆菌L型药物敏感试验
研究报道，诱导的分枝杆菌L型对利福平、乙胺丁醇和异烟肼等药物不敏感，对链霉素、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类、喹诺酮类的敏感性却有明显提高。治疗时应选用L型菌敏感的药物。Michailova等研究发现链霉素及异烟肼耐药突变株在电镜下，大部分以不典型颗粒状的L型形状为主，故可认为细胞壁缺陷的L相为耐药突变株在体内存活的可能原因之一。Mel’nikoava等对27例肺外结核患者活检及外科标本中分离的29L型株结核分枝杆菌研究显示有高达89.7%的rpoB基因突变率存在，分枝杆菌菌群表现不均一性。
（四）存在问题及未来展望
微生物表型的改变总是与遗传性改变同时出现，分枝杆菌L型特别是稳定分枝杆菌L型的规律尚需大量工作来进行证实。临床中可见分枝杆菌L型阳性的患者或存在明显咳血、咳痰、低热等及病程迁延表现，或痰液中多次分枝杆菌L型阳性而临床无症状，或症状表现不典型，尚需进一步探索机制。分枝杆菌L型和结核病恶化、复发的关系，作为流行病学慢性传染源的基础研究不多，耐药分枝杆菌L型如何在人群中传播，其对结防效果有什么影响也需要深入研究。《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会制定的《结核分枝杆菌L型的检测方法（试行）》标准也有待进一步完善。