由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快（约为正向反应的6倍）、敏感度较高，成为目前国内推荐的主要方法。

比色法测CK均需沉淀蛋白质，其中逆向法由于测定的是酶反应产生的肌酐，故必须用中性或偏碱性的蛋白沉淀剂沉淀蛋白。α-萘酚和双乙酰及肌酐产生红色化合物的反应受具有胍基类物质（如精氨酸、胍乙酸、肌酐等）的影响。但除了肾衰竭及某些代谢性疾病外，不会产生较大的干扰。例如肌酸显色法。其原理是磷酸肌酸和二磷酸腺苷（ADP）在肌酸激酶的催化下，生成肌酸和二磷酸腺苷。肌酸与双乙酰（2，3-丁二酮）及α-萘酚结合生成红色化合物，在一定范围内，红色深浅与肌酸量成正比，从而可求得血清中CK活性。Mg ²⁺为激活剂，半胱氨酸供给巯基，氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。

酶耦联法是国际临床化学联合会推荐的参考方法。此法敏感，为避免（有两种工具酶及指示酶参加反应）的失活，常在CK反应系统中加入巯基化合物，同时用AMP和AP3A混合抑制法排除腺苷酸激酶的干扰。其原理是CK催化磷酸肌酸（CrP）与二磷酸腺苷（ADP）反应产生三磷酸腺苷（ATP）与肌酸（Cr）；耦联己糖激酶（HK）及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）的催化反应。HK催化葡萄糖（GLU）与ATP反应，形成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），G-6-PD催化G-6-P氧化，形成6-磷酸葡萄糖内酯（6-PG）及NADPH。在340nm波长下测定NADPH生成速度率而计算CK活性浓度。其反应式如下：

荧光法快速、敏感，巯基化合物不产生干扰，试剂易得，操作条件易于掌握，但需荧光光度计，不适于基层单位使用。其原理是利用逆向反应生成的Cr在强碱性溶液中与茚二酮反应产生荧光复合物，用荧光分光光度计激发波长405nm，发射波长485nm测其荧光强度，与同样处理的Cr标准管比较，求出CK活力。

CK同工酶的测定方法较多，基本上可分为电泳法、离子交换层析法、免疫抑制法和免疫化学法四大类。其中前二类为活性浓度测定，即利用测定CK总活性的各种方法，测定分离后同工酶的活性，或根据在电泳支持物上显示各CK同工酶区带的位置而求出各种同工酶占总CK的比率。但是电泳方法操作简单，故应用最广泛，但敏感性和特异性不够理想。而离子交换层析法程序繁琐，临床应用较少。后一种是质量浓度测定法，能直接测定血清中CKMBmass。CK同工酶亚型（CKMM亚型和CKMB亚型）多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。免疫抑制法简便、快速、特异性强、灵敏度高，是目前测定CKMB酶活力常用的方法。免疫化学法以质量浓度代替了酶活力单位，提高了方法的灵敏度，但目前尚未普及。

CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体，在电泳条件下，CKBB迁移最快，CKMB最慢。电泳后进行酶促反应显色（可用四氯唑盐显色法或荧光），用扫描仪或荧光光度计扫描定量。显色原理是：CK催化磷酸肌酸及ADP，产生肌酸及ATP，在耦联的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P，在耦联的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-PG，同时NADP+还原为NADPH。

当血清通过阴离子交换剂DEAE-seph-adexA50小柱时，酶蛋白阴离子被吸附于阳离子交换剂上。各CK同工酶被吸附的能力不同，用含不同浓度氯化钠的Tris缓冲液分布洗脱到不同管中，然后测定各CK同工酶的活力。

原理：CK由M和B两个亚单位组成三种二聚体，CKBB（CK ₁）、CKMB （CK ₂）、CKMM（CK ₃）主要存在于细胞质中，另外血清中还有少量的线粒体同工酶CKmt （CK ₄）。心肌中CK活力较高（仅次于骨骼肌），其中CKMB占15%～25%（骨骼肌中低于5%）。

血清中CKMB在不连续电泳系统中，进行琼脂糖凝胶电泳，分离出CKMB ₁和CKMB ₂两种亚型，经荧光扫描，并测定各亚型带上NADPH生成量，求出各部分酶活性及其相对含量。

CK：AMI发病后血清CK活性在3～4小时开始升高，24～40小时上升至峰值，高峰可为参考值上限5～25倍，68～84小时恢复正常。动态测定血清CK活性对AMI诊断的敏感性90%～100%。

CK-MB：CK-MB主要分布于心肌中，约占心肌细胞内CK的40%，在心肌内CK-MB含量为1.4mg/g湿重组织。分子量为87kD，最适pH7.0。CK-MB活性在血中半衰期约为8～10小时。CK-MB活性可进一步分成四种亚型，从阳极到阴极的排列次序为CK-MB ₀、CK-MB ₁、CKMB ₂、CK-MB ₃，其等电点（Pl）分别为5.0、5.1、5.2、5.4。CK-MB ₁为血清型，CK-MB ₂为组织型。CK-MB ₁是CK-MB ₂在羧基末端水解出一个赖氨酸残基的产物，故CK-MB ₁与CK-MB ₂只相差1个氨基酸残基。心肌内主要含CK-MB ₂，在血液中CK-MB ₂和CK-MB ₁含量相近，其比值等于1。CK-MB活性在2～4小时开始升高，18～26小时上升至峰值，72～96小时恢复正常时间。AMI发病后CK-MB亚型中MB ₂、MB ₂/MB ₁比值2-4小时升高，12小时内升至峰值，24小时后恢复正常；MB ₂/MB ₁比值在AMI发病后2小时升高，4-6小时其比值为3.1；MB ₁在血中转变为MB ₂和MB ₁，其半衰期短，AMI发病14小时即恢复正常。

CK-MM：CK-MM主要存在于骨骼肌中，分子量约为85kD，最适pH6.9，在血中半衰期约为16～20小时，正常人血中CK主要来自CK-MM。CK-MM有三种亚型，分别称MM ₁、MM ₂、MM ₃，心肌和骨骼肌中以MM ₃为主。在血液循环中最初为MM ₃，在羧基肽酶B或羧基肽酶N（羧基肽酶B：EC3.4.17.2；羧基肽酶N：EC3.4.17.3）的作用下，MM ₃的一个M肽链的羧基末端的1个赖氨酸残基被水解下来，MM ₃即转变成MM ₂；在羧基肽酶的持续作用下，另一条M肽链的羧基端的赖氨酸残基又被水解下来，使MM ₂进一步变成MM ₁。由于MM ₁碱性最强，故在电泳时向阳性泳动最快。在正常情况下由MM ₃转换为其他亚型的速度明显快于清除的速度，所以，正常人血中MM亚型主要是MM ₁，MM ₂次之，MM ₃含量最少。CK-MM亚型在AMI时迅速地释放入血，引起百分率和比值明显增大，其中MM ₃首先升高，继而MM ₂、MM ₁升高。MM ₁在24小时升至峰值，MM ₂在l-4小时出现异常值，16-24小时升至峰值；由于MM ₂释放入血后即转化为其他亚型，并从血中迅速清除，因此MM ₃在2～3小时升高，16小时上升至峰值，24小时内恢复正常。MM ₂在AMI发病15～24小时明显升高此时MM ₃已下降，而MM ₁尚未升高，故血中亚型主要是MM ₂。MM ₃/MM ₁比值在30min内即可出现异常值，12小时上升至峰值。

CK-BB：CK-BB主要存在于脑、前列腺、肠、肺等，分子量约为88kD，最适pH7.1，在血液中极不稳定，半衰期约为1～5小时。正常人血中CK-BB含量很低，其中应用放射免疫法测定CK-BB在健康成人血清中平均含量约为3.4μg/L，而一般常规方法难以测出。在胎儿期间血清CK-BB活性较高，其原因可能与转化、灭活及排出等因素有关。CK-BB活性在AMI发病后2小时升高，7～20小时升至峰值，其高峰为正常值上限3～100倍，达峰值后迅速地下降。