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二、临床检测方法及参考值
(一)检测方法及其研究
cTnI的测定始于20世纪80年代中期,最早使用多克隆抗体检测的放射免疫法,随后相继出现了运用单克隆抗体检测的各种不同的酶免疫法。若实验中所用的抗体为多克隆抗体,会交叉反应,且灵敏性差。单克隆双抗体夹心放免法和双抗体夹心ELISA法使测定灵敏度大大提高,测定低限为0.1~0.2μg/L,目前cTnI测定多采用化学发光法,该法提高了测定的精确度和敏感性。
1.cTnI的夹心免疫放射法
该法测定的原理是应用识别抗原不同位点的两个单克隆抗体(mcAb)作双抗体夹心法测定,首先将一个mcAb于固相载体联结形成固相mcAb复合物,同时加入待测标本和酶标mcAb,形成双抗体夹心,再加入荧光底物显色。运用较多的有Stratus法,该法是一种先进的自动双位点荧光酶免疫定量检测法,特异性高,灵敏度为0.35μg/L,检测时间为10分钟。
2.cTnI的夹心酶联免疫法
该法是以包被固相载体的特异性抗体为第一抗体,加入待测血清后,再加入生物素标记的第二抗体,形成双夹心,孵育后冲洗分离,加入发光基质底物,测得的光强度与标准曲线相比可得cTnI的浓度值。目前运用较多的有全自动磁微粒子化学发光酶联免疫分析仪定量测定cTnI,样品中的cTnI与包被于磁微粒子上的鼠抗人cTnI特异性McAb结合,再加入标记碱性磷酸酶的鼠抗人cTnI第二抗体,孵育后在磁场中冲洗分离,加入发光基质底物AMPPD,测发光强度,光强度与cTnI含量成正比,其灵敏度为0.1μg/L。
国外报道的cTnI测定中,较先进的有利用生物学技术中的杂交瘤技术制备抗cTnI单克隆抗体特异性细胞株,其准确度达100%。国内还没有该技术,国外尚处于试用阶段。
3.cTnI的固相免疫层析法
该法是一种定性检测cTnI的方法,实验装置中包括一个包被了cTnI抗体的膜体,膜条为包含一个显示窗以及一个加样孔,显示窗上半部为对照区,下半部为试验区,若显示窗内有两条明显的粉红色-紫色线条说明有存在,检测时间15分钟。
cTnT和cTnI对急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)的诊断都有敏感性高,特异性强,持续时间长等优点。但是许多临床研究发现,在升高倍数和持续时间上cTnT优于cTnI,因为cTnT在正常人血中含量很低,在心肌细胞中含量高,如果少量释放,血清中的cTnT含量可数倍甚至数十倍升高,AMI时可增加30~200倍,而cTnI为10~20倍,cTnT在血液和淋巴液中消除速率慢,AMI时可升高达2~3周,cTnT较cTnI持续时间长,但是cTnT与骨骼肌会发生交叉反应,严重骨骼肌受损的患者cTnT可出现假阳性反应,并且肾功能衰竭和多发性肌炎的患者cTnT也会升高,但cTnI与骨骼肌无交叉反应,故在诊断特异性上cTnI优于cTnT。
(二)肌钙蛋白的参考值
ESC/ACC和ACC/AHA的文件都将cTn增高作为诊断心肌损伤的最主要条件,这使得确定健康人群cTn参考范围的第99百分位值显得十分重要。按照AMI重新定义的文件,各生产厂商应该提供根据多个实验室联合研究的结果所确定的各自方法(测定条件)的cTn参考范围上限(第99百分位值)。国内外的这些重要文件还强调检验部门应在各自的检测条件下对cTn检测结果进行分析,根据ROC曲线确立适当的临界值。有关cTn的参考范围上限值和根据ROC曲线确立临界值的研究国内很少见于报道。
目前FDA批准的cTn检测试剂生产厂商至少有8家,这些厂家生产的试剂测定cTn结果间存在很大的差异,最大的可相差30倍,这对临床工作的开展带来很大的不便,所以寻找一种标准化方法已非常必要,cTn测定的标准化问题主要包括:建立优化和标准的方法,开发和评估参考品以及最后测出合适的参考范围和判断值。
目前Missov等正在应用新一代高灵敏度测定cTn的免疫学方法,其检出限为0.003μg/L,大约小于现在同一公司的免疫分析系统的商品方法的几十倍。他们研究发现,对充血性心衰的患者和正常人比较,cTn有实质性改变,但这些改变值用普通方法检测不出,从上述例子看出,提高cTn检测的灵敏度对于严重心脏病的发病的病理生理机制研究很有拓展领域。