碳酸酐酶的主要催化功能是催化CO ₂的水合反应。

催化反应表示如下：

反应1表示与锌连接的OH ^-和CO ₂反应产生了以氢键和锌连接重碳酸盐，随后水分子代替了重碳酸根与锌相连，释放了重碳酸根离子。碳酸酐酶中的His ⁶⁴易化了质子释放反应（反应2），这一反应是高活性碳酸酐酶如CAII的限速反应。CAII的Zn原子处于酶结构中一个1.5μm的深凹中，酶的His ⁹⁴，His ⁹⁶，His ¹¹⁹及催化中心亲核基团—OH ^-与Zn原子结合，形成一个多面体。活性中心还有几个重要的极性残基：Thr ¹⁹⁹从与Zn结合的氢氧化物得到一个氢键，提供给Glu ¹⁰⁶；His ⁶⁴将与Zn结合的水转化为与Zn结合的氢氧化物，称为质子梭。铜和汞等重金属能抑制CAII的水合反应，可能是因为它们作用于His ⁶⁴，抑制了碳酸酐酶与Zn的结合。

当用硝基苯基测定时，CAIII具有磷酸酯酶活性。在哺乳动物中，CAIII可“谷胱甘肽化（glutathiolation）”，即谷胱甘肽和两个半胱氨酸通过二硫键连接形成二硫化物，该过程可逆。Cys ¹⁸⁶参与该过程时，CAIII具有磷酸酯酶活性；Cys ¹⁸¹参与该过程时，CAIII失去磷酸酯酶活性。谷胱甘肽化过程可激活CAIII的磷酸酯酶活性。在氧化应激时谷胱甘肽化增强，CAIII磷酸酯酶活性提高，在细胞信号转导方面发挥作用。

催化功能上，CAIII、Ⅵ较弱，CAⅡ、Ⅳ较强，它们在催化过程中对pH的依赖性也不同如CAⅠ、Ⅱ只在pH7～8范围内催化反应的解离常数与pH无关；而CAIII在5.0～8.5范围内都与pH无关。

CA的主要抑制剂为磺胺类（sulfonamides），其有效基团为解离的R-SO-NH2。表面活性剂如DDT抑制CA的作用可能与使基团解离易化有关。不同的CA对磺胺类抑制剂敏感性不同，研究CA198位变异种与抑制剂的结合力发现，198Ⅱ位残基侧链的电荷、疏水性和药物亲和力有关。CA198III位上的苯丙氨酸侧链上的苯基填塞了疏水“袋”，造成低催化、低敏感性。此外，表面活性剂可抑制CA在高浓度下生成聚合体，因而减少聚合体对CA复性蛋白形成的竞争性抑制，促进了蛋白再折叠的启动阶段，最终扩大了CA的活性浓度范围。

近年用CA抑制剂对乳头肌收缩功能的研究表明：酶的抑制可导致乳头肌收缩机械力的下降，甚至引起细胞内酸中毒，对此的解释是CAⅣ与心肌中CO ₂的易化扩散有关，如果CAⅣ受抑制，依赖于酶活性的Na ⁺、 转运伴随的泌H ⁺过程也会受到抑制，进而引起细胞酸中毒，H ⁺/Ca ²⁺交换减少，严重影响乳头肌收缩。与骨骼肌相比，心肌中CA的含量很低。骨骼肌中CA的功能类似心肌，但肌浆网上CAⅢ的作用比心肌中肌浆网CA大得多。CAⅢ的变化与急性心肌梗死有关，肌红蛋白与CA的比值可作为急性心梗心肌坏死的敏感而早期的表征。Dahl等于1995年发现CA抑制剂如乙酰唑胺（醋唑磺胺，acetazolamide，diamox）可使血管舒张，可能是堆积直接作用的结果。因此CA可用于急性心肌梗死（AMI）的鉴别诊断，达到快速确诊的目的。

胸痛发生时，可测定CA和存在于心肌和骨骼肌肌红蛋白（muscle hemoglobin，MB）：AMI 时CA正常，MB增高，而骨骼肌疾患的患者CA和MB都显著增高。故应用此二值可鉴别AMI和骨骼肌疾患。

肌红蛋白MB是一种存在于心肌和骨骼肌的低相对分子质量血红素蛋白，常于胸痛发作后2～4小时开始升高，在6～9小时达到峰值，故敏感性较高。但目前检测到的肌红蛋白不能区分源于骨骼肌或心肌，所以MB的心肌特异性较差。

新的MB测定策略有望弥补这一缺陷，同时测定一种骨骼肌特有的标志物，如CAⅢ可鉴别心肌和骨骼肌损伤。当骨骼肌受损伤时MB-CAⅢ的比率恒定，而当急性心肌梗死（AMT）时，这种比率就会增加。

Jubani试验探讨血清MB-CAⅢ作为一种生化指标在AMT早期诊断中的应用价值，并将MB-CAⅢ和常规用于AMI诊断的其他血清生化指标（如CK，CKMB等）加以比较。试验结果：AMI组住院期间CK总活性，CKMB同工酶和Mb浓度的血清峰值显著高于非AMI组，各组CAⅢ的平均浓度大致相同。

John R. Beuerle等人选取了正常运动组（n=12）、创伤组（n=18）和心肌梗死组（n=10）三组作为研究对象，分别检测肌红蛋白、碳酸酐酶III和两者的比率在三组中的差异，结果发现在运动组和创伤组中Mb/CAIII中值分别为3.505和2.890，而心肌梗死组两者比率中值显著增高，达到35.395（p<0.001），结果证实肌红蛋白和碳酸酐酶III在运动时会按照一个相对固定的比率释放，而在心梗患者中，该比值显著增加，创伤患者之间无明显差异。该研究发现细胞损伤时，两者按照3∶1的比率释放，在运动或者神经系统病变中，两者均增加，但是增加幅度与速率均不同，MI患者中肌红蛋白显著增高，而CAIII则没有很大改变。这项研究为生理和病理状态下Mb和CAIII的释放比率提供了依据，同时检测了创伤患者两者的释放关系。

Mb-CAⅢ在AMI的早期诊断上比CK或CKMB敏感。骨骼肌或心肌损伤时，MB均很快升高，而Mb-CAⅢ存在于骨骼肌中，因此Mb-CAⅢ在骨骼肌损伤时相当稳定，而心肌损伤时显著升高，Mb-CAⅢ测定优于单独测定Mb。应用Mb-CAⅢ作为AMI的早期诊断指标。