随着蛋白质组学技术的不断发展和完善，及其在生命科学研究领域中的不断推广，近年来在口腔医学研究中越来越多的研究者开始注重这一新的技术手段和方法，并取得了一些可喜的结果。

目前蛋白质组学在口腔医学领域的研究主要集中在肿瘤和黏膜病方面。在口腔颌面头颈部肿瘤研究领域，为研究肿瘤的发生发展机制，有学者对口腔黏膜白斑与癌变组织进行差异蛋白质组学分析；为研究肿瘤转移机制，对舌癌原发灶与转移淋巴结进行差异双向凝胶电泳分析。在口腔黏膜疾病研究领域，对正常黏膜和癌前病变的黏膜进行差异蛋白质组学研究。此外，也有学者对不同生理和病理状态下的人唾液进行蛋白质组学研究。由此可以看出蛋白质组学作为一个崭新的研究领域，在口腔医学研究中有着巨大的潜力和前景。

本节内容以笔者的研究为基础，向读者介绍双向凝胶电泳的基本步骤和操作，希望有所帮助。目的是探索应用血清蛋白质组学技术分离和鉴定头颈部肿瘤标志物，寻找舌癌早期诊断、病程监测以及预后判断的血清学指标，并建立血清蛋白质组学技术平台。首先通过裸鼠皮下多点接种人舌癌细胞（Tca8113），建立移植瘤动物模型，在成瘤后收集血清，对照组为正常裸鼠血清。以下是研究内容和步骤:

白蛋白去除试剂盒（Bio-Rad公司）。该试剂盒利用亲和树脂特异性地去除血清中的白蛋白，提高双向电泳的分辨率。

将样品裂解液加入制备好的血清样品中，低温（4℃）高速离心15 000g× 30min，弃沉淀，取上清，-80℃保存或立即水化上样。

采用胶内加样法，胶条（17cm，pH4～7）上样体积为350μl。胶条上覆盖矿物油2～3ml，防止胶条水化过程中液体的蒸发。水化盘置于PROTEAN IEF电泳仪中，被动水化，20℃过夜（＞11小时），以确保蛋白质分子的充分吸收。

将胶条置于相应的聚焦槽中，胶面朝下，正负极对应，2～3ml矿物油充分覆盖胶条，轻轻抖动聚焦槽，排出气泡。将聚焦盘置于PROTEAN IEF电泳仪中，进行等电聚焦。程序设置如表7-2:

配制胶条平衡缓冲液Ⅰ和胶条平衡缓冲液Ⅱ。

将胶条转移至水化盘中，胶面向上，加入平衡缓冲液Ⅰ6ml，在水平摇床上摇晃15分钟，以还原蛋白巯基。

滤纸吸除平衡液Ⅰ，再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ6ml，在水平摇床上摇晃15分钟，以使巯基烷基化。聚焦结束的胶条，应立即进行平衡和第二向SDS-PAGE电泳。

配制12%聚丙烯酰胺凝胶两块，室温静置过夜，使聚丙烯酰胺凝胶充分聚合。将平衡好的IPG胶条移至SDS-PAGE凝胶顶端，并封以熔融的低熔点琼脂糖溶液。将凝胶架转移至电泳槽中。接通冷凝循环水系统。起始电流为10mA/ gel，待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，加大电流至30mA/gel，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。撬开玻璃板，取出凝胶，切角作记号。

去离子水冲洗凝胶2次，每块胶加入胶体考马斯亮蓝染液300ml，摇床上摇晃，染色过夜。使用GS-800Calibrated Densitometer校准型光密度扫描仪和PHOTOSHOP 7.0软件以及PDQUEST 2DAnalysis（Version 7.1）软件对凝胶进行扫描成像，并存储于电脑中（图7-1）。

利用PDQUEST软件，过滤去除图像的背景和条纹，斑点经过Gaussian拟合，产生合成的Gaussian图像，使蛋白斑点比较清晰，易于比较（图7-2）。

进行胶上斑点自动检测。选择对照组为Master胶，然后选择一个最弱点和一个最大点进行斑点检测。实验组检测到154个蛋白点，对照组检测到149个蛋白点，匹配121个蛋白点，匹配率为78%。通过Normalize窗口，验证和校正实验中的上样浓度的差异。结果显示所有检测出的蛋白点的浓度总和以及凝胶的总强度（包括背景等的浓度）相差无几，说明两组血清上样量基本一致，实验结果可信（图7-3，图7-4）。

通过PDQuest软件分析，共找到16个差异表达的蛋白点，在胶上切取这些蛋白点进行质谱鉴定。共得到5个蛋白质的肽质量指纹图谱。获得的混合物肽片段质量数据通过Mascot搜索引擎（http://www.matrixscience.com）进行检索。肽片段质量范围为900～4000Da，检索的参数为:设定三种可能的修饰:carbamidomethyl（C），Oxidation（M）和Pyroglu（N-term E）；最大允许肽质量误差为0.1Da，每个肽允许有1个不完全裂解位点，蛋白质的等电点（pI）和分子量（MW）作为参考。差异蛋白点在胶上的位置以及质谱结果见图7-5～图7-10。

经过质谱鉴定和数据库搜索，5个差异点分别为:a点为鳞状细胞癌抗原-1，相对分子质量为44 534Da，等电点为6.54，检索得分为79分。b点为鼠抗人fas抗体的fab片段，相对分子质量为24 168Da，等电点为4.98，检索得分为75分。e点为视网膜母细胞瘤结合蛋白6，相对分子质量为14 036Da，等电点为4.65，检索得分为65分。其中c点和d点的分子量以及等电点均一致，分别为26 029Da和4.75，考虑为同一个蛋白的两个降解片段。具体结果见表7-3。

在鉴定出的4个蛋白质中，鳞状细胞癌抗原-1检索得分最高，为79分。而且在PDQuest软件定量分析中，其变化最大（图7-11）。此外，通过检索相关文献，鳞状细胞癌抗原-1与舌癌的关系最为密切，因此，鳞状细胞癌抗原-1成为本实验的下一步研究重点。