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三、 淋巴管酶组织化学技术的发展
5′-Nase-ALPase双重染色的切片，用光镜观察和照相获得结果后，切片可揭去盖玻片，迅速乙醇脱水，丁醇冷冻干燥，碳喷涂等处理后，再用扫描电镜观察；也可将切片中选择的部位进行定位保留、修掉其他部位，2%锇酸后固定，乙醇脱水，树脂包埋后制成超薄切片，用醋酸铀和枸橼酸铅进行电子染色，透射电子显微镜下观察，可见5′-Nase阳性着色的淋巴管壁上有高密度的反应颗粒沉积在淋巴管内皮细胞表面和基底面，这进一步证实了光镜下观察的淋巴管（图3-22）。
为了获得比一般扫描电镜更加清晰的观察结果，Kato（1990）在同一染色切片光镜观察的基础上，采用了背散射电子成像（Backscattered electron image，BEI）和二次电子成像（Secondary electron image，SEI）扫描电镜观察技术，显示了位于淋巴管壁的5′-Nase反应产物的高亮度像及淋巴管、血管的一定三维结构。国内学者张壁（2004）用此方法对牙髓淋巴管网进行了观察。
图3-22 大鼠胃壁肌层淋巴管和血管（透射电镜照片× 21 000，引自Kato，1990）
LV示5′-Nase阳性淋巴管，BV示血管，箭头示阳性反应颗粒，右上方为其局部放大
Kato（1995）针对酶活性的局限性和器官的特异性，总结和比较了淋巴管和血管5′-核苷酸酶、二肽氨基肽酶（Dipeptidyl aminopeptidase Ⅳ，DAPase）和碱性磷酸酶活性，并在1996年的报道中应用了酶组织化学的三重染色（5′-Nase-DAPase-ALPase），对淋巴管、静脉和动脉端毛细血管进行了区分和探讨，发展了5′-Nase-ALPase双重染色来区分淋巴管和血管的方法，为进一步区分淋巴管和微血管、研究脉管的结构和功能提供了新手段。